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Full text of "Traité des méthodes techniques de l'anatomie microscopique"

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TRAITE 

DES MÉTHODES TECHNIQUES 

DE 

L'ANATOMIE MICROSCOPIQUE 



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TRAITE 

DES MÉTHODES TECHNIQUES 

■m 

L'ANATOMIE MICROSCOPIQUE 

HISTOLOGIE, EMBRYOLOGIE ET ZOOLOGIE 

4 
t 

Arthur BOLLES LEE et L. Fklix HENNEGUY 

AVEC UNE PRÉFACE 

DE M. RANVIER 

.Membre de l'InsULut 
Professe tir au Collège de France 



Denxième édition entièrement refondue 

ET COSSmÉRABLESIEST AUGMENTÉE 



PAIUS 

OCTAVE DOIN, ÉDITEUR 

8, PLACE DE L'OllÉON, 8 

1896 

Tous droits réservés. 



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1 



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t 



PREFACE DE M. RANVIER 



Les auteurs de ce livre m'ont demandé de les présenter 
au public • Ils sont trop modestes, car ils sont parfaitement 
eonnus de tous ceux qui s'occupent de sciences biologiques. 

Us diront comment ils ont fait leur ouvrage, comment ils 
ont été conduits à collaborer. J*ajonterai que celte collabo- 
ration a été heureuse et que l'œuvre qui en est sortie 
rendra de grands services. 

La technique histologique, depuis quelques années, a 
fait de notables progrès et a beaucoup étendu son domaine. 
Les zoologistes et les embryologistes lui ont emprunté ses 
méthodes et les ont modifiées quelquefois pour les mettre 
en rapport avec la nature de leurs recherches. Leur but, 
en effet, est un peu différent de celui que poursuivent les 
hïstologistes ; ils sont intéressés moins par la structure des 
tissus qui composent les animaux complètement formés ou 
en voie de développement que par la disposition et la signi- 
fication morphologique de leurs organes. Or, les embryons, 
et souvent les plus intéressants parmi les animaux sans 
Tertèbres, sont trop petits, trop délicats, trop mous ou trop 



.". 



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1 



VI PnÉFAGE 

friables pour que Ton puisse les anatomiser utilement par 
la simple dissection. Il a fallu, par des procédés ingénieux 
et â Taide d'instruments perfectionnés, faire violence à la 
nature pour lui arracher ses secrets. Les biologistes, à 
l'exemple de Prométhée, le sublime voleur, doivent pénétrer 
dans le sanctuaire pour y dérober le feu sacré. Ils peuvent 
y aller sans crainte : Jupiter n'est plus là pour les clouer 
sur le rocher, et MM. Bolles Lee et Henneguy leur servi- 
ront de guides, 

L, Ranvïer, 
• • 

Paris, le 21 noven»bre 1886. 



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AVANT-PROPOS DE M. A. BOLLES LEE 



Cette deuxième édition diffère considérablement de la pré- 
cédente- La distribution générale de Touvrage reste bien à peu 
près ce qu'elle était; mais le détail a subi des modifications 
importantes, parmi lesquelles nous pouvons signaler les sui^ 
vantes : 

Préoccupé du désir d'être un guide pour Tétudiant à travers 
le dédale toujours embrouillé de notre sujet, j'ai laissé beaucoup 
plus que jadis se manifester la note personnelle* Un plus grand 
nombre de méthodes vieillies ont été supprimées ; et parmi celles 
qui ont été conservées j'ai cru utile d'indiquer le plus souvent 
celles qui d'après mon expérience me paraissent les meil- 
leures. L'introduction générale de Touvrage a été refondue 
et augmentée, et j'ai ajouté aux chapitres spéciaux de nombreux 
paragraphes d'introduction. Ces paragraphes donnent des expli- 
cations détaillées sur la marche à suivre dans les divers genres 
de recherches, et expliquent en même temps les principes sur 
lesquels sont fondées les diverses méthodes de la technique 
moderne. 

J'ai écrit un chapitre nouveau de généralités sur les Teintures. 
J'ai insisté sur l'importance des nouveaux colorants à Tacide 
carminique et à Thématéine de Paul Mayër^ et j'ai expliqué en 
détail la théorie des teintures histologiques faites au moyen 



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VIU AVANT-PROPOS 

de ces deux corps colorants. Les trois chapitres qui traitent 
de ces matières ont été soumis à la critique du savant dis- 
tingué que je viens de nommer, lequel s'est fait, comme on le 
sait, une spécialité de ce sujet. Cette critique s'est étendue jus- 
qu'aux détails les plus minutieux. Nous avons la plus grande 
obligation à M. le D' Mayer de la façon généreuse dont il a mis 
à notre disposition son savoir et sa peine, et nous tenons à lui 
en exprimer ici, M. Henneguy et moi, toute notre reconnais- 
sance. Ce précieux concours nous permet d'affirmer que cette 
partie si importante de notre sujet a été traitée d*une manière 
conforme à la science la plus récente. 

Les paragraphes traitant des colorations régressives par les 
couleurs dérivées de la houille (161 à 166) sont entièrement 
nouveaux, de même que la plus grande partie du chapitre con- 
sacré à la Safranine et aux autres colorants nucléaires de ce 
groupe. On trouvera également beaucoup de nouveautés dans 
le chapitre des Colorations combinées, parmi lesquelles des 
colorations plasmatiques récentes qui sont très importantes. 
J'ai donné avec soin les procédés les plus récents de coloration 
par mordançage. Près d'un chapitre entier a été consacré au 
bleu de méthylène. Le chapitre des Méthodes cytologiques a 
été refondu. Les méthodes récentes pour Télude du système 
nerveux, tant central que périphérique, ont reçu tout le déve- 
loppement que demande ce sujet si important : elles occupent 
maintenant à elles seules plus de 40 pages de la deuxième 
partie, sans parler des méthodes d'imprégnation qui ont été 
exposées dans la première partie. On y trouvera exposées avec 
toutes leurs variantes les méthodes classiques de Weigert et de 

GOLGI. 

Le travail entier de la préparation du texte de cette nou- 
velle édition a été fait par moi seul. Je n'ai pas pu me 
concerter avec M. Henneguy sur les modifications à y apporter. 
Je suis donc seul responsable de toutes les modifications et de 
toutes les additions (à l'exception des contributions de Hen- 
neguy, mentionnées dans le texte, au chapitre des Méthodes 



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AVANT-PROPOS IX 

embryologiques et à celui des Méthodes cytologiques). Les 
épreuves ont été lues par chacun de nous. Nous avons cons- 
taté à cette lecture qu'il n'y avait point de dissidences impor- 
tantes dans notre manière devoir. Cependant, pour sauvegarder 
nos responsabilités respectives, j'ai fait la rédaction au singu- 
lier toutes les fois qu'il s'agissait d'une recommandation ou 
d^une opinion sur laquelle nous aurions pu ne pas être tout à 
fait du même avis. 

Arthur Bolles Lee. 



Nyon, Suisse, le 30 décembre 189b. 



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AYANT-PROPOS BE LA PREMIERE EDITION 



L'année dernière, M, Arthur BoUes Lee publiall en Angle- 
terre un exceUent livre ayant pour litre : The Mitralomisfs 
Vade-Mecum\ renfermant la plupart des méthodes tech- 
niques employées en analomie microscopique et principale- 
ment les méthodes modernes en usage à la station zoologique 
de Naples et dans les laboratoires d'Allemagne et d'Angleterre. 
Heureux de trouver réunis dans ce petit volume, et intellîgem- 
ment groupés, les renseignements que j'avais été obligé do 
chercher laborieusement dans les nombreux mémoires où ils 
se trouvent disséminés^ je pensai qu'il serait utile de faire 
profiter les histologistes français du travail consciencieux de 
M. UoUes Lee, et je proposai à lauteur de faire traduire son 
ouvrage, 

La réponse de M. Bolles Lee fut des plus aimables. Non seu- 
lement il consentait à laisser publier une édition française de 
son Vade-Mecum, mais encore il voulait bien en faire lui-même 
la traduction, en modifiant plusieurs parties de Fouvrage, et 
me demandait de me charger de la rédaction de quelques cha- 
pitres trop peu dév^eloppés dans l'édition anglaise, chapitres 
que mes études spéciales me permettaient de traiter avec une 

Anftiomf/t l)y AuTULii BaLLES Lek. London, J. txnd a. ChiircliîHï IHïfD, 



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Xn AVANT- PROPOS 

certaine expérience. Dans de semblables condiUons^ ma tâche 
devenait aussi facile qu'agréable. 

Le présent volume n'est dnnc pas une simple traduction du 
Mîcrolomisfs Vade-Mecum, L'ouvrage a été mis au courant 
des acquisitions les plus récentes de la technique micros- 
copique. Certaines méthodes surannées et plusieurs formules 
de réactifs infidèles ont été supprimées- Il en a été de même 
du chapitre relatif à la bactériologie, qui, pour être complet, 
aurait comporté un développement hors de proportions avec 
celui des autres parties. Cette suppression était du reste tout 
indiquée, Tétude des Microbes étant du domaine de Tanatomie 
pathologique, et ses méthodes se trouvant maintenant expo- 
sées dans des traités spéciauK. Plusieurs chapitres ont été au 
contraire entièrement remaniés et très étendus, tels que ceux 
relatifs à Tembryologie, à la cytologie, aux centres ner- 
veuxj etc. 

Notre traité n'est pas destiné aux débutants qui n'ont jamais 
manié le microscope ; il ne renferme pas, en effet, la des- 
cription des instruments ni la manière de s'en servir, descrip- 
tion qui tient une large place, trop large peut-être, dans la 
plupart des traités de micrographie publiés jusqu'à ce jour. Il 
s'adresse aux travailleurs, à tous ceux qui font des préparations 
microscopiques, soit pour Tétude, soit pour des recherches 
originales. Sa place est sur la table de travail, comme celle 
du Formulaire de thérapeutique est sur le bureau ou dans la 
poche du praticien* Il renferme à la fois la grammaire et le 
dictionnaire de la technique microscopique. Des tables très 
détaillées permettent de trouver facilement et rapidement le 
renseignement cherché. 

La première partie comprend les méthodes générales de l'ana- 
tomie microscopique applicables aux tissus animaux : fixation, 
durcissement, coloration, inclusions, coupes, injections, macé- 
rations, etc. A chacune de ces opérations correspondent les 
réactifs employés, leur action, leur formule et leur mode de 
préparation. J'ajouterai que toutes les citations ont été prises^ 



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AVAKT- PROPOS XIII 

autant que possible, aux sources mêmes ; que celles-ci sont 
indiquées avec le plus grand soin, a(in que le lecteur puisse, 
en cas de besoin, recourir au texte original; que beaucoup des 
méthodes que nous donnons ont été en outre vérifiées expéri- 
mentalement par nous mêmes, et qu'enfin plusieurs sont nou- 
velles ou encore inédites. 

La seconde partie est consacrée à l'exposé de quelques 
méthodes spéciales, embryologiques et histologiques, pouvant 
servir de guides pour les recherches à entreprendre aussi bien 
sur les Invertébrés que sur les Vertébrés, Nous avons insisté 
surtout sur les méthodes nouvelles, renvoyant le lecteur, pour 
tout ce qui est classique, au remarquable Trailé de notre émi- 
nent maître RL le professeur IlANviEn. 

Je tiens à remercier M. RoHes Lee de l'honneur qu'il m'a 
fait de vouloir bien me considérer comme son collaborateur, 
quoique mon rÔle se soit borné, en somme, à la rédaction des 
méthodes relatives à l'embryologie, à la cytologie et aux Proto- 
zoaires, et à la revision de la traduction faite par Tauteur. 
Cette faible part de collaboration me permet de dire que 
M. Uolles Lee aura rendu un grand service aux histologisles 
en codifiant, pour ainsi dire, la technique moderne. 



Paris, le 26 novembre 18Sâ. 



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TRAITE DES METHODES TECHNIQUES 

L'ANATOMIE MICROSCOPIQUE 



PREMIÈRE PARTIE 

MÉTHODES GÉNÉRALES ET RÉACTIFS 



CHAPITRE PREMIER 
INTRODUCTION 

1* Prépapatlon préalable et préparation ultérieure. — 
Après un examen superficiel des pages qui vont suivre, le lecteur 
novice pourrait bien éprouver un moment d'embarras à la vue des 
nombreuses méthodes et formules que nous nous proposons de lui 
faire connaître. Qu'H se rassure ! Noua allons essayer, moyennant un 
groupement ratioanel de nos matériaux, d'introduire un peu d'ordre 
dans ee dédale apparent. En effet, la plupart de ces procédés, qui 
paraissent être faits pour effrayer par leur nombre et leur désordre, 
ne sont que des procédés accessoires, destinés à élucider des détails 
très spéciaux ; beaucoup d'entre eux s'emploient très rarement, et 
tous viennent se grouper natureUement autour de deux ou trois 
Méthodes normales typiques. 

En premier lieu, on peut distinguer, dans la technique de n'importe 
quel genre de recherche microtomique, deux étapes : \il prèparalioii 
préalable et Is. préparation ultérieure. Or, la prepnration préalable 
est essentietiement identique dans toutes les mélhodes ; les diver- 
gences se montrent surtout dans les détails de la préparation ulté- 
rieure. Par préparation préalable nous entendons cet ensemble de 
manipulations que les naturalistes allemands appellent Conservi- 
rungsmethoden, et qui a pour but effective ment de rendre les tissus 
Ait AT, uicRoac. i 



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2 CHAPITRE PREMIER 

propres à se conserver à travers toutes les opérations ultérieures 
auxquelles ils doivent être soumis. Cette étape comprend : 1** Topé- 
ration de tuer d'une manière appropriée l'animal à étudier ; 2*^ la 
fixation des tissus ; 3^ les lavages et autres manipulations ayant pour 
but de les débarrasser de l'agent Oxateur et de remplacer ce dernier 
par un liquide conservateur ou par tout autre réactif qu'on désire 
employer. 

Nous donnons un peu plus loin la description générale des opéra- 
tions de la préparation préalable, et nous passons tout de suite à la 
considération de la préparation ultérieure. 

2. Préparation ultérieure par la voie humide et par la 
Méthode de déshydratation. — La préparation ultérieure se fait 
toujours par l'une ou l'autre des deux méthodes : la voie humide et la 
méthode de déshydratation. Suivant la première méthode, les colo- 
rations, les lavages et toutes les opérations préliminaires, de même 
que la conservation définitive, se font avec des milieicx aqueux; sui- 
vant la seconde, on déshydrate les objets pour les étudier dans le 
baume ou quelque milieu semblable, qui sert également à les conserver 
en préparations permanentes. 

Un objet conservé dans la glycérine diluée est un exemple de la 
première de ces méthodes ; un objet monté dans le baume, un exemple 
de la deuxième. On doit nécessairement employer la méthode de pré- 
paration par la voie humide toutes les fois qu'il s'agit d'étudier l'objet 
dans un milieu n'ayant pas la haute réfringence des résines que nous 
sommes obligés d'employer pour la conservation des préparations 
déshydratées, et même toutes les fois qu'il est indispensable d'éviter, 
autant que possible, le ratatinement des éléments qui accompagne 
toujours, nonobstant toutes les précautions, la déshydratation des 
tissus. On doit également l'employer pour l'examen de tissus frais 
toutes les fois qu'on désire connaître leur structure avant qu'elle ait 
été altérée par TefTet de réactifs qui leur enlèvent leur eau naturelle. 

Mais, toutes les fois qu'il n'existe pas de semblables raisons pour 
préférer la voie humide, il convient d'employer la méthode de déshy- 
dratation. Nous voulons dire que, dans la technique moderne, la 
méthode de préparation par déshydratation est la méthode princi- 
pale, et la méthode de préparation par la voie humide, la méthode 
accessoire. Et il en est ainsi pour deux motifs. On trouve en général, 
à part les exceptions que nous avons indiquées, que les préparations 
au baume, convenablement faites, montrent mieux les rapports des 
éléments et donnent des vues d'ensemble plus instructives que les 



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INTRODUCTION 3 

préparations faites dans les milieux aqueux ; et l'on trouve en tout 
cas et sans aucune exception qu'elles se conservent infiniment mieux 
en préparations permanentes. Il est aujourd'hui reconnu que l'éloi- 
gnement, aussi complet que possible, de Teau des tissus est essentiel 
pour la permanence de la conservation. 

3. Préparation d'olijets entiers et méthode des coupes. — 

La préparation par déshydratation se divise à son tour en deux 
branches, selon qu'il s'agit de la préparation d'objets entiers ou de 
la confection de coupes de ces objets. Mais remarquons tout de suite 
que nous n'avons pas là deux méthodes distinctes, mais simplement 
deux degrés d'élaboration d'une seule et même méthode. La marche 
à suivre dans les deux cas est identique pour la majeure partie des 
opérations. La méthode des coupes ne se sépare de celle qu'on emploie 
pour les objets entiers que par les manipulations spéciales néces- 
saires pour la confection même des coupes. C'est ce que démontrera 
immédiatement un coup d'œil au tableau ci-dessous. 

A, — Fixation. 

B. — Lavage pour enlever Texcès de fixateur. 
[C. — Coloration, si l'on désire le faire à ce 

stade. 

D, — Lavage, si Ton a coloré.] 

un milieu E, — Passage par des alcools successifs (ici 

on peut colorer) jusqu'à l'alcool absolu 

(ceci commence la préparation par 

déshydratation). 

F. — Pénétration par une essence. 

G. — Bain de paraffine (ceci commence la 
confection des coupes), 

H. — Coupes. 

/. — Collage des coupes sur porte-objets. 
/. — Enlevage de la paraffine par une essence. 
[K. — Enlevage de l'essence par l'alcool. 
L, — Coloration si on ne l'a pas fait aupara- 
vant. 
M. — Lavage. 
A^. — Alcool absolu. 
0. — Essence.] 
P, — Baume. 



£1. — Passage à 

d'étude aqueux (ceci ter- 
mine la préparation par 
voie humide). 



G'. — Montage au baume (ceci 
termine la préparation par 
déshydratation d'un objet 
entier). 



Comme -on le voit, si l'objet a été coloré en bloc au stade C ou E, la 
méthode des coupes ne diffère de celle qui est employée pour les objets 



entiers que par l'intercalation des stades 6 
dire entre l'alcool et le baume. 



J entre F et G*, c'est-à- 



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4 CHAPITRE PREMIER 

4. Procédés spéciaux. — Par Tune et l'autre de ces méthodes, 
ranalomisle ébauche son travail, et souvent même l'achève. Ensuite 
vient, s'il y a lieu, l'étude de points spéciaux à l'aide de méthodes 
spéciales, telles que l'examen des éléments des tissus à' l'état vivant 
et in &itu^ ou bien dans des « liquides indifférents i ; telles aussi que 
l'emploi de colorants divers, ou la dissociation par des procédés 
mécaniques ou par la macération ; puis, la décalcification, la dépig- 
mentalion^ etc. 

Nous allons essayer de donner dans les paragraphes suivants de ce 
chapitre une description suffisante de ces méthodes générales, et nous 
réserverons pour des chapitres spéciaux la discussion des points de 
détail et des procédés auxiliaires. 

5* Fixation et lavage. — La préparation d'un organisme ou 
d'un tissu quelconque doit toujours débuter par la Fixation de ses 
éléments. Le mot fixation implique deux choses : les éléments doivent 
être lues avec une rapidité suffisante pour ne pas leur laisser le temps 
de changer de forme ou de quitter Tattitude qui leur est propre 
pendant la vie ; — et ils.doivent en même temps acquérir, par l'effet 
du réactif, un degré de durcissement qui les mette en état de résister 
à toutes les manipulations subséquentes et à l'action des réactifs les 
plus divers, sans se déformer. On ne saurait trop insister sur ce point, 
qui est d'une importance capitale. Sans une bonne fixation, les objets 
ne sauraient fournir ni de bonnes colorations, ni de bonnes coupes, 
ni aucune autre sorte de préparations ayant de la valeur. 

L'objet ayant été soumis à l'action de l'un des agents fixateurs que 
nous allons étudier dans le chapitre suivant, il est, en général, néces- 
saire de lui faire subir un Lavage soigné, dans le but d'éloigner des 
tissus jusqu'aux moindres traces de l'agent fixateur. Cela est néces- 
saire d'abord parce qu'une action trop prolongée des substances 
coagulantes dont on se sert pour fixer serait préjudiciable à la conser- 
vation des éléments, puis aussi parce qu'il est en général nécessaire de 
le faire dans l'intérêt des procédés de coloration et d'imbibition avec 
des nitUeux d'une réfringence voulue dont on se servira dans la suite. 

La manière dont ces lavages doivent se faire n'est point indifférente. 
Si Ton a fixé à l'acide osmique ou à l'acide chromique, le lavage se 
fait généralement à l'eau. Mais si l'on a fixé avec l'acide picrique, par 
exemple, il est nécessaire d'éviter de laisser agir l'eau sur les tissus, 
et on la remplace par l'alcool. La pratique se fonde ici non seule- 
ment sur des considérations relatives aux diverses solubilités des 
réactifs eu question, mais aussi sur des considérations d'un ordre 



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^ ■»• 



IKTRODUCTIOS 5 

tout autre, que voicL Les acides que nous avons mentionnés en 
premier Heu, de même que tous les composés des métaux lourds dont 
on se sert comme agents fixateurs, paraissent former des combi- 
aaisoQâ chimiques avec les éléments des tissus, qu'ils rendent inso- 
lubles dans Teau ; de sorte que le durcissement opéré par ces 
réactifâ peut résister au traitement par Teau. L'acide picrique, au 
contraïre^ ne paraît nullement entrer en une combinaison semblable 
avec les éléments des tissus, et ne leur donne pas de durcissement 
persistant. Si l'on fait le lavage à Feau, Tacide se laisse eniièrement 
enlever, tout en laissant les lissua dans un état mou dans lequel ils 
subissent raclion nuisible de Teau qui les gonfle et les désagrège. 
Heureusement, l'alcool sert à enlever l'acide et à durcir les éléments 
en même temps. Nous aurons soin d'indiquer la manière dont il 
convient de faire des lavages pour chacun des réactifs fixateurs dont 
nous traiterons, 

6. Précautions contre la déformation par les courants 
osmotigues ou de diffusion. — Dans la préparation de toutes les 
sortes d'objets, mais surtout d'organes ou d'organismes enliers et 
revêtus d'un tégument peu perméable aux liquides, il faut veiller à ce 
qu'il ne se produise pas de gonflements des tissus par endosmose lors 
de leur passage de l'un des liquides employés à un liquide de densité 
moindre, ni des ralatinements lors du passage à un liquide de densité 
plus grande. (Cet inconvénient se fait surtout sentir au moment du 
passage du dernier alcool à Tessence éclaircissante, mais il existe 
aussi à toutes les étapes de la préparation, c'est pour cela que nous 
en parlons ici,) Pour Téviter, on a soin, autant que possible, d^inciser 
largement les téguments de Tobjet que Ton prépare, pour que les 
deux liquides puissent se mêler librement et rapidement. Ensuite on 
a soin de faire en sorte que le passage de tun à Vautre liquide .wit 
rendu aussi graduel que possible* Cela peut se faire de deux 
manières. 

S'il s'agit de porter l'objet dans un liquide inoins den^e que celui 
où il se trouve, il faut, autant que possible, le faire passer par des 
bains successifs de mélanges des deux liquides qui contiennent une 
proportion toujours croissante du deuxième liquide, Yeul-on passer 
de Teau h l'alcool fort, il est bon de passer par des bains successifs 
d^alcool au tiers, d'alcool â 70 p, 100, d'alcool à 90 p. 100 et finale- 
ment d'alcool â 9o p. 100. (Gela vaut mieux que d'ajouter par petites 
quantités de Talcool fort à l'eau où se trouve la préparation, procédé 
qui donne lieu à un dégagement de bulles d'air dans le liquide, ce 



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6 CHAPITRE PREMIER 

qui est à éviter.) Veut-on transporter dans de l'alcool à 70 ou à 
90 p. 400 un objet qu'on vient de fixer avec un fixateur aqueux, on 
aura soin d'y porter l'objet au moyen d'une pipette ou d'une petite 
cuillère, de sorte qu'il se trouve enveloppé dans une petite atmos- 
phère de liquide aqueux à laquelle l'alcool ne se mêlera que lente- 
ment. Gela suffira le plus souvent, mais il est des objets très délicats 
qui rendent désirable l'emploi de précautions encore plus minu- 
tieuses. 

Pour de tels objets il convient de disposer un appareil servant à régler 
la diffusion. On peut mettre les objets avec un peu de liquide, dans un tube 
bouché à Tun de ses bouts et fermé à l'autre par un diaphragme de peau de 
chamois ou une autre membrane convenable, puis plonger ce tube dans un 
récipient qui contient de l'alcool du titre auquel on désire passer, et laisser 
le tout jusqu'à ce que, par diffusion lente à travers la membrane, le liquide 
du tube et celui du récipient soient devenus de densité égale. Ou l'on peut 
employer le « différentiateur > de Cobb, dont on trouvera la description dans 
Proc, Linn. Soc, N, S. \V., V, 1890, p. 457, ou dans Joum. Boy, Mie, 
Soc, 1891, p. 821 . Ou bien, ce qui sera en général plus commode, l'appareil 
de Haswell. (Proc, Linn, Soc, N, S, W,, VI, 1891, p. 433 et Jown, Rot^ 
Mie. -Soc, 1892, p. 696.) Cet appareil consiste en deux flacons de lavage 
réunis par un tube et portant, en outre, l'un un tube de dégagement pour 
le trop-plein, l'autre un tube à robinet ou à pince, qui le relie à un réservoir 
d'alcool du titre auquel on veut arriver. On met dans le premier flacon les 
objets avec un pou du liquide dans lequel ils se trouvent ; on met également 
un peu de ce même liquide dans le deuxième flacon ; puis on ouvre le 
robinet. Le mélange de liquides se fait donc dans le flacon qui ne contient 
pas les objets, et c'est ce mélange qui est graduellement conduit, par le 
siphon qui réunit les deux flacons, dans le liquide primitif qui contient les 
objets. Citons aussi l'appareil à déshydratation rapide de CuEATLE,/owrn. of 
Pathol, and BacterioL, I, 1892, p. 253, ou Journ, Boy, Mie, Soc.y 1892, 
p. 892. 

Si, au contraire, il s'agit de porter l'objet dans un liquide plus 
dense que celui où il se trouve, on emploiera, selon les cas, soit la 
méthode de bains successifs de liquides mélangés, ou bien l'élégante 
méthode imaginée par Giesbreght, pour opérer le passage graduel 
de l'alcool absolu à une essence éclaircissante. Elle consiste à 
mettre le liquide éclaircissant sous l'alcool qui contient les pièces à 
éclaircir. Par exemple, on verse dans un récipient convenable — 
un verre de montre ou mieux un petit tube — quelques gouttes 
d'essence de cèdre ou de girofle, on verse doucement sur l'essence 
une quantité suffisante d'alcool. Ou bien, on verse l'alcool en pre- 
mier lieu et l'on introduit ensuite l'essence sous l'alcool à l'aide 
d'une pipette. On met les objets à éclaircir dans l'alcool. Ils nagent 
d'abord à la surface de séparation des deux liquides, où ils se trou- 



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INTRODUCTION î 

vent dans un milieu mixte dont la densité augmente aussi graduel- 
lement que possible de haut en bas. Ils se pénètrent peu à peu d'un 
milieu qui est un mélange des deux liquides employés, et à mesure 
qu'ils s'en pénètrent ils Téchangent de nouveau par diffusion contre 
un milieu toujours plus dense. Ils passent donc par gradations insen- 
sibles à travers des mélanges de densité croissante, jusqu'à ce qu'ils 
soient entièrement pénétrés par le liquide plus dense. Alors ils lom- 
bent au fond de ce dernier ; on enlève avec une pipette Talcool qui 
surnage, et l'opération est terminée. 

Cette méthode est de beaucoup plus délicate que celle qui consiste 
à faire pénétrer les objets successivement par un mélange de deux 
parties d'alcool et d'une partie d'essence, par un mélange d'une partie 
d'alcool et d'une partie d'essence, et ainsi de suite; méthode que 
nous voyons cependant pratiquer journellement. 

Il va sans dire qu'on peut opérer de même lorsqu'il s'agit de liquides 

aqueux ; par exemple, pour passer de l'eau à la glycérine. 

.» 

7. Coloration d'objets entiers. — Après cette digression sur la 
manière de faire passer les objets à travers les divers réactifs, repre- 
nons notre revue de la marche normale de la préparation. Nous avons 
décrit la fixation et les lavages; la préparation préalable esl termi- 
née. On peut maintenant, si Ton veut, procéder à la coloration dê& 
tisstis. On peut bien ajourner cette opération, et colorer en détail 
après que les coupes ou les dissections nécessaires auront été faites. 
Cela peut être même rendu nécessaire par certaines considérations, 
telles que le trop grand volume de l'objet, qui peut faire obstacle à 
la coloration ou bien la nécessité de contrôler de près lacoloralion et 
la décoloration, ainsi qu'il faut le faire si Ton désire pratiquer des 
colorations nucléaires selon la méthode régressive ou méthode de 
Flemiung, avec des couleurs d'aniline. 

Naturellement si l'objet est destiné à être conservé en entier, et non 
à être débité en coupes, c'est maintenant qu'il faut le colorer. S'il 
s'agit au contraire de faire des coupes, les deux voies sont ouvertes, 
et l'étudiant pourra nous demander laquelle il vaut mieux suivre. Or 
il ne paraît pas utile de former une règle générale à cet égard. Tout 
ce que nous pouvons dire, c'est que personnellement nous avuns à 
peu près abandonné la pratique de colorer en masse les objets desti- 
nés à être coupés. La coloration des coupes présente le grand avan- 
tage de permettre à l'opérateur de suivre pas à pas le progrès de Ja 
teinture et d'y apporter de temps à autre toute modification qu'il 
voudra. Les colorations par les couleurs d'aniline, qui ont pris de nos 



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8 CHAPITRE PREMIER 

jours une si grande importance, ne se peuvent pratiquer en général 
que sur des coupes, et c*est là une considération des plus importantes. 
Mais ce genre de colorations demande une certaine adresse, et pour 
ce motif le débutant fera peut-être bien de s'en tenir à Tancienne 
méthode et de colorer en bloc par un procédé éprouvé, tel que celui 
du carmin au borax de Grenadier. Nous donnerons du reste des 
explications plus détaillées sur ce sujet au chapitre Des teintures. 

8. Déshydratation et conservation. » La coloration une fois 
faite, il se peut que la préparation se trouve bien près d'être achevée. 
Si Ton ne désire faire ni coupes, ni dissections, il ne reste plus qu'à 
transporter l'objet dans le liquide c additionnel > ou conservateur 
dans lequel on veut l'étudier ou le conserver, et le monter sur porte- 
objets en préparation permanente ou temporaire. Nous parlerons au 
long de ces liquides dans les chapitres xvii et xix, et nous nous 
bornerons à rappeler ici que ce transport doit être fait d'une manière 
aussi graduelle que possible, comme nous l'avons expliqué au 
numéro 6. 

Le passage à travers des alcools successifs jusqu'à l'alcool absolu 
ou très fort s'appelle c déshydratation >. 

Ce passage forme une étape de la préparation qui nous présente comme 
une pause naturelle, où Ton peut s'arrêter si l'on veut. En effet, si l'on 
désire ne pas pousser la préparation plus loin pour le moment, il n'y a 
qu'à laisser les objets dans l'alcool à 70 p. 100 jusqu'à ce qu'on désire les 
soumettre à des manipulations ultérieures. Il vaut en général mieux ne 
pas prendre pour cette c conservation * des pièces de l'alcool plus fort. 
Gai* par l'action déshydratante et coagulante prolongée de l'alcool fort les 
tissus se trouvent altérés dans leur structure intime ; ils deviennent durs 
et cassants, et se ratatinent, et leur capacité de fournir à la teinture des 
colorations précises se trouve être sérieusement diminuée. 

KuLTSCHiTZKY {Zctt. f. WÎS8, Mik., IV, 3, 4887, p. 349) a proposé de 
remédier à cet inconvénient en conservant les pièces dans de l'éther, ou 
dans du xylol ou du toluol (toluène), liquides qui n'ont pas cette action 
sur les tissus. Flemming (Arch. /*. miL Anat.y XXXVII, 1891, p. 685) 
recommande de les conserver dans un mélange (environ à parties égales) 
d'alcool, de glycérine et d*eau. Les pièces ainsi conservées souffrent beau- 
coup moins, soit sous le rapport de leur consistance, soit sous celui de leur 
capacité de coloration, que les pièces alcooliques. Et cette méthode a en 
outre l'avantage qu'elle permet ou bien de préparer les objets pour l'inclu- 
sion dans la paraffine par un simple traitement par l'alcool, ou bien de les 
ramollir rapidement pour la dissection ou pour la dissociation par un 
simple traitement avec de l'eau. Nous pouvons recommander cette méthode 
que nous avons beaucoup pratiquée. Nous ajoutons souvent au liquide un 
peu d'acide acétique (0,5 p. 100 environ). 

Toutefois, si les pièces sont destinées à être coupées dans la paraffine, 



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INTRODDGTION » 

nous recommandons de procéder aussitôt à rinclution et de les garder dans 
la paraffine même ; elles s'y conservent admirablement sous tous les rapports. 
(Je viens, h titre d'essai, de couper et de colorer (en teinture double par ]e 
Kernscbwarz et la safran ine) une pièce qui a été conservée dans la paraffine 
depuis six ans et huit mois. La coloration est moins énergique que celle 
des coupes qui ont été prélevées sur Torganc le jour même de son inclu- 
sion, mais elle est largement aussi précise^ et elle me semble même plus 
belle, La conservation des cellules^ saus être parfaite^ parait cependant 
excellente, La pièce est devenue un peu friable et se coupe mal.) 

La plupart des auteurs recommandent de pousser la déshydratation par 
Faicool jusqu'au titre d*alcool al/^otu, avant de passer à Tessence écîaircis- 
saute qui sert d'iotermédiaire enlro ralcool et le baume ou la paraffine. Or 
i7 nesi pas nécessaire d'aller jusqu'à alcool absolu ; Takool à 90 p* iOO ou 
au surplus à 95 p. 100 sufJira dans la plupart des cas. Car la trace d'eau 
qui peut rester dans les tissus après qu'ils ont été traités par de Talcool de 
ces degrés se laissera parfaitement éloigner par le bain d'essence, pourvu 
qu'on ait soin d'employer une essence qui soit un bon agent éclaircissant. 
L'essence de bois de cèdre prendra bien toute l'eau qui reste dans les tissus 
après traitement par ralcool à 95 p, 100 ; l'essence do bergamote cclaicira 
après ralcool à 90 p. 100, et Thuile d'aniline après Talcool à 70 p. 100. 

B. ÉelaircissemeiLt et dissections fines. — Les objeU une fois 
déshydratés doivent maintenant être pénétrés soit par une essence ou 
un autre agent éclaircissant, s'ils sont destinés à être moutés tout de 
suite dans le baume, ou par la même essence ou un autre dissolvant 
de la parafline soit autre masse d'iuclusioa si Ton veut en faire des 
coupes. Pour le détail de ces opérations noua renvoyons aux cha- 
pitres Agents éclairciss.4nts, Liquides additionnels - 

11 reste cependant à noter ici que si l'objet doit âubir une dissedion 
fine à la loupe, c^est pendant qu'il se trouve dansFessence qu'il con- 
vient le plus souvent de faire cette opération^ Nous recommandons 
beaucoup à cette fin Fessence de bois de cèdre, qui prête aux tissus 
une consistance très favorable^ pendant qu'en même temps sa visco- 
sité considérable aide à soutenir les éléments délicats. L'essence de 
girofles a la propriété de rendre très cassanls les tissus qui y ont 
séjourné quelque temps, c'est là une qualité qui peut être utile ou 
non selon les cas. Cette essence a aussi la propriété de ne pas s'étaler 
largement k la surface du verre, mais d'y former des gouttes très 
convexes ; c'est là aussi une qualité dont on peut tirer parti. 

10. Inclnsion et coupes. — Les coupes se font par Tune ou Fautre 
des Méthodes d*inclusion dont nous donnons Fck position détaillée 
au chapitre xxi et aux suivants. Nous Dotons seulement ici qu'il y a 
deux méthodes principales d'inclusion, là méthode de la parafHne et 
la méthode du coltodion* Les avis sont encore partagés sur la valeur 



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la CIIÂFITRE PREMIER 

respective de ces deux mélhodes. Nous admettons, et en cela nous 
sommes certainement d'accord avec la grande majorité des anato- 
misLes^ que le procédé à la paraffine est la méthode par excellence 
pour les petits objets (c'est-à-dire des objets n*ayant pas. plus de 
7 millimètres environ de diamètre) ; tandis que le procédé au collo- 
dion convient mieux pour les objets très volumineux. 

11. Traitement déflBltif des coupes. — Les coupes une fois 
obtenues, il ne reste plus (si Tobjet a déjà été coloré en entier) qu'à 
en éloigner la paraffine au moyen d'un dissolvant convenable, et à 
les monter dans le baume. Cela se fait en général à l'aide du collage 
des coupeB en svncs su?* le porte-objets. Les coupes ayant été faites 
à see (c est-à-dire sans que !e rasoir ait été mouillé pendant qu'elles 
se faisaient) sont rangées en ordre sur un porte-objets enduit de col- 
lodion ou de Tune des autres substances qui ont été préconisées à cet 
effet, de la fai^on que nous expliquerons au chapitre xxiv. On porte 
alors le tout à la température de fusion de la paraffine, on chasse la 
paraffine fondue avec une goutle d'un dissolvant convenable (du xylol, 
par exemple), on ajoute une goutte de baume de Canada et un couvre- 
objets, et la préparation est terminée. 

Si la coloration n'a pas déjà été faite, voici comment on procède. 
Au lieu de porter les coupes dans le baume, on éloigne avec de l'alcool 
la substance qui a servi à dissoudre la paraffine, on les porte dans 
la solution colorante, et après coloration on lave, on déshydrate, 
Ton éclaircit de nouveau et Ton monte. 

12, Résumé et observations additionnelles. — Voici en très 
abrégé un cadre de marche générale que nous recommandons à l'étu- 
diant débutant. Fixez au sublimé ; lavez à l'eau d'abord ; puis longue- 
ment à i'alcool à 50 p. 100; colorez au carmin boracique alcoolique 
de Grenacher ; décolorez comme il est dit au paragraphe qui traite de 
ce réactif; passez par des alcools successifs de la manière que nous 
avons dite au numéro ; éclaircissez par de l'essence de bois de cèdre, 
et montez au baume, si vous ne désirez pas faire des coupes. Si 
vous désirez faire des coupes, au lieu de mettre la pièce dans le 
baume, vous la mettez dans un bain de paraffine et procédez comme 
il est dit au cliapître xxi ; coupez; collez les coupes sur la lamelle 
avec ïe collodion de Seh.'ellîbaum ; enlevez la paraffine avec du xylol, 
et montez dîrectejuent dans le baume. 

L%Hudiant qui s'est perfectionné dans cette marche pourra ensuite 
aborder une variante un peu plus difficile. Au lieu de fixer par le 



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INTRODUCTION 11 

sublimé, il pourra prendre le liquide de Flemming; et, au lieu de 
colorer l'objet entier, il pourra colorer les coupes (collées sur porte- 
objets par l'albumine de Mayer), avec la safranine ou le bleu Vic- 
toria. Ce n'est qu'après s'être perfectionné dans l'art de la teinture 
par la méthode de Flemming avec un seul colorant que nous lui 
conseillerions de s'essayer à une coloration double, telle que par le 
violet de gentiane suivi de la fuchsine acide. 

Nous engageons beaucoup le lecteur à consulter Tadmirable exposition 
des principes de la technique histologique moderne qui a été donnée par 
Paul Mayer dans les Alitth. Zool. Stat, Neapel, II, 1881, p. 1. (On en trou- 
vera des comptes rendus dans/oMrn. Roy. Mie, Soc.^ II, 1882, p. 866-881, et 
Amer, NaturaL, XVI, 1882, p. 697-706, ces derniers mentionnant quelques 
améliorations qui avaient été imaginées depuis la publication du travail de 
Ma^-er.) 



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CHAPITRE II 
EXTENSION, FIXATION ET DURCISSEMENT 



13. Introduction^ — Par le mot fixation des tissus, on a cou- 
tume d'enlendre les diverses opérations qui ont pour effet de tuer 
d'une fae^on inslantanëe les clémenls an atomiques, tout en leur con- 
servant ia forme qu'ils possédaient pendant la vie, et en leur prêtant 
un degré de durcissement artîGciel qui leur permet de subir sans se 
déformer Taclion des substances colorantes, durcissantes, éclaircis- 
santes, isolantes, enrobantes, ^— en un mot, toutes les manipulations 
chimiques et physiques qu'on détire mettre en œuvre pendant le cours 
de la préparalion ultérieure. 

Voici un exemple qui servira à faire comprendre Futilité des agents 
fixateurs. Si Ton traite une portion de rétine vivante soit avec de 
Thumeur aqueuse de Tûcil, soit avec du sérum, soit avec n'importe 
lequel des liquides dits indifférents des micrographes, ou avec Tune 
ou Tautre des liqueurs conseriifitrices qu'on emploie pour la conaer* 
valion permanente des pièces histologiques, on trouve invariablement 
que les cônes et bâtonnets ne conservent que pendant un temps très 
court l'apparence qu'ils ont pendant la vie ; après quelques minutes 
au plus, on voit commencer une série de changements post mortem, 
à la suite desquels les segments externes soit des cùnes, soit des bâton- 
nets se brisent en un certain nombre de disques et deviennent à la fln 
désintégrés au point d'être entièrement détruits. Puis encore, dans la 
même préparation, on observera qu'en un temps tout aussi court les 
fibrilles nerveuses, de lisses qu*elles étaient pendant !a vie, deviennent 
variqueuses, présentant un grand nombre de nœuds fus i formes, pour 
ne point parler des autres altérations post morlem qu'elles subissent* 
Si, au contraire, nous traitons une rétine vivante avec une solution con* 
centrée d'acide osmique, nous trouverons^ après vingt-quatre beureSj 



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EXTENSION j FIXATION ET DrRClSSEBIENT 13 

que la totalité des cônes et des bâtonnets esl parfaitement conservée, 
et que les fibrilles nerveuses ne montrent que peu ou point de vari- 
cosîtés. Et après ce durciasement préliminaire nous pouvons traiter 
la rétine avec de Feau {procédé qui ruinerait entièrement une rétine 
non fixée)^ nous pouvons même la laver dans de Teau pendant des 
jours entiers, sans qu'elle en soufTre ; nous pouvons la colorer, la 
durcir, la déshydrater, Fenrober, la couper au niicrolome, el monter 
les coupes dans un milieu résineux ou aqueux, sans que ses éléments 
aient éprouvé d'altération sérieuse par suite de ces manipulations. 

il résulte de tout ce que nous venons de dire que la fixation des 
tissus est la condition siîie quâ non de toute préparation à laquelle 
on veut donner une valeur scientiliqiie (nous parlons de préparations 
normales de parties molles, cela va de soi). « On a proposé depuis 
longtemps des liquides qui auraient la propriété de conserver indéfl- 
nimeut les tissus qu^on y a mis à Fétat frais ; mais^ eu réalité^ aucun 
de ces liquides ne possède ces avantages. II n'est pas à dire pour cela 
qu'on ne puisse avoir des préparations persistantes des éléments de 
l'organisme même les plus délicats ; pour atteindre ce but, il convient 
d'employer, non pas un seul liquide conservateur, mais une série de 
réactifs, dont les uns servent à fixer les éléments dans leur forme et 
à les rendre plus ou moins inaltérables, d^autres à les colorer, 
d'autres enûn à les mettre à Tabri de modiÛcations ultérieures « ■ 
(Ranvier») ^ 

14« Préeautionâ prélimîtiaires. BxtenBion mécanique. — 
Dans la grande majorité des cas, ou commence la préparation 
d'un objet en soumettaut l'orgaoe ou Torganisnie a étudier à 
Taction aussi complète et aussi immédiate que possible de Tun des 
agents fixateurs que nous allons étudier. Et cela se fait en prenant 
Torgane ou l'organisme à l'état vivant et normal ; on se fie 
alors à l'agent fixateur pour produire, avec la rapidité voulue, en 
même temps la mort de l'organisme et la mort des éléments des 
tissus. On ne peut cependant pas agir ainsi dans tous les cas. Il est 
des tissus qui^ au moment ou l'on fait agir sur eux les réactifs dont 
nous allons parler, se rétractent, se plissent, et donneraient de mau- 
vaises préparations si Ton ne parvenait à les maintenir en Tétat 
d'extension physiologique pendant la fixation. 

S* agît-il d cléments aïlongés^ soit plats, soit filiformes, il suffit sou- 
vent de les placer sur une lame de verre et d'en fixer les deux extré- 
mités avec de la cire à cacheter ou avec une goutte de paraffine fon- 
due. Ainsi pour tes tendons et les petits muscles. Ou bien on peut 



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14 CHAPITRE II 

mettre en œuvre le procédé de Ranvier {Traité^ p. 729) pour les nerfs 
à myéline. « On prend une petite tige de bois (une allumette par 
exemple) dans laquelle on pratique un évidement; au niveau de 
celui-ci on dispose Je nerf et on le fixe au degré d'extension conve- 
nable au moyeu de ligatures placées à ses deux extrémités. > Puis on 
porte le tout dans le liquide fixateur. 

Pour les membranes, on peut les tendre, comme la peau d'un 
tambour, sur un verre de montre, un petit godet, ou le goulot d'un 
flacon, et les y attacher avec un tour de fil. On trouvera très com- 
modes pour cette opération les anneaux histologiques des Hoggan et 
d'ÉTEUKO» que nous décrirons au chapitre des Imprégnations. Des 
organes membraneux tels que la vessie peuvent être maintenus en 
extension en les gonflant au moyen d'une seringue, soit d'un liquide 
indifférent, soit du liquide fixateur lui-même. 

Le procédé de la « demi-dessiccation > (Ranvier, Traité^ p. 69) 
« consiste à étendre sur une lame de verre une membrane à Taide des 
doigts appliqués sur ses bords. Tant que la membrane est humide, 
elle se rétracte du moment qu'on l'abandonne à elle-même. Mais 
lorsqu'elle commence à sécher (et par suite de la chaleur des doigts 
qui la tendent, elle sèche plus vite sur les bords), ses bords restent 
adhérents au verre, et en l'attirant successivement sur ses différents 
cotés, on arrive à la tendre d'une façon très complète ». 

On trouvera d'autres indications, très détaillées, dans le classique 
Traité de Ranvii^r- 

15. Hxtensioii par intoxication. — Il est bon nombre d'ani- 
maux, de coiisiâtance molle, manquant de squelette rigide, et doués 
d'une puissance considérable de contractilité — les Cœlentérés, les 
Bryozoaires, les Serpulides en fournissent assez d'exemples — qui, si 
on les traite sans autre précaution par un agent fixateur, se contrac- 
tent avec violence, retirent leurs tentacules ou leurs branchies, et 
meurent en un état recoquillé qui fait de l'objet conservé une carica- 
ture de la vie- 

Les animaux qui ne se contractent que lentement^ tels que Alcyo- 
niiwi et VeretiUum^ et quelques Tuniciers, tels que Pyrosoma, peu- 
vent être luéB en extension si on les jette brusquement dans un liquide 
fixateur assez énerpque pour les tuer avant que leurs éléments 
n'aient eu le temps de se contracter. 

L'acide acétique criâtallisable (méthode de van Beneden) est un excellent 
réactif k cette liu, et réussit, par exemple, très bien avec Pyrosoma et cer- 
taines Méduses (voy. au chapitre v et chapitre xxxui). Le sublimé corrosif, 
gortôut à chaud, donne aussi souvent de bons résultats. 



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EXTENSION, FIXATION ET DURCISSEMENT 15 

L'application brusque de la chaleur est aussi un procédé dont on peut 
tirer parti. Par ce moyen, les éléments sont fixés en même temps que les 
organes sont immobilisés. C'est aussi une méthode qui a Tavantage de se 
prêter mieux qu'aucune autre à Texamen micro-chimique des tissus, car 
elles n'y introduit rien qui puisse en altérer la composition ni gêner les 
réactions. 

Il sufHra en général d'exposer les animaux pendant quelques secondes à 
une chaleur suffisante. On peut mettre de petits objets tels que Proto- 
zoaires, Hydraires, Bryozoaires, dans une goutte d'eau placée dans un verre 
de montre ou sur une lamelle, et les flamber au-dessus d'une lampe à 
alcool. Des animaux plus grands peuvent être jetés brusquement dans une 
quantité d'eau chauffée préalablement. On conserve très bien les grands 
Némertiens en les jetant dans de l'eau douce chauffée. On peut aussi mettre 
les pièces dans une très petite quantité d'eau contenue dans un tube de 
verre et plonger ce tube pendant quelques secondes dans de l'eau bouillante. 
Aussitôt fixées, les pièces doivent être passées dans l'alcool (50 p. 100 
environ). 

La difficulté de cette méthode consiste à atteindre la température mortelle 
sans la dépasser de plus de quelques degrés. Il ne faut guère aller au delà 
de 80® C, en aucun cas, et une chaleur de 60® C. suffira très souvent. C'est 
en somme une méthode qui peut rendre des services, mais il ne faut pas 
trop s'y fier dans les recherches histologiques délicates, car le moindre 
excès de chaleur provoque des gonflements très considérables de certains 
éléments cellulaires. 

Mais dans le cas d'animattx qui se contractent très rapidement, 
on est souvent obligé d'avoir recours à Timmobilisation préalable par 
un des procédés d'intoxication ou d'anesthésie que nous allons 
décrire. 

16. Fumigation au tabac (Hertwig, Die Actinien, 1879). — On 
place les animaux dans une cuvette avec de Teau, et on les recouvre 
d'une cloche de verre ou d'un cristallisoir, destiné à confiner la fumée 
de tabac. On fait alors passer de la fumée sous la cloche par le 
moyen d'un tube de verre courbé. Après y avoir introduit une 
quantité sufïïsante de fumée, on abandonne les animaux pendant 
quelques heures, aûn que la narcotisation puisse se compléter. On 
constate le progrès de l'anesthésie en irritant l'animal de temps à 
autre ; aussitôt qu'on observe qu'il ne réagit plus que lentement, 
que, par exemple, si l'on touche un tentacule avec une aiguille, 
cet organe ne commence à se rétracter qu'après un laps de temps 
considérable, on peut estimer que le sujet est suffisamment engourdi. 
On verse alors dans l'eau une dose de liquide fixateoir suffisante 
pour le tuer avant qu'il ait eu le temps de changer d'attitude ; et, 
une fois qu'il est parfaitement mort, on peut changer à volonté le 
liquide où il se trouve. 



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i6 CHAPITRE II 

Si Ton nous demande notre avis quant à l*utilité de cette méthode, 
nous dirons qu'elle peut rendre de réels services, et nous conseille- 
rons de ressayer toutes les fois qu'on n'est pas arrivé au but par une 
voie plus commode. La fumigation produit, par exemple, chez les 
Actinies, une bien véritable intoxication qui sert parfaitement à les 
maintenir étalées ; mais cet état ne s'établit que lentement : il faut 
plusieurs heures pour produire l'immobilité voulue chez une Actinie. 

En conséquence, c'est un procédé peu agréable à appliquer, c'est 
pourquoi l'on a imaginé le suivant. 

17. Nicotine. — Andres [Atti R. Acad. dei Lincei, V, 1880, p. 9 ; 
Joum, Roy. Mie. Soc. (N. S.), II, 1882, p. 884) a imaginé d'employer 
la nicotine en solution aqueuse, au lieu de l'administrer sous forme 
de fumée de tabac. Il se sert d'une solution d'un gramme de nicotine 
dans un litre d'eau de mer. Il place l'animal à narcotiser dans un 
bocal contenant un demi-litre d'eau, et il y conduit la solution de 
nicotine très graduellement par le moyen d'un fil faisant siphon. La 
grosseur du fll doit être telle qu'il puisse vider le litre de solution de 
nicotine en douze heures. 

18. Chloroforme. — D'autres substances anesthésiques peuvent 
être ajoutées par petites quantités à l'eau qui contient les animaux à 
endormir. Le chloroforme donne quelquefois de très bons résultats 
quand il est employé de cette manière; nous avons vu de belles 
Méduses très bien chloroformées dans une attitude parfaitement étalée, 
en une heure ou deux de temps. Il convient de projeter le chloro- 
forme, par quantité de quelques gouttes à la fois, vigoureusement 
dans l'eau avec une petite seringue ou une pipette munie d'une poire 
de caoutchouc, l'une ou l'autre ayant l'orifice assez petit pour que le 
chloroforme soit pulvérisé à la sortie. On répète la dose toutes les 
cinq minutes, jusqu'à ce que l'animal soit immobilisé. Notons ici que 
Andres a trouvé que cette méthode ne convient pas pour les Actinies, 
car chez ces animaux la macération des tissus survient avant que 
l'insensibilité soit établie. 

Pour obtenir de bonnes coupes de la tige très contractile des Sipho- 
nophores, Korotneff [Mitth. Zool. Stat. Neapel^ V, Hfl 2, 1884, 
p. 229 ; Zeit. f. wiss. Mikroskopie^ 2, 1885, p. 230) commence par anes- 
thésier les animaux avec la vapeur de chloroforme. On attend que 
les animaux se montrent un peu tranquilles dans le bocal qui les 
contient. On fait flotter alors sur l'eau un verre de montre contenant 
du chloroforme, et l'on couvre le tout avec une cloche. Le chloro- 



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EXTENSION^ FIXATION ET DURCISSEMENT 17 

forme endort les Siphonophores, qui demeurent étalés. On enlève 
alors la cloche, et Ton fixe les animaux en les inondant subitement 
d'acide chromiqûe ou de sublimé chaud. 

19. L'alcool et l'éther peuvent s'employer de la même manière 
que le chloroforme. Pour les Actinies, Andres a obtenu de bons résul- 
tats avec le mélange suivant (dû à S. Lo Bianco) : glycérine, 20 parties ; 
alcool (70 degrés), 40 parties ; eau de mer, 40 parties. 11 faut verser 
ce liquide avec précaution sur Teau qui contient les animaux, et 
Attendre qu'il s*y soit mêlé lentement par diffusion. Il faut pour cela 
souvent plusieurs heures. C*est ainsi que Ëisig emploie l'alcool. 

20. Alcoolméthylique(CoRi,Zezï./. wjtss. Jlfa.,VI,4,1890,p.438). 
— Ce réactif a l'avantage, entre autres, de n'avoir que peu d'action 
sur les albumines. On fait un mélange de 10 ce. d'alcool méthylique, 
ei 90 ce. d'eau de mer ou d'eau douce (si on prend de l'eau douce 
^n ajoute 6 grammes de chlorure de sodium). On ajoute ce mélange par 
petites quantités à l'eau qui contient les animaux ; et si cela ne suffit 
pas, on les inonde du mélange non dilué. On peut ajouter au mélange 
quelques gouttes de chloroforme. 

21. GhloraJ. — Fokttinger {Archives de Biologie, VI, p. 115) a 
obtenu des résultats très complets avec l'hydrate de chloral. Il opère 
en laissant tomber au fond du vase qui contient les animaux quelques 
cristaux de chloral. Pour des Alcyonelles, il emploie 35 à 50 centi- 
grammes de chloral pour 100 grammes d'eau. Au bout de trois quarts 
d'heure, la colonie est devenue insensible, ne réagit plus et peut être 
0xée. Foettinger a ainsi obtenu de bons résultats avec des Bryozoaires 
aquatiques et marins, des Annélides, des Mollusques, des Némertiens. 
Ces derniers deviennent insensibles sans avoir craché leur trompe. 
L'expérience n'a pas réussi avec les Hydroïdes. Les résultats obtenus 
avec les Actinies étaient assez satisfaisants. Des Astéracanthions ont 
pu être endormis. 

Je sais que cette méthode donne souvent de bons résultats, mais 
elle ne réussit pas toujours. Je l'ai essayé avec des Némertiens, et je 
n'ai jamais eu le moindre succès. 

Verworn [Zeit.f. wiss. ZooL, XLVI, 9, 1887, p. 99 ; Journ. Boy. 
Mie. Soc.^ 1888, p. 148) s'en sert pour les Bryozoaires d'eau douce. 
Il laisse des colonies de Cri$tatella pendant quelques minutes dans 
une solution de chloral à 10 p. 100. 

KÛKENTHA.L [Jen. Zeit.y XX, H. 4, 1887, p. 511; Journ. Roy. Mie. 
Soc.^ 1888, p. 509) a obtenu de bons résultats avec quelques Annér 

ANAT. UICROSC. 2 



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18 



CHAPlTtlE II 



lides au muyea d une sûlulion de ehloral à 1 p. 1000 dans Teau de 
mer. 

Je pense que le ehloral ne doil être employé qu'avec précaution^ 
car il macère très vite. J'ai vu des animaux dont Tépiderme était très 
macéré avant que Tin sensibilité fût établie _ 

22. Chlomre de magnéalum {Tulliïerc, ytrcA. Zool. Expér, et Gén., X. 
1892, p. il). — Pour des Aclinics, faire une solution à 33 p. 100 et l'ajouter 
graduellement à Teau qui conlieul Tanimàl étalé, jusqu'à ce que cette eau 
contienne 1 p. 100 du sel. Ainsi pour l litre d*eau de mer ajoutez 33 ce. de 
la solution. H faut une trentaine de minutes pour arriver à Tanesthésie. 
Pour des Invertébrés d'eau douce ou terrestres il faut prendre une solution 
un pen plus forte. 

TlEDEMiAUGn [Amer. NaL, 1895, p. 399 ; Journ. Roy, Mie. Soc, 1895, 
p. 'à%'û} prend le sulfate de magnésie, qu'il emploie soit en solution, soit 
sous forme de cristaux. 

23. Cocaïne {Rtcuahd, ZqoL Anzeîg^^ 188S, p. 332). — Richard se 
sert d'une soliitioa de chlorhydrate de cocaïne au centième. Les ani- 
maux à narcotiser (Bryozoaires) sont placés dans un verre de montre 
avec S ce, d'eau. On ajoute, peu à peu, de la solution de cocaïne^ 
Après cinq minutes les animaux ne réagissent plus que faiblement ; 
on ajoute encore un demi-centimètre cube de la solution, et, un instant 
après, il faut exciter directement les tentacules, à l'aide d'une aiguille, 
assez fortement pour leâ voir se contracter. Dix minutes plus tard, les 
animaux doivent être morts épanouis, et peuvent alors être traités 
par les procédés ordinaires de fixation. Celte méthode convient pour 
les Bryozoaires, les Hydres et certains Vers, 

24. Hydrosylamlne. — Hofeb {Zeii. f. wiss. Mik., Vil, 3, 1390, 
p. 318) a employé Thydroxy lamine avec succès pour les organismes 
les plus variés. On peut prendre ou bien le sulfate de la base ou bien 
rhydrochlorate, ce dernier de préférence- L'hydrochlorate du com* 
merce contient hahiluellenient de Tacide chlorhydrique. II faut le 
dissoudre dans de l'eau douce ou de Teau de mer (pas dans de l'eau 
distillée) f et neutraliser exactement par addition de carbonate de 
soude. On prend pour des Infusoires une solution d'une concentra- 
tion de 0,1 p. 100 et on les y laisse trente minutes ; pour des hydres, 
0."iy p. lOOj et on les y laisse de quinze minutes à une heure; pour 
liirudo, 1 p, 100, 30 minutes à deux heures ; pour Hélix et Anodonta, 
même concentration, dix à vingt heures. 

L*hydroxy lamine est un agent réducteur très énergique. Les ani- 
maux paralysés ne doivent donc pas être tués par un agent Qxateur 
facile à réduire^ telqueTâcide osmique, Tacidechromique, le sublimé. 



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EXTENSION, FIXATION ET DURCISSEMENT ft9 

etc.^ à moins qu'il ne soit possible dô les bien laver à Teau aupara- 
vant. 

25. Acide carbonique (Fol, Zool. Anzeig., n*" 128, 1885, p. 698. 
Aussi, Bulletin de la Société Belge de Microscopie^ t. IV, 1882, 
p. 83). -* Il faut saturer graduellement diacide carbonique Teau dans 
laquelle nage Tanimal à immobiliser; celui-ci devient bientôt complë* 
tement insensible et immobile, tout en conservant son aspect naturel. 
Il reste sans changement pendant des heures et même des jours 
entiers ; mais il reprend toute sa vivacité aussitôt que Teau chargée 
d*acide carbonique est remplacée par de Teau pure* Le procédé ne 
réussit ni avec les Poissons ni avec les Mollusques, mais il réussit 
avec la plupart des animaux dont le système nerveux conserve son 
caractère épiblastique, c'est-à-dire, par exemple, avec la plupart des 
Cœlentérés et des Ëchinodermes. 

J'ai essayé cette méthode avec de petits Annelides et des Hirudinés, 
et j'ai eu des résultats excellents. Il n'est pas nécessaire d'employer, 
un générateur pour fabriquer le gaz. Il suffit de prendre un siphon 
d*eau gazeuse du commerce, et d'en ajouter à l'eau qui contient les 
animaux. 

26. Empoisonnement. — On obtient quelquefois de fort bons 
résultats en empoisonnant les animaux avec de petites doses d'un 
liquide Qxateur. L'acide osmique et la liqueur de Kleinenberg s'em-» 
ploient souvent à cet effet. Nous avons vu tuer des Méduses d'une 
manière très satisfaisante par le sublimé corrosif en nature, ajouté 
par pincées à l'eau contenant les Méduses. Voici une méthode pouf 
conserveries Ascidies avec leurs oriQces naturellement ouverts, due à 
Salvatore Lo Bianco, l'habile préparateur de la Station zoologique de 
Naples. On ajoute, peu à peu et très doucement, à l'eau qui contient 
les animaux, une solution d'acide chromique à 1 p. 100, additionnée 
d'acide acétique, en faisant en sorte que ce liquide nage à la surface 
de l'eau de mer et ne s'y mêle que lentement. Il faut quatre à cinq 
jours pour mener l'opération à bonne fin. (Garbini, Manuale per la 
Technica Modema del Microscopio^ p. 163.) 

D'autres ajoutent à l'eau de mer des cristaux d'alun. On a aussi 
employé de cette manière la morphine, le curare, la strychnine^ 
l'acide prussique et autres agents paralysants. 

27. Asphyxie. — On sait que, pour faire mourir étendus les 
Gastéropodes pulmonés terrestres, il est d'usage de les mettre dans 



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I 



20 CHAPITRE II 

0n bocal rempli d*eau qui a été privée d'air par rébullition et her- 
métiquement «los. On trouve les animaux morts étendus après douze 
à vingt-quatre heures. Nous ajouterons qu'on nous a assuré que cet 
effet s'obtient plus promptement si Ton a soin d'ajouter à Teau du 
bocal un peu de tabac. 

Quelquefois on arrive au but simplement en laissant des animaux 
aquatiques épuiser d'eux-mêmes l'oxygène de l'eau dans laquelle on 
les a confinés. J'ai réussi ainsi avec des Holothuries et d'autres Échi- 
nodermes. Ward {Amer. Nat., XXV, 1891, p. 398) a eu de bons 
résultats de cette manière avec des Hydraires, des Actinies, etc. Si les 
animaux se montrent imparfaitement étalés lorsque la narcose s'est 
établie, il faut les mettre pendant un instant dans de l'eau pure ; ils 
s'étendront, et à cet instant on les jette dans un liquide fixateur 
(Ward). 

28. Autres procédés. — Certains Vers meurent lentement et 
étendus si on les met dans de Teau chaude. 

Le jus de citron m'a donné de bons résultats avec de petits Hiru- 
dioés qu'il fait mourir instantanément dans une attitude étalée. 

L'eau douce sert quelquefois très bien pour étendre des animaux 
marins. 

29. Pratique des fixations. — Les agents fixateurs s'emploient 
soit à l'état de liquides, soit à l'état de vapeurs. Nous ne connais- 
gons que l'osmium qui soit généralement employé de cette dernière 
façon; cependant l'alcool et l'acide sulfureux ont été récemment 
employés à l'état de vapeur avec fruit par Gilson et Carnoy, et nous 
ne serions nullement étonné de trouver que d'autres substances 
peuvent être utilisées avec avantage de cette façon (acide formique). 

Pour fixer un objet avec la vapeur d'un de ces réactifs, on procède 
comme nous le disons au numéro 38. 

Pour fixer un objet dans une solution quelconque, il va sans dire 
qu'on le plonge dans le liquide et qu'on l'y laisse jusqu'à ce que la 
réaction soit accomplie. Nous indiquons ici quelques précautions à 
prendre. 

It faut veiller avec soin à ce que les tissus, les éléments ou les 
organismes soient pai^faUement vivants au moment de les fixer; si 
on les laisse mourir avant de les exposer à l'action de l'agent fixa- 
teur, on ne fixe que des états pathologiques, ou des altérations pos^ 
mortem. 

Il faut veiller à ce que les objets à fixer soient aussi petits que 



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EXTENSION, FIXATION ET DURCISSEMENT 21 

possible, pour que l'agent fixateur puisse les pénétrer rapidement et 
d'une façon égale. Des organes ou organismes entiers doivent être 
largement ouverts, si cela est possible. 

On jettera les objets dans une quantité de solution fixatrice très 
grande par rapport au volume des objets ; il s'agit, en effet, d'em- 
pêcher que la composition de la solution fixatrice ne se trouve changée 
par l'addition des liquides ou des substances solubles des tissus. 

En cas de nécessité, on facilitera Faction du fixateur en l'employant 
à chaud. La chaleur de Tétuve d'incubation sera souvent suffisante, 
mais quelquefois il faudra employer des liquides bouillants (sublimé 
bouillant pour quelques Goralliaires et Hydrozoaires, alcool absolu 
bouillant pour certains Arthropodes à téguments très imperméables). 

Certains Qxateurs demandent qu'on ne laisse les oi3Jets dans le 
liquide que juste le temps nécessaire pour que la fixation s'accom- 
plisse, tel, par exemple, le sublimé corrosif; si on les y laisse séjourner 
trop longtemps, les tissus deviennent souvent cassants, et les colora- 
lions sont gênées. D'autres, au contraire, comme le liquide de 
Flemming, sont tels qu'on peut y laisser les objets pendant des jours 
ou des semaines sans inconvénient. 

On aura soin de faire ensuite les lavages nécessaires pour enlever 
le réactif fixateur avec le liquide approprié; il n'est, par exemple, 
nullement indifférent de prendre l'eau ou l'alcool après tel ou tel 
réactif. Quelquefois l'eau défait toute l'œuvre de la fixation, quelque- 
fois l'alcool donne lieu à des précipités qui ruinent les préparations. 
Nous tâcherons d'indiquer pour chaque cas le liquide de lavage qu'il 
convient d'employer. 

Dans certains cas, on facilitera l'enlèvement de l'agent fixateur en 
faisant les lavages à chaud. L'acide picrique, par exemple, est 
presque deux fois aussi soluble dans l'alcool à la température de 40^ 
qu'à la température ordinaire des appartements (Fol). 

Les liquides soit de fixation, soit de lavage, doivent être renouvelés 
aussitôt qu'ils deviennent troubles. 

Les objets une fois fixés et convenablement lavés peuvent être 
conservés indéfiniment dans de l'alcool (de 70 à 90 p. 100) ; mais il 
vaut toujours mieux les y laisser le moins longtemps possible. 

En fait de considérations plus spéciales, nous ferons observer que : 
l'acide osmique est à éviter pour les structures peu perméables ; 
— l'acide picro-sulfurique est à éviter pour les structures qui con- 
tiennent une proportion notable de tissu conjonctif, vu qu'il fait 
gonfler ce tissu ; il est donc, en général, peu propre à l'étude des 
organes des Vertébrés. 



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2â CHAPITRE II 

Il faut éviter Temploi d'instruments métalliques pour manier les 
objets qu*on a mis dans des solutions de sublimé corrosif, d'acide 
acétique ou de chlorure d*or, vu que les solutions de ces sels se pré* 
cipitent au contact des métaux. 

30. Fixation d'animaux marins. — On remarquera que les 
tissus des animaux marins sont en général plus réfractaires envers 
les agents chimiques que ceux des animaux terrestres ou d*eau douce 
des mêmes groupes. Il convient donc d'employer pour les animaux 
marins des solutions plus fortes (selon Langerhans^ deux ou trois 
fois plus fortes que pour les animaux terrestres). 

Outre cette précaution, il en est une autre, indiquée par Paul Mayer, 
qu'il est bon de ne pas perdre de vue. Ce naturaliste insiste avec 
raison sur la nécessité qu'il y a à débarrasser les animaux de leur* 
eau de mer avant de les mettre dans de l'alcool ou dans un réactif 
qui soit capable de précipiter les sels contenus dans l'eau de mer. 
Si Ton néglige cette précaution, ces sels se précipitent autour de 
ranimai et à la surface de ses organes en une croûte qui forme un 
obstacle, beaucoup plus sérieux qu'on ne le croirait à première vue, 
à la pénétration d'abord de l'alcool lui-même, puis des solutions 
colorantes. Comme résultat, on a des macérations des tissus et des 
colorations défectueuses. 

On évitera donc de se servir d'alcool pour la fixation des animaux 
marins ; on n'emploiera pas non plus, comme nous avons vu pro- 
poser de le faire, des solutions faites avec l'eau de mer comme 
menstrue ; mais on emploiera des solutions faites avec l'eau distillée, 
et de nature à maintenir en dissolution, et finalement à enlever, les 
sels dont nous parlons. Ces conditions se trouvent réalisées, par 
exemple, dans la liqueur de Kleinenberg et dans les liquides de 
Paul Mayer. 

31. Choix d'un fixateur. — Tout agent fixateur devrait posséder 
les propriétés suivantes : tuer aussi rapidement que possible ; ne pas 
exercer sur les tissus d'action chimique nuisible; causer le moins 
possible le ratatinement des tissus; et ne pas avoir des eficts qui 
puissent nuire aux opérations ultérieures, comme cela arrive par 
exemple lorsqu'on pratique la fixation avec des substances qui noir- 
cissent les tissus, ou les rendent cassants, ou bien qui les empêchent 
de donner les réactions voulues avec les solutions colorantes. Nous 
croyons qu'aucun des fixateurs connus n'est exempt de la totalité de 
ces défauts ; on en est réduit à choisir pour chaque cas particulier la 



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EXTENSION, FIXATION ET DURCISSEMENT t3 

méthode dont les imperfections sont les moins gênantes pour le but 
qae Ton se propose. 

Les agents fixateurs sont, ou bien un agent physique — la cha* 
leur — ou des substances qui, agissant apparemment d'une façon 
chimique, probablement en déshydratant les tissus, produisent une 
coagulation rapide de leurs principes constituants albuminoïdes, géla- 
tineux ou mùqueux. Au point de vue chimique, ces substances se 
trouvent être certains oxydes, des acides minéraux et organiques » 
certains sels des métaux lourds, certains chlorures, l'iode, TalcooL 
Au point de vue pratique, il conviendra de grouper ces substances de 
diverses façons. S'agit-il d'obtenir une bonne fixation, ce sont Tacide 
osmique, Tacide chromique, et surtout les mélanges de ces deux 
substances, puis le chlorure d'or, qui tiennent le premier rang* 
S'agit-il, au contraire, d'une grande puissance de pénétration, telle 
que le demande la fixation des pièces très volumineuses, on préfé- 
rera dans beaucoup de cas à tous ces réactifs un mélange picrique. 
S'agit-il enfin, comme c'est en général le cas, de pouvoir produire 
ensuite de belles colorations, sans trop de peine, par les méthodes 
ordinaires, on trouvera que ces réactifs se groupent à peu près 
comme suit (nous ne citons ici que les réactifs qui sont d'un emploi 
général) : 

Fixateurs qui ne gênent pas les Fixateurs qui gênent les cohraiions^ 
colorations. 

Chaleur. Mélanges de Flemming. 

AlcooL Acide chromique. 

Subhmé corrosif. Chromate d'ammoniaque. 

Acide nitrique. Bichromate de potasse. 

Nitrate d'argent en solution faible. Nitrate d'argent en solution forte. 

Osmium en vapeur. Osmium en solution. 

Acide picrique et mélanges picriques. Chlorure de palladium. 

Solution de Merkel. Chlorure d'or. 
Sels d'uranium. 

En donnant cette liste, nous ne voulons nullement donner à entendre 
que l'emploi des réactifs mentionnés dans la liste de droite porte 
atteinte à la qualité des colorations qu'on peut obtenir ensuite par 
les procédés ordinaires ; mais uniquement qu'ils les rendent tellement 
difficiles que l'opérateur se voit souvent obligé d'avoir recours à des 
colorants spéciaux autres que ceux qu'il aurait désiré employer s'il 
n'était pas ainsi limité dans son choix. 

L'acide osmique est, de tous points, l'un des meilleurs fixateurs qui 
soient connus; mais, outre qu'il a l'inconvénient de s'attacher obsli- 



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24 CHAPITRE II 

nément aux éléments des tissus d'où Ton ne peut le déloger que difCci- 
lement par des lavages répétés et où il a une grande tendance à se 
réduire et à noircir les préparations ; il a aussi le défaut d'avoir une 
très faible puissance de pénétration, ce qui fait qu'il ne convient en 
aucune façon pour des objets tant soit peu volumineux. 

Dans bien des cas, il convient, pour des raisons de ce genre, de 
choisir un réactif qui n'a peut-être pas les émînentes qualités de fidé- 
lité de fixation que possèdent l'osmium et l'acide chromique, mais qui, 
en ne mettant pas d'obstacle aux opérations ultérieures, donne en 
définitive des préparations plus généralement utiles. Tels sont les 
mélanges picriques et l'acide nitrique, qui se laissent entièrement 
enlever des tissus par le lavage à l'alcool, et permettent d'obtenir 
facilement les colorations les plus précises; tel est le sublimé cor- 
rosif, qui, loin de gêner les colorations, les facilite dans la plupart 
des cas. L'alcool est un réactif des plus agréables à employer, et 
peut rendre des services dans des cas qui ne demandent pas une fidé- 
lité minutieuse de fixation. La solution de Merkel est un excellent 
réactif pour les pièces petites et délicates, mais son action est trop peu 
énergique pour que nous puissions la recommander pour le travail 
ordinaire. Les sels chromiques sont quelquefois excellents, et sont 
tout spécialement indiqués pour la préparation des centres nerveux 
des Vertébrés. 

L'osmium en vapeur ne peut guère être employé que pour des 
structures membraneuses ou, du moins, très petites. La chaleur donne 
des résultats qui laissent un peu à désirer sous le rapport de la con^ 
servation des détails délicats ; on ne s'en sert donc qu'en cas de néces» 
site absolue. 

On hésite à formuler des règles géùérales en une matière où il y a 
tant d'exceptions obligées. Nous dirons cependant qu*il y a deux de 
ces réactifs qui sont généralement employés et que nous recomman- 
dons tout spécialement pour les travaux ordinaires d'anatomie micros- 
copique et d'embryologie : ce sont le mélange de Flemming et le 
sublimé corrosif. C'est bien le mélange de Flemming qui, en général, 
nous a donné de beaucoup les meilleurs résultats. Mais son emploi 
gêne à un certain degré les opérations ultérieures, et pour ce motif il 
nous semble que le sublimé conviendra souvent mieux à l'étudiant 
débutant. C'est un excellent réactif, presque, sinon tout à fait, de 
premier ordre, et c'est un de ceux qui gênent le moins les opérations 
ultérieures. 

82. Durcissement. — Nous avons expliqué que dans la marche 



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EXTENSION, FIXATION ET DURCISSEMENT 125 

normale de la préparation des objets pour l'inclusion dans la paraf- 
fine ou dans la celloïdine, ou pour le montage direct dans le baume, 
les pièces passent à travers des alcools successivement très forts, pour 
se trouver à la fin complètement déshydratés par l'alcool absolu. 
Dans la plupart des cas, ce traitement sufBt pour communiquer aux 
tissus la consistance voulue pour les coupes ou pour les dissections. 
Mais il est des objets qu'il ne suffit pas de traiter selon cette méthode. 
Pour des objets très volumineux, tels que l'encéphale humain, ou les 
embryons humains de trois mois et plus, il ne saurait être question 
de fixation dans les règles. Ces objets n'arrivent en général entre les 
mains de l'anatomiste que plusieurs heures après la mort du sujet qui 
les fournit. Et d'ailleurs, des pièces aussi volumineuses ne se laissent 
pénétrer par aucun réactif avec une rapidité qui suffirait à assurer la 
fixation précise des éléments dans l'état où ils se trouvent pendant la 
vie. De plus, pour ces pièces très volumineuses nous sommes souvent 
forcés de renoncer à l'inclusion par infiltration ; on comprend faci- 
lement que l'encéphale humain ne saurait être infiltré de parafQne 
en un laps de temps raisonnable. Et même parmi les petits objets 
nous en trouvons qui n'acquièrent pas une bonne consistance pour 
les coupes par le simple passage à travers les alcools. Dans tous ces 
cas on a recours à l'action de réactifs durcissants. 

88. Pratique des durcissements. — On prend pour règle 
générale de commeitcer toujours le durcissement avec des réactifs 
diltiés; on en augmente la concentration à mesure que les tissus se 
trouvent, par suite du durcissement qu'ils ont acquis, en état de sup- 
porter une action plus énergique. 

11 importe beaucoup que le volume du liquide durcissant soit con- 
sidérable relativement à celui de l'objet à durcir, ou du moins qu'il 
soit très fréquemment renouvelé. Car autrement, les substances des 
tissus, qui viennent à en sortir par diffusion, se mélangent au liquide 
durcissant, et, si celui-ci n'est pas en volume suffisant, en altèrent la 
composition à tel point qu'il n'agit plus de la manière voulue ; il peut 
même, en se chargeant de ces substances, exercer une action macé- 
rante, résultat directement opposé à ce que l'on désire réaliser par le 
durcissement. De plus, on observera qu'aussitôt que, en se chargeant 
de ces substances, le liquide extérieur est devenu d'une composition 
semblable, sous le rapport de la proportion de substances colloïdes 
et cristalloïdes qu'il contient, à celle du liquide qui baigne les tissus, 
la diffusion doit nécessairement cesser, l'équilibre osmotique étant 
établi ; et le liquide durcissant ne pénètre plus. D'autre part, il parait 



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'Tfyrv^ 



M CHAPITRE II 

que la présence d'une faible proportion de colloïdes dans le liquide 
durcissant est favorable à la bonne consistance des tissus, en les 
empêchant de devenir friables. Il faut trouver par Texpérience les 
proportions qui conviennent pour chaque objet et pour chaque 
réactif: tout ce que nous pouvons faire ici, c*est d'insister sur Tim- 
portance de remploi d'une quantité convenable de réactif. 

Il est bon d'employer, pour les durcissements, des récipients cylin- 
driques, et d\v suspendre les objets avec un fil, de telle sorte qu'ils se 
trouvent malnteaus vers le haut du liquide. De cette façon, ils se troa- 
vent entoures d'une atmosphère de liquide durcissant aussi pure que 
possible, les substances extraites des tissus s'y répandant par diffusion 
plus librement, et les précipités qui peuvent se former dans le liquide 
allant gagner le fond. 

On veille avec soin à ce que Taclion du réactif durcissant ne soit 
pas prolongée au delà du temps qui est strictement nécessaire pour 
donner aux tissus une consistance suffisante ; autrement les tissus 
deviennent friables, et les colorations deviennent de plus en plus dif- 
ficiles. 

34, Réactifs durcissants. — Ces réactifs sont en général essen- 
tiellement de même nature que ceux que nous employons pour la 
fixation ; seulement on les emploie pour le durcissement sous forme 
de solutions beaucoup plus étendues, et l'on met à profit surtout ceux 
d*en^re les fixateurs dont l'action est la plus douce et la plus égale. 
Ce sont principalement l'acide chromique, puis les sels de chrome et 
des chlorures. On emploie en général l'acide chromique toutes les fois 
qu'on désire surtout arriver à un durcissement très rapide. Si au con- 
traire on vise surtout la bonne consistance des pièces, on a recours à 
un sei de chrome. Nous donnons, dans la deuxième partie, des détails 
sur le durcissement des divers organes qui le demandent. C*est sur- 
tout le cas pour le système nerveiuc central. Les formules les plus 
usitées de réactifs durcissants, avec les explications voulues relatives 
à leur action sur les tissus et à la manière de s'en servir, se trouvent 
dans les paragraphes consacrés aux ageints fixateurs. Ces deux genres 
de réacUrs étant, comme nous Tavons dit, essentiellement identiquest 
il n'y a pas d'inconvénient à les traiter ensemble. Nous éviterons 
aussi bien û%% redites. Et de cette façon, le chapitre spécial que, 
dans la première édition nous avions consacré à ce sujet sous le titre 
de RÉACTIFS DURCISSANTS nc nous sera plus nécessaire, son contenu 
ayant été distribué comme nous l'avons dit plus haut. Le chapitre des 
RÉACTIFS DURCISSANTS cst donc Supprimé, 



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-i^^^'jrvsi.. '-JJ:JLII|}l5^«S55^-fc!|P!*-^fl*;,U' ■' 



CHAPITRE III 

AGENTS FIXATEURS ET DURCISSANTS 

ACIDES MINÉRAUX ET LEURS SELS 

35. Tétroxyde d'osmium (acide osmique). — La substance 
connue dans les laboratoires sous le nom d'acide osmique n'est pas, 
strictement parlant, un acide, car elle ne contient pas de H, et ne 
rougit pas le papier de tournesol- C'est le tétroxyde d'osmium, Os 0*, 
seul composé un peu stable de ce métal, à ce que nous croyons. Elle 
est extrêmement volatile,, et sa solution aqueuse se réduit avec une 
extrême facilité par le contact avec des substances organiques. 

On croit généralement que la lumière seule suffit à réduire les solu- 
tions d'acide osmique. C'est là une erreur ; nous avons vu maintenir 
un flacon de cette solution pendant six mois exposé au soleil du Midi, 
sans qu'il se fût produit le moindre précipité. Mais le moindre grain 
de poussière organique suffit à déterminer la réduction. 

On sait que les vapeurs osmiques ont une action très irritante sur 
les muqueuses ; elles provoquent facilement chez certains sujets de 
sérieux catarrhes, irritations des bronches, catarrhes laryngiens, 
conjonctivites, etc. Nous croyons qu'il y a un peu d'exagération dans 
ce qui a été dit à ce sujet, mais on fera bien de ne pas oublier que 
ces vapeurs possèdent certainement plus ou moins ces propriétés 
irritantes, et les personnes susceptibles devraient user de plus de 
précautions à cet égard que les autres. 

36» Conservation des solutions osmiques. ~ Après avoir 
essayé bon nombre des méthodes qui ont été recommandées pour 
éviter la contamination des solutions par la poussière, je me suis 
arrêté à la pratique suivante i 



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28 



CHAPITRE m 



Le Lé Lr oxyde dissous dans de Teau additionnée d'acide chromique 
n'esL plus facilement réductible par la poussière de Tair, comme Test 
celui qui est dissous dans de Teau pure, et Ton peut le conserver 
sans aucuoe précaution spéciale (si ce n*est qu'il faut naturellement 
employer, en vue de la grande volatilité de la solution, des flacons 
bien bouchés à Témeri). Je conserve donc la majeure partie de ma 
provision sous forme d'une solution à 2 p. 100 dans de la solution 
d'acide chromique ai p. 100. Cette solution sert pour la Gxation au 
moyen des vapeurs ; elle sert aussi pour fabriquer la liqueur de 
Flemminû qui est certainement le liquide osmique usuel le plus 
employé de beaucoup. 

On jteut aussi préparer une petite quantité de solution aqueuse à 
1 p. 100 (ce qui permet de préparer facilement les solutions plus 
diluées et les mélanges, à mesure qu'on en a besoin), et la conserver 
avec le plus grand soin à Tabri de la poussière. Il est bon aussi d'avoir 
une petite provision de tétroxyde en nature ; cela est commode pour 
les fixations par les vapeurs. 

Il va sans dire qu'on ne doit jamais puiser dans les flacons avec 
une pipette. 

CoHî [Zeit. f, wiss, Mik.^ VI, 4, 1890, p. 442) dit que les solutions 
dans l'eau distillée se conservent parfaitement bien, si l'on y ajoute 
assez de perrHanganate de potasse pour produire une légère teinte 
rosée, et si l'on a soin de renouveler de temps à autre l'addition de 
permanganate de manière à maintenir la teinte rosée. 

Il sera peut-être utile de noter qu'on trouve maintenant chez les 
fournisseurs (du moins chez GrQbler, à Leipzig) de l'acide osmique en 
tubes à un dixième de gramme, qui seraient certainement bien sou- 
vent beaucoup plus commodes que les anciens tubes à 1 gramme. 

37. Régénération des solutions réduites. — On a proposé (Bristol, 
Amer. NaL, XXVII, 1893, p. 175; Journ. Roy. Mie. Soc, 1893, p. 564; 
Ref, IfandbookMed. Sci. Supp., p. 442) de régénérer les solutions réduites 
eu les oxydant par le peroxyde d'hydrogène. La réaction serait identique k 
celle i]ui a lieu lors du blanchiment des tissus par le peroxyde. Le tétroxyde 
d'osmium, OsO* est censé se réduire au contact de la matière organique 
CQ tlLutiixyde, OsO*. Alors, OsO* + 2H«0* = OsO* + 2H*0. Bristol dit 
avoir tiijuvé que pour régénérer ainsi 100 ce. de solution à 1 p. 100 (erra- 
lim t 10 p, 100 » dans Jow*n. Roy. Mie. Soc., l. c.) de tétroxyde d'osmium, 
il faut y ajouter 10 à 20 gouttes de peroxyde d'hydrogène frais. L'équation 
chimique de l'auteur parait bien exacte, mais il ne me semble pas prouvé 
qut^ celle réaction se réalise ainsi dans la pratique. 

KoLossow (Zeil. f. wiss. Mik., IX, 1, 1892, p. 40) dit que les solutions à 
demi réduites, tant qu'elles n'ont pas perdu leur odeur caractéristique, 



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Qoo^^ 



AGENTS FIXATEURS ET DURCISSANTS 29 

peuvent être régénérées par Taddition d'une petite quantité d'alun de 
potasse en poudre. 

38. Fixation par les vapeurs osmiques. — C'est la OxaËîon 

par les vapeurs osmiques qui est à la fois le procédé le plus com- 
mode et, en général, le plus efficace. Ainsi employé, l'acide osmique 
se montre beaucoup plus pénétrant, et donne des fixations beaucoup 
plus égales que quand on l'emploie en solution. Pour les cas où, 
comme pour les recherches sur les noyaux, on désire combiner 
l'action d'un acide organique avec celle du fixateur, il est facile 
d'employer les vapeurs dégagées d'un mélange d'acide osmiquc et 
d'acide formique ou d'acide acétique glacial (Gilson, La Cellule, I, 
1885, p. 96). Les objets très petits (Infusoires, cellules isolées) 
peuvent être placés sur un porte-objets qu'on renverse au-dessus du 
-goulot d'un flacon contenant l'acide osmique ou le mélange. II suffit 
de quelques instants pour fixer de pareils objets. Des membranes ou 
des organes plus volumineux peuvent être fixés avec des épingles au 
fond d'un bouchon fermant le flacon qui contient le réactif. On les 
enlève aussitôt qu'ils commencent à brunir ; cependant, pour fixer 
des parties profondes, on peut prolonger la réaction pendant plu^ 
sieurs heures. 11 est bon de laver les pièces à l'eau avant de procéder 
à la coloration, mais ces lavages n'ont pas besoin d'être poussés 
aussi loin que pour les pièces fixées dans les solutions. Nous 
recommandons, comme colorants, le vert de méthyle pour les pièces 
destinées à être étudiées dans un milieu aqueux ; puis, pour les 
préparations au baume, le carmin à l'alun, le picrocarmtn, ou 
l'hématoxyline préparée selon la formule que l'on préfère- 

• 89. Fixation par les solutions osmiques. — Lorsqu'on se 

sert de l'acide osmique en solution, on emploie des concentrations 
variant de 0,05 à 2 p. 100, mais la tendance de la pratique récente 
paraît être d'employer des concentrations plus faibles. On prend, 
par exemple, pour les Infusoires, uqe solution de 0,8 p. 100, qu'on 
laisse agir pendant quelques secondes seulement ; pour les Porifères, 
0,08 à 0,10 p. 100 pendant quelques heures ; pour les organes des 
Mollusques, 1 à 2 p. 100 jusqu'à vingt-quatre heures, selon le 
volume des pièces ; pour les épithéliums en général, 0,1 à 0, 8 p, 100, 
pendant une heure (nous donnons des généralisations de la pratique 
telle que nous la trouvons rapportée dans la littérature ; — pour 
•notre part, nous croyons que c'est là une fixation tout à fait exagé- 
rée) ; — pour les œufs méroblastiques, 0,1 p. 100, pendant vingt- 
(Juatre heures (nous pensons qu'ici il n'en faut pas moins) ; — pour 



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30 GtlAPlTRE III 

les tubes nerveux à myéline, 0,1 à ï p. 100, pendant vingt minutes 
ou jusqu'à deux heures, selon les cas ; — pour les corpuscules tactiles^ 
0,33 à 1 p. 100, vingt-quatre heures ; — rétine, 0,25 à 2 p. 100, 
-dix minutes à vingt-quatre heures (selon Tétat de division des pièces, 
et les éléments qu'on désire étudier) ; — pour les noyaux en général, 
0,1 à 2 p. 100, pendant deux ou trois heures (pour des cellules iso- 
lées, cela nous paraîtrait exagéré). 

Oq peut addilionner les solutions d'autres substances dans le but de les 
rendre plus pénétrantes. Ainsi on peut les mêler à l'alcool (Ranvier et 
ViGNAL). (Ranvier, Leçons cTAnat, Gén,, App, term. des muscles de la 
vie organique, p. 76. Vigçial, Archives de PhysioL, 1884, p. 181). — On fait 
un mélange, à volumes égaux, d'acide osmique à 1 p. 100 et d'alcool à 
90 p. 100. — On le laisse agir, pour des objets pas trop gros — des embryons 
de quelques millimètres — pendant une heure ou deux. On lave pendant 
quelques heures dans de l'alcool à 80 p. 100, pour que la réduction de l'os- 
mium continue. Pui& on peut laver à l'eau et colorer (quarante^huit heures) 
dans le picro-carmin ou l'hématoxyline. Cette méthode donne d'excellents 
xésultats. Viallanes Ta appliquée avec fruit à l'histologie des Insectes. 

KoLOSSOW (Zeit' f, wiss, Mik., V, 1, 1888, p. 51) recommande une solution 
de 0,5 p. 100 d'acide osmique dans une solution de nitrate ou d'acétate 
d'urane à 2 ou 3 p. 100, le nitrate étant à préférer. Cette méthode s'applique, 
-dit-il, avec avantage aux imprégnations nerveuses. 

Mann (Zeil, f. wiss. Mik.y XI, 4, p. 481) recommande un mélange fraî- 
chement préparé de volumes égaux d'acide osmique à 1 p. 100 et d'une 
solution saturée de sublimé corrosif dans de la solution physiologique de 
sel (pour centres nerveux). 

Si la flxation demande une immersion prolongée, elle doit être 
pratiquée dans un récipient bien clos, et tenu à l'abri de la lumière. 

L'osmium colore en un noir des plus intenses toutes les substances 
graisseuses ; il convient donc de s'en servir avec beaucoup de précau» 
tion dans la préparation de pièces qui contiennent beaucoup de tissu 
adipeux. 

40. Traitement ultérieur. — Les pièces fixées dans les solutions 
osmiques doivent être très soigneusement lavées à l'eau. On peut 
prolonger les lavages aussi longtemps qu'on veut, l'eau n'étant nulle- 
ment nuisible aux pièces ainsi fixées. On peut également employer 
la glycérine diluée. Nonobstant les soins les plus minutieux apportés 
au lavage, il n'arrive que trop souvent qu'il reste des traces de la 
solution osmique dans les tissus; alors les préparations noirciront 
sûrement avec le temps. On peut plus ou moins prévenir ce noircisse- 
ment en traitant les tissus avec des liquides légèrement alcalins. 
Schultze préconisait à cet effet l'acétate de potasse, qu'il employait 



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^ÎJip 



AGENTS FIXATEURS ET DURCISSAISTS 31 

comme milieu conservateur ; nous croyons cependant que cetle 
méthode n'est nullement infaillible. Fol recommande de laver avec 
une solution trës faible de carbonate d'ammoniaque. La simple 
immersion, pendant le temps voulu par la coloration, dans du carmin 
à Tammoniaque, ou même dans le picro-carmin, produit un tïïei 
semblable. Enfin, une méthode excellente est de mettre les pièces 
pendant vingt-quatre heures, ou plus, dans une solution de bichro- 
mate de potasse (soit dans la solution de MUlIer ou celle d'Erlickî], 
ou dans une solution faible (0,5 p. 100) d'acide chromique, ou dans 
la solution de Merkel, ou enfln dans une solution faible de ferro- 
cyanure de potassium ou de cyanure de potassium. Le traitement par 
les solutions de bichromate a l'avantage de faciliter beaucoup la 
coloration par les carmins ou Thématoxyline. Les pièces déjà noircies 
peuvent être décolorées par Tune ou l'autre des méthodes que noua 
exposons au chapitre traitant des procédés de BLANcaiMENT, parmi 
lesquelles les procédés au peroxyde d'hydrogène seront des plus 
efGcaces. 

OvERTON (Zeit. f. wiss. M/c., VII, 1, 1890) trouve que le blanchiment 
nécessaire peut s'effectuer en quelques minutes en un mélange d*une 
partie de peroxyde du commerce avec 10 à 25 parties d'alcool â 
70 p. 100. 

Nous recommandons les mêmes colorants que nous avons indîquéa 
pour les objets flxés à la vapeur d'osmium. Pour les fixations légères, 
le carmin à l'alun est excellent; mais pour les tissus un peu brunis 
il est souvent nécessaire d'avoir recours à un colorant plus énergique. 
En ce cas, on pourra employer avec avantage une coloration à 
l'hématéine (hématoxyline). 

41. Acide chromique. Fixation. — L'anhydride chromique, 
CrO', se trouve dans le commerce sous forme de cristaux rouges qui 
se dissolvent dans l'eau en formant de Tacide chromique, H^Crû^ 
Ces cristaux étant extrêmement déliquescents, il est nécessaire de les 
conserver dans des flacons parfaitement bouchés à l'émeri. Il faut 
également avoir soin d'en tenir éloignées jusqu'aux moindres pous- 
sières organiques, le CrO' étant une substance qui se réduit très rapi* 
dément en sesquioxyde au contact des matières organiques. Nous 
recommandons d'en faire une solution à 1 p. 100, qui permet de pré- 
parer rapidement les mélanges et solutions plus allongées à mesure 
qu'on en a besoin. 

Pour les fixations, on emploie en général des solutions de 0,1 
p. 100, ou moins, jusqu'à 1 p. 100* On peut prolonger l'immersion 



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32 CHAPITRE III 

pendant plusieurs heures (objets embryologiques, quelques cellules). 
Les solutions très fortes, 2 à 8 p. 100, ne doivent agir que pendant 
très peu de temps. Pour les tissus nerveux, on prend des solutions 
très diluées, 0,02 à 0,125 p. 100, et on les laisse agir pendant plusieurs 
heures. 
Pour le traitement ultérieur, voyez au numéro suivant 

' Pour les durcissements, on emploie, en général, des solutions de 0,2 à 
0,5 p. iOO, dans Teau. La durée de la réaction est de quelques jours à 
quelques semaines, selon la nature de l'objet. En général, on peut dire de 
l'acide chromique qu'il agit avec une très grande rapidité. 11 permet d'ob- 
tenir en quelques jours un degré de durcissement qu'on n'obtiendrait pas 
en plusieurs semaines, par ezeihple, avec le bichromate de potasse. Les 
membranes muqueuses s'y durcissent d'une manière satisfaisante en deux 
ou trois jours, le cerveau en six semaines environ. D'après Ranvier, il faut 
prendre, pour des fragments de tissu de 1 centimètre de côté, 200 grammes 
de liquide. Cet auteur dit en outre qu'on ne doit jamais employer des 
fragments ayant plus de 3 centimètres de côté, si l'on veut obtenir les 
meilleurs résultats. Pour durcir une moelle épinière d'Homme, il faut 
prendre deux litres de liquide, et le renouveler au bout de quelques jours. 
Il faut six semaines à deux mois pour compléter le durcissement. 

Ainsi que nous l'avons déjà dit, on commencera par des solutions très 
faibles, dont on augmentera graduellement la concentration, si cela est 
nécessaire ; et l'on veillera surtout à enlever les objets de la solution aussitôt 
qu'ils ont acquis une consistance suffisante. Gela est particulièrement 
important dans le cas de l'acide chromique, qui a le défaut de rendre les 
objets très cassants pour peu que son action soit prolongée. On doit les 
laver à l'eau, et les mettre pour la conservation dans l'alcool à 90 degrés, 
(Mais voyez à ce sujet le paragraphe suivant.) 

L'acide chromique est un durcissant de premier ordre ; son grand défaut 
est la facilité avec laquelle il rend les tissus cassants. 

Les solutions d'acide chromique ne sont pas très pénétrantes, il 
convient donc d'employer des objets aussi petits que possible. Et pour 
cette raison aussi, il conviendra le plus souvent de ne pas employer 
l'acide chromique pur, mais l'un des mélanges avec Tacide acétique, 
l'acide osmique, Tacide picrique, Tacide nitrique, que nous allons 
décrire plus bas. 

C'est surtout sous forme de ces mélanges que l'acide chromique se 
montre comme étant un des fixateurs les plus fidèles que nous con- 
naissions. Il a le grand défaut de gêner beaucoup les colorations. Ce 
défaut est moins sensible avec les mélanges qu'avec l'acide pur. Ces 
mélanges ont aussi l'avantage d'atténuer un autre défaut de ce réactif, 
défaut qui consiste en ce qu'il précipite certains principes consti- 
tuants^ liquides^ des tissus sous forme de filaments ou de réseaux. 
Ces réseaux sont souvent d'une régularité remarquable, et ont été 



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I ■HWi 



AGENTS FIXATEURS ET DURCISSANTS 33 

plus d'une fois décrits comme étant des éléments histologiques nor- 
maux. 

L'action de Tacide chromique sur les éléments des tissus est tout à 
fait particulière ; il ne les coagule pas simplement, mais forme avec 
certaines de leurs substances constituantes des combinaisons chi- 
miques insolubles. C'est une sorte de tannage. On comprend donc 
l'impossibilité de l'éloigner entièrement par les lavages, et la diffi- 
culté qu'on éprouve à obtenir de bonnes colorations par les méthodes 
ordinaires. 

42. Acide chromique. Traitement ultérieur. — On lave à 
l'eau, et avec grand soin. L'eau doit être souvent renouvelée. Il peut 
être bon de mettre les objets pendant vingt-quatre heures au-dessous 
d'un robinet. Des lavages même beaucoup plus prolongés ne nuisent 
pas aux objets fixés par l'acide chromique. Pendant l'été il peut être 
utile d'ajouter un antiseptique quelconque (un morceau de camphre 
ou un cristal de thymol) à l'eau, pour prévenir le développement 
d'Infusoires. 

Au besoin, on peut également laver à l'alcool au tiers, et même 
avec des alcools plus forts. Nous n'admettons pas la nécessité absolue 
d'employer Teau dans tous les cas. 

Les meilleurs colorants sont l'hématoxyline et les anilines em- 
ployées selon la méthode de Flemming. 

Les objets qui ont été plongés pendant un certain temps dans les solutions 
diacide chromique (ou des sels de cet acide) acquièrent une coloration vert 
brun, due à une réduction partielle de Tacide chromique dans les tissus. On 
peut faire disparaître cette coloration en traitant les pièces par le peroxyde 
d'hydrogène, qui leur rend la couleur jaune propre de Tacide chromique 
(Unna, Arch, f. mxL AnaL, XXX, 1887, p. 47 ; Journ, Roy. Mie. Soc, 1887, 
p. 1060). Le lecteur voudra bien comparer ce que nous avons dit de Ja 
décoloration des pièces osmiques, plus haut, n* 40. 

42 bû. Action de la lumière sur ralcool contenant des objets 
ohromiques. — Lorsqu'on met dans Talcool, pour la conservation ou 
pour le durcissement, des tissus qui ont été traités par Tacide chromique 
ou par un chromate, il se forme toujours, au bout de peu de temps, dans 
Talcool un fin précipité qui se dépose à la surface des préparations et forme 
sans doute un obstacle plus ou moins grand à la pénétration de Talcool. 
Le lavage préalable à Teau n'empêche pas la formation de ce précipité ; et le 
renouvellement de Talcool ne Fempéche pas de se reformer à plusieurs 
reprises. Hans Virchow a trouvé (Arch, /*. mik, Anat,, XXIV, 1885, p. 117) 
qu'on évite entièrement celte formation en prenant la précaution bien 
simple de maintenir les préparations dans l'obscurité. L'alcool s'y colore 
comme d'habitude en jaune, mais aucun précipité ne se forme. Virchow 

ANAT. UICROSC. W 



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34 



CHAPITRE III 



pense, d'après ses expériences, qu'en prenant cette précaution on peut sans 
inconvénient omettre, ou du moins abréger de beaucoup, le lavage à J'eau 
auquel on soumet habituellement les objets avant de les transporter dans 
TaLcool. Mais il ne faut pas pour cela négliger l'ancienne règle de renouveler 
Falcool à mesure qu'il prend la coloration jaune. 

43. Acide chromique et alcool (E. Klein, Quart, Joum. Mie, Science, 
1879, p. 126-7). — A deux volumes de solution d'acide chromique à 
1/0 p. 100, on ajoute 1 volume d'alcool ordinaire. Klein s'est beaucoup 
servi de ce mélange comme fixateur dans ses recherches cytologiques, et a 
trouvé qu'il donnait souvent de meilleurs résultats que les fixateurs ordi- 
naires (y compris l'osmium). Colorer à Thématoxyline. 

Nous pensons qu'il peut y avoir souvent utilité d'ajouter de l'alcool aux 
solutions d'acide chromique, pour en augmenter la puissance de pénétra- 
tion. Nous avons été un peu surpris en ne trouvant pas que de pareils 
mélanges aient été employés par aucun autre observateur que Klein. 

44. Acide chromique et alcool [Liquide de Urban Pritciiard). — 
Acide chromique, 1 partie; eau, 20 parties ; esprit-dc-vin, 180 parties. — On 
Tait dissoudre l'acide chromique dans l'eau, et on ajoute l'esprit-de-vin. (Si 
Von ajoute directement l'alcool à l'acide chromique, il se produit une réac- 
tion d'une grande violence.) La solution prend bientôt une coloration bru- 
nu ire. Si, au bout de quelques jours, elle prend une consistance un peu 
gélatineuse, il faut la renouveler. 

Ce liquide est particulièrement propre, selon Pritchard, au durcissement 
fj 'organes tels que la rétine, le limaçon. La durée de la réaction pour ces 
objets est de sept à dix jours. (Voyez Quart. Joum. Mie, Science, 1873, 
p. 427.) 

45. Acide chromo-acétique (Flemming, Zellsbz,, Kern,-u.-Zellth,, 
p, 381). — Il est reconnu qu'il y a très souvent avantage à ajouter 
auK solutions d'acide chromique un peu d'acide acétique ou formique. 
Cela est favorable à la démonstration des éléments nucléaires en 
général, et surtout à la démonstration des figures achromatiques de 
la caryokinèse. Flemming recommande (surtout pour ce dernier objet) 
Taddilion de environ 0,1 p. 100 d'acide acétique à une solution 
diacide chromique de 0,2 à 0,25 p. 100. Colorera Thématoxyline. Ce 
mélange ne donne pas de préparations favorables pour la coloration 
uvec la safranine ou d'autres couleurs d'aniline. (Loc. cil,, p. 382.) 

Voici une formule due à Ehlërs que je puis recommander comme 
excellente pour la conservation de beaucoup d'Annélides (vraisem- 
blablement aussi pour d'autres organismes). — A 100 ce. d'acide 
chromique d'une concentration de 0,5 à 1 p. 100 on ajoute de 1 à 
5 gouttes d'acide acétique crislallisable. La proportion indiquée 
d'acide acétique est sufOsanle pour neutraliser l'action ratatinante de 
l'acide chromique. 



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AGENTS FIXATEURS ET DURCISSANTS 35 

45 bis. Acide picro-chromique (Fol, Lehrb.y p. 100). 

Acide picrique, sol. concentrée dans Teau. 10 volumes. 

Acide chromique à 1 p. ^ 00 25 — 

Eau 65 — 

Au moment de s'en servir, on peut ajouter environ 0,006 d'acide 
osmique, ce qui en rend l'action plus énergique. Laver légèrement à 
l'eau (qu'il vaut mieux prendre chaude, presque bouillante), puis à 
fond avec de l'alcool. 

Fol dit, loc. cit, : c Ce réactif durcit les tissus d'une manière admi- 
rable, sans gêner en aucune façon les colorations; mais il a peu de 
puissance de pénétration et ûxe lentement, et pour cela ne peut 
être recommandé que pour des objets peu volumineux. » 

Il me semble que ce liquide pénètre mieux que ne le pensait Fol. 
Il donne de très bons résultats avec des Annélides, et peut rendre de 
bons services pour des objets destinés à être montés en entier. 

Ce liquide, avec l'addition d'un peu d'acide acétique, a été cité 
comme c liquide de Haensel >, je ne sais pas de quel droit. 

46. Aoide ohrozno-formique (Rabl, MorphoL Jahrb., X Bd., 1884, 
p. 215-6). — A 200 grammes d'une solution d'acide chromique de 
0,33 p. 100, ajoutez 4 ou 5 gouttes d'acide formique concentré. Le mélange 
doit être fraîchement préparé au moment de s'en servir. Fixer pendant 
douze à vingt-quatre heures, laver à Teau, durcir ensuite graduellement 
dans Talcool. Colorer à Théroatoxyline ou à la safranine. 

47. Mélange chromo-osmique (Max Flesch, Arch. f. mik. 
Anat,, XYI, 1878, p. 300). — En combinant les solutions d'osmium 
et d'acide chromique, on produit un mélange qui est stable (ne se 
réduisant pas facilement), qui Qxe en général mieux que l'une ou 
l'autre de ces solutions employée seule, et qui permet d'y laisser des 
tissus pendant vingt-quatre à trente-six heures sans qu'ils se noir- 
cissent par l'osmium d'une manière excessive. Ce mélange a aussi 
l'avantage d'être d'une utilité très générale ; il peut être employé 
avec toutes sortes d'objets. On remarquera qu'il permet de combiner 
d'une manière utile l'action foudroyante de l'osmium avec l'action 
durcissante plus lente, mais plus égale, et pour cela peut-être plus 
Adèle, de l'acide chromique. 

Max Flesch recommande un liquide composé de 0,1 partie d'acide 
osmique et 0,â5 partie d'acide chromique pour 100 parties d'eau. 

48. Mélange chromo-acéto-osmlque. Liquide de Flemmino 
Ancienne formule^ mélange faible {Zellsubstanz.^ Kern-u^-Zellthei- 



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M CHAPITRE m 

lunffj 1882, p. 381). — A la suite d'une élude approfondie des pro- 
priétés du mélange de Max Flesch, Flemming trouva qu'il était sus- 
ceptible d'amélioration, surtout pour les études cytologiques. 11 
reconnut que l'addition d'un peu d'acide acétique ou formique a pour 
efl'et non seulement de mieux différencier les éléments achromatiques 
des noyaux, mais, ce qui est encore plus important, de favoriser 
beaucoup les colorations avec l'hématoxyline, les carmins, ou les 
couleurs d'aniline. Il recommande donc d'ajouter au mélange de 
Max Flesch 0,1 p. 100 d'acide acétique glacial, soit la formule : 

Acide chromique 0,25 p. 100 \ 

Acide osmique 0,1 — J dansTcau^ 

Acide acétique glacial .... 0,1 — ; 

Flemming fait observer qu'il obtient les meilleurs résultats, comme 
fidélité de fixation des éléments cellulaires, avec des immersions de 
peu de durée, une demi-heure au maximum. Il lave à l'eau, et colore 
à rhêmatoxyline ou avec une couleur d'aniline. Je suis cependant 
bien convaincu que très souvent on obtient des résultats meilleurs 
avec des fixations beaucoup plus prolongées, jusqu'à vingt-quatre ou 
quaraale-huit heures ou plus. . 

H n'est pas nécessaire de s'en tenir toujours aux proportions exactes de 
la Tormule que nous venons de donner ; aiosi Fol {Lehrb, d. vergL mik. 
Anat.y 1884, p. 100) conseille un mélange beaucoup plus faible en osmium 
que celui de Flemming. Il prend. 

Acide chromique à 1 p. 100 2.5 Tolumes. 

Acide osmique à 1 p. 100 2 — 

Acide acétique à 2 p. 100 5 — 

Eau 68 — 

Soit en centièmes : 

Acide chromique 0,25 p. 100 \ 

Acide osmique 0,02 — | dans Teau. 

Acide acétique 0,1 — ) 

^ Pour fabriquer ce mélange avec les solutions normales, on n*a qu*à prendre : 

Acicte chromique à 1 p. 100 23 volumes. 

Acîd« osmique à t p. iOO 10 — 

Acide acétique à 1 p. 100 10 — 

Eau» 55 — 

Si Ton conserve sa provision d'acide osmique sous forme d'une solution à 
2 p. 100 dans de Tacide chromique à 1 p. 100, comme j*ai conseillé de le faire 
plus haut (§ 36), il faut prendre seulement 20 volumes d'acide chromique, 5 de 
la solution d'acide osmique, et 65 d'eau. 



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AGENTS FIXATEURS ET DURCISSANTS 37 

Et CORi (Zeil. f, wiss, Mik.^ VI, I, 1890, p. 441) a préconisé un mélange 
contenant seulement 1 volume de solution d'acide osmique, au lieu de 2. 

Dans la dernière édition nous avons dit qu'à la suite d'expériences 
comparatives avec la formule de Flemming el celle de Fol, nous 
avions trouvé que cette dernière nous avait donné les meilleurs résul- 
tats, tant pour les tissus des Vertébrés que pour ceux des Arthro- 
podes. Nous avons trouvé la fixation tout aussi bonne, ou meilleure ; 
les pièces brunissaient beaucoup moins qu'avec le mélange de Flem- 
ming ; les lavages étaient plus faciles ; et nos pièces présentaient une 
consistance plus favorable pour les coupes. De plus, les colorations 
se faisaient bien plus facilement. Je dois dire maintenant que, pour 
ma part, après une expérience plus étendue, j'ai dû modifier ma 
manière de voir cet égard. Les mélanges plus faibles ont bien l'avan- 
tage de faciliter les colorations par les carmins, etc. ; mais comme 
fidélité de fixation je les trouve en général inférieurs aux mélanges 
plus forts, et je pense que le « Liquide fort » de Flemming dont 
nous allons parler dans le paragraphe suivant constitue en général 
un progrès. 



La modification de von Bungner (voy. Zeit, f, tviss. MiL, X, 3, 1893, 
p. 392) consiste à doubler la dose d'acide acétique recommandée par 
Flemming. U me semble au contraire qu'il y aurait plus souvent utilité à la 
diminuer. 



P 



On peut laisser les tissus des jours entiers, voire même des 
semaines ou des mois, dans l'un ou l'autre de ces mélanges, sans 
crainte de les voir s'altérer d'une manière notable. Mais plus on pro- 
longe l'immersion, et plus les colorations ordinaires deviennent dif- 
ficiles ; de sorte que les couleurs d'aniline sont presque le complément 
obligé des fixations prolongées. La pratique ordinaire est de laver 
longuement à l'eau (ou mieux, dans de l'eau courante ; — on peut 
laisser dégorger les pièces pendant une heure ou plusieurs sous un 
robinet d'eau ordinaire), et de colorer à l'hématoxyline ou avec une 
couleur d'aniline. Les pièces bien lavées peuvent être colorées par 
les moyens ordinaires. Nous employons par exemple souvent le car- 
min à l'alun (étendu, avec une trace d'osmium), réactif peu énergique, 
mais que nous estimons être le plus fidèle de tous les carmins. Nous 
employons aussi avec un parfait succès le carmin au borax. 

Les mélanges chromo-acéto-osmiques prennent certainement rang 
parmi les meilleurs fixateurs qui aient été imaginés. 

Plusieurs auteurs ont formulé des critiques à propos de la fidélité de 
fixation du liquide de Flemming (voyez, par exemple, Faussek, Zeit, /. wiss. 



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38 CHAPITRE III . 

Zool.j XLV, 1887, p. 694 ; Arnold, Ârch, f. mik, AnaL, XXX, 1887, p. 203 ; 
A. KOTLAREWSKY, MiUk. d. Naturf. Ges. Bem„ 1887 ou Zeit. f. wiss. Mik., 
lY, 3, 1887, p. 387). Je pense que ces critiques sont trop généralisées. Il va 
sans dire qu'il n'y a pas de réactif universel, et que le liquide de Flemming 
ne donnera pas de bons résultats si on l'emploie avec des objets auxquels 
il n'est pas adapté. Mais à cela près j'estime qu'il est de toute confiance. Son 
plus grand défaut, c'est d'être très peu pénétrant; il n'agit parfaitement 
qu'à travers une très faible épaisseur de tissu. 

49. Mélange chromo-acéto-osmique de Flemming, nouvelle 
formule^ ou € mélange fort >. (Flemming, Zeitschr. f, wiss. 
MikToskopie, 1, 1884, p. 349.) 

Acide chromique à 1 p. 100 15 parties. 

Acide osmique à 2 p. 100 4 -- 

Acide acétique cristallisable 1 — 

Si vous n'avez pas sous la main de la solution d'acide osmique à 
2 p. 100, vous pouvez prendre : 

Acide chromique à 10 p. i 00 Imparties. 

Acide osmique à 1 p. 100 80 — 

Acide acétique cristallisable 10 — 

Eau 93 — 

Ce liquide se détériore par réduction de l'acide osmique beaucoup 
plus facilement que ne le fait le € mélange faible >, ce qui est vrai- 
semblablement un effet de la plus forte proportion d'acide organique 
qu'il contient. En conséquence, je recommande la pratique suivante, 
dont je me suis toujours bien trouvé. On fait et Ton conserve à part. 

(A) Une solution contenant 

Acide chromique à 1 p. 100 11 parties. 

Eau 4 — 

Acide acétique 1 — 

et (6) une solution .d'acide osmique à 2 p. 100 dans de l'acide chro- 
mique à 1 p. 100. Pour faire le liquide définitif à mesure qu'on en a 
besoin, on n'a qu'à mêler quatre parties de A avec une partie de B. 
Ou si on le préfère, on peut se faire une provision d'acide osmique 
fit acide chromique dans les proportions indiquées par Flemming, et 
y ajouter 5 p. 100 d'acide acétique au moment de s'en servir. 

Merk {Dcnkschr, ti. Math, Naluinv. CL d, K, Acad, d, Wiss. Wien., 1887 ; cf. 

Zeil. /. ivLs. Mik., V, 2, 1888, p. 237) a proposé de faire à part une solution 

de : 

Acide chromique à 2 p. 100 7,5 parties. 

Eau 3,5 — 

Acide acétique 1 — 



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AGENTS FIXATEURS ET DURCISSANTS 39 

. et d'en combiner 12 parties avec 8 parties d'acide osmique à 1 p. i 00 au 
moment de s'en servir. Cette pratique me parait inférieure à la mienne en 
ce qu'elle n'éloigne pas la difficulté connue qu'il y a à conserver l'acide 
osmique en solution dans l'eau pure. 

Dans tous les cas, il est bon de ne pas préparer de grandes provi- 
sions du mélange à la fois, pour un autre motif. C'est que, l'acide 
osmique étant extrêmement volatil, les solutions qui ont servi pen- 
dant longtemps ne contiennent plus la proportion de cet ingrédient, 
qui est nécessaire pour balancer l'action gonflante de l'acide acéti- 
que. Si Ton est obligé d'employer de vieilles solutions, il convient 
d'y ajouter un peu d'acide osmique. 

Comme pour le < Mélange faible », il n'est pas nécessaire dans tous les 
cas de s'en tenir rigoureusement aux proportions indiquées. Ainsi Carnoy 
(La Cellule, I, 2, 1885^ p. 211) a employé avec avantage un mélange d'un 
tiers plus fort en acide osmique et deux fois plus fort en acide chromique, 
à* savoir : 

Acide chromique à 2 p. iOO (ou plus) 45 parties. 

Acide osmique à 2 p. 100 16 — 

Acide acétique cristallisablo 3 — 

PoDWYSSOZKi (ZiEOLER's Beilraege z, paUi.Ânal,, I, 1886 ; cf. Zeit, /*. wiss, 
MiL, III, 3, 1886, p. 405} a recommandé (surtout pour des glandes) de 
dissoudre l'acide chromique dans de la solution de sublimé corrosif à 
0,5 p. 100 dans l'eau, et de ne prendre que 6 à 8 gouttes d'acide acétique 
pour 19 ce. du mélange, la proportion d'acide osmique demeurant comme 
dans la formule de Flemming. Le sublimé est ajouté pour augmenter la 
puissance -de pénétration du mélange (mais cette addition est nuisible, 
dil-il, à la coloration des pièces). 

Comme pour le < mélange faible », on lave longuement à l'eau (et 
même, encore plus longtemps) et l'on colore à Thématoxyline ou, 
s'il s'agit de coupes, par une couleur d'aniline. On peut sans incon- 
vénient soumettre les pièces à une fixation très prolongée, vingt- 
quatre heures ou plus ; mais pour le travail ordinaire une demi-heure 
suffira. Quelques auteurs recommandent même de laisser les pièces 
k l'occasion pendant des semaines entières dans le liquide. 

En d'autres termes, le liquide de Flemming peut servir, soit pur, 
soit allongé d'eau, pour les durcissements aussi bien que pour les 
fixations proprement dites. Mais le plus souvent il suffira de peu 
de temps, le temps voulu pour assurer la pénétration et un peu plus. 
11 ne faut pas craindre de prolonger les lavages à l'eau ; la plupart 
des tissus peuvent y rester pendant des journées sans inconvénient. 

Le c mélange fort > ne brunit pas les tissus plus que le c mélange ^ 
faible », même plutôt moins. 



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40 CHAPITRE III 

Le tissu adipeux se noircit par Fun ou Tautre de ces liquides. On peut 
faire disparaître des tissus la graisse noircie en les traitant pendant quelques 
heures (après déshydratation par Talcool) avec de l'essence de térébenthine 
qui a été préalablement exposée au soleil pendant une heure ou deux. 
(Flemming, ZeiLf, wiss. Mik,, VI, I, 1889, p. 39, et VI, 2, 1889, p. 178.) 

Le « mélange fort > fut imaginé en premier lieu dans le but très 
spécial de faciliter les recherches ayant pour objet de constater la 
présence de mitoses dans les tissus (et non d'étudier la structure 
intime de ces ûgures, ni pour servir aux recherches générales d'his- 
tologie), mais il s'est trouvé par la suite être en même temps admi- 
rable pour les travaux ordinaires. La plupart des auteurs l'emploient 
maintenant de préférence au « mélange faible ». J*ajouterai que 
dans mon expérience personnelle c'est celui de tous les fixateurs qui 
m'a rendu les plus grands services. Je pense bien que dans la plupart 
des cas il est supérieur au c mélange faible ». 

60. Acide nitrique (Altmann, Arch. Anal, u, Phys., 1881, p. 219). 
— Altmann se sert d'une solution aqueuse titrée à environ 3 à 3,5 p. 100 
d'acide pur. Une solution de cette concentration possède une densité de 
1,02 environ, ce qui permet de titrer les solutions d'une façon aussi com- 
mode qu'exacte en se servant d'un aréomètre. (Une densité de 1,0201 cor- 
respond exactement à 3^ de l'échelle de Baume ; le titrage est donc des plus 
simples.) On peut se servir de solutions plus concentrées, mais elles ne 
donnent pas de résultats définitifs aussi bons. 

On lave à l'alcool, et l'on peut colorer avec n'importe quelle teinture. 

Les solutions plus concentrées d'acide nitrique ont été l'objet d'études 
sérieuses. Uskoff recommande pour des objets embryologiques une solu- 
tion de 5 p. 100, qu'il laisse agir pendant dix à trente minutes. Wolff a 
employé avec de bons résultats une concentration de lO^p. 100 (œuf de la 
Poule). 

Pour des préparations extemporanées de l'œuf des Astérides, Flemming 
a obtenu de bons résultats avec une solution de 40 p. 100. liis aussi a 
recommandé une solution de 10 p. 100. Altmann a essayé cette concentra- 
tion, et a trouvé qu'elle ne permettait pas de démontrer les figures 
nucléaires. Il pense que les solutions concentrées coagulent trop fortement 
les albuminoîdes solubles des tissus, ce qui a pour effet de nuire à la diffé- 
renciation optique des structures. 

Pour les lavages, on peut prendre, au lieu d'alcool, une solution aqueuse 
d'alun de 1 à 2 p. 100 (Uskoff, Rabl.). 

On peut aussi employer l'alcool pour préparer le liquide fixateur. On 
mélange à cet effet 3 volumes d'acide nitrique avec 97 volumes d'alcool 
à 70 p. 100. (Fol ; inédit. Nous devons cette indication à l'obligeance de 
M. le professeur Fol.) 

J'ai essayé consciencieusement l'acide nitrique d'Altraann, et je l'ai 
abandonné parce que je l'ai trouvé être un fixateur décidément trop peu 
énergique. 

Pour les durcissements on l'emploie quelquefois à une concentration de 



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AGENTS FIXATEUaS ET DURCISSANTS 41 

3 à 10 p. 100. On le laisse agir pendant deux ou trois semaines. Employé 
de cette manière (10 à 12 p. 100), il fournit des préparations de Fencéphale 
qui sont en même temps très dures et flexibles. 

Benda (Verh. anaL Ges. Wurzburg, 1888; Ergeb, der Anal., I, 1891, p. 7) 
fixe pendant vingt-quatre à quarante-huit heures dans de Tacide nitrique à 
10 p. 100, puis porte les pièces, sans lavage préalable, dans une solution 
saturée de bichromate de potasse allongée de 3 volumes d'eau. On augmente 
graduellement la concentration du bichromate, de manière à arriver en 
deux ou trois jours (ou jusqu'à quatorze jours pour Fencéphale et la 
moelle épiuière) à une concentration de 1 volume de la solution de bichro- 
mate pour un volume d'eau. Il est dit que ce procédé peut s'appliquer à des 
pièces assez volumineuses (testicule entier de l'Homme, etc.), et qu'il leur 
donne une consistance extrêmement dure. 

51. Acide chromo-nitrique {Liquide de Perenyi; Zoologischer 
Anzeiger, V, 1882, p. 459). 

Acide chromique à 0,5 p. 100 3 parties. 

Acide nitrique à 10 p. 100 4 — 

Alcool 3 — 

On mêle ces liquides, et au bout de peu de temps on obtient une 
solution d'un beau violet. 

On y laisse les objets (du moins si ce sont des œufs) pendant quatre 
à cinq heures ; on les met ensuite pendant vingt-quatre heures dans 
de Talcool à 70 degrés, puis pendant quelques jours dans de Talcool 
fort ; et finalement pendant quatre à cinq jours dans de Talcool 
absolu. Au bout de ce temps, ils ont acquis la meilleure consistance 
pour être coupés au microtome. Des œufs ainsi préparés se coupent 
comme du cartilage ; ils ne sont pas le moins du monde poreux, et les 
blastomères et leurs noyaux se trouvent parfaitement bien conservés. 

J*ai employé le liquide de Perenyi avec des objets très variés (mais 
surtout des animaux marins), et je Tai toujours trouvé excellent. 11 
fixe assez rapidement, de sorte qu'il est rarement nécessaire d'y 
laisser les objets aussi longtemps que le dit Perenyi pour les œufs. £t 
il n'est pas nécessaire en général de les durcir longuement dans 
Talcool ; un simple passage à travers les alcools usuels suffit le plus 
souvent. Dans les fixateurs plutôt doux, c'est un des meilleurs que 
faie essayés. 

Perenyi a donné plus tard une formule modiûée, pour la fixation d'em- 
bryons de Lacerta, Nous la donnerons dans les c Méthodes embryolo- 
giques >. 

Les instructions que donne Perenyi pour l'emploi des matières colo- 
rantes dissoutes dans le liquide fixateur me paraissent peu rationnelles, et 
je les supprime. 



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42 CHAPITRE m 

52. Acide chromo-nitrique avec bichromate de potasse 

(Kollmann). — Voyez aux Méthodes embryologiqtces. 

53. Mélange chromo-platinique {Solution de Merkel; Merkel, 
Ueber die Macula lutea, etc., 1870, p. 19 ; — Mitth. ZooL Stat, 
Neapel, 2, 1881, p. 11). — Ce mélange se compose de volumes égaux 
d'acide chromique à 1/400 et de chlorure de platine (Pt Cl*) à 1/400, 

.soit : 

Acide chromique à 1 p. 100 volume. 

Chlorure de platine à 1 p. 100 1 — 

Eau 6 — 

Ce mélange ne pénètre pas avec une très grande rapidité, mais, 
comme il a une action très douce, on peut y laisser les objets très 
longtemps. Merkel y laissait des portions de rétine pendant trois ou 
quatre jours; Eisig y laisse des Annélides pendant trois à cinq heures ; 
'Whitman trouve que pour de petites Sangsues il suffît d'une heure. 

On lave à l'alcool. Eisig prend l'alcool à 70 degrés ; Whitman celui à 
80 degrés. Outre son action très douce, qui fait que cette solution est 
particulièrement propre à la fixation d'objets délicats, elle a le grand 
avantage de ne pas gêner les colorations avec les teintures ordinaires, 
nonobstant la présence de l'acide chromique. Elle rend des services 
en prévenant le noircissement d'objets qui ont été fixés dans l'osmium 
(à cette fin, il convient de les laisser plusieurs heures dans la 
solution). 

Durcissement. — Des tissus peuvent rester assez longtemps dans ce 
liquide pour que nous ayons à le citer parmi les réactifs durcissants. 
Whitman prend, pour le durcissement des œufs pélagiques de Poissons, 
un mélange plus fort en acide chromique, dû à Eisig, à ce que nous 
croyons, à savoir : chlorure de platine, 0,25 p. 100, 1 volume ; et 
acide chromique, 1 p. 100, 1 volume. Les œufs y restent un ou deux 
jours. 

La solution de Merkel est très recommandable à cause de son 
action excellente, et parce qu'elle permet d'obtenir de très belles 
colorations par les procédés ordinaires de teinture progressive. 

SELS CUROMIQUES 

54. Bichromate de potasse. — Le bichromate de potasse e^t 
peu employé seul^ comme fixateur. Il a le défaut de pénétrer très 
lentement et de ne pas conserver les noyaux d'une manière fidèle, 
mais il est peut-être le plus important de tous les agents durcissants 



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AGENTS FIXATEURS ET DURCISSANTS ,êM 

proprement dits. Ce sel se trouve dans le commerce sous forme de 
beaux cristaux de couleur orange, parfaitement stables. Il est très 
soluble dans Teau, mais les solutions ne sont pas parfaiten)ent stables, 
et (comme celles de Tacide chromique) se détruisent plus ou moins à 
la lumière et se laissent envahir par des moisissures. 11 est donc bon 
de les tenir dans Tobscurité et d*y ajouter quelques morceaux de 
camphre. 

On prend pour les durcissements des solutions de 2 à 5 p. dOO. 
Gomme pour Tacide chromique, il est urgent d'employer d'abord les 
concentrations faibles, et de passer graduellement aux plus fortes. Il 
est également important que la quantité de la solution soit très 
abondante. Le durcissement est extrêmement lent; il faut des 
semaines pour arriver au degré de consistance qu'on obtient en 
quelques jours avec l'acide chromique. Mais la consistance qu on 
obtient est irréprochable, et le procédé a sur celui de l'acide chro- 
mique le grand avantage qu'il n'est pas nécessaire de guetter aussi 
minutieusement le moment où il faut faire cesser la réaction. Les 
pièces peuvent rester presque indéfiniment dans les solutions sans 
devenir friables. Nous avons trouvé qu'il faut environ trois semaines 
pour durcir un œil de Mouton dans des solutions graduellement 
augmentées de concentration de 2 à 4 p. 100. Pour durcir une moelle 
d'Homme, il faut trois à six semaines ; pour un cerveau, au moins 
autant de mois. 

A la sortie de la solution, il est urgent de laver les pièces à fond 
dans l'eau avant de les mettre dans l'alcool. Si l'on néglige cette pré- 
caution il se forme un précipité finement granuleux, qui s'attache 
aux tissus, et dont il est très difficile de se débarrasser en renouve- 
lant l'alcool. (Mais voyez plus haut, § 42.) Si Von veut avoir île belles 
colorations au carmin^ surtout au carmin à V ammoniaque^ qui est 
si excellent pour le système neigeux central^ il ne faut pas mettre 
les tissus dans V alcool; il faut même éviter avec un soinminuUeux 
tout contact des tissus avec CalcooL A part cela, on peut les con- 
server dans l'alcool (de 70 à 90 degrés) jusqu'à ce qu'on désire les 
utiliser. 

On peut colorer au carmin ou à l'hématoxyline. 

Le traitement par le bichromate communique aux tissus une 
couleur de rouille qui est très désagréable à l'œil et dont il est impos- 
sible de les débarrasser par le lavage à l'eau. On a dit que les pièces 
peuvent être décolorées par le lavage, pendant quelques minutes, 
dans une solution à 1 p. 100 d'hydrate de chloral. Nous ne savons à 
qui cette recommandation est due. Gierke dit que le traitement par 



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44 CHAPITRE III 

le chiaral empêche la conservation des préparations. On peut les 
décolorer très rapidement par Taddition de quelques gouttes de solu- 
tion alcoolique d'anhydride sulfureux SO* (Gilson, in litt.). Voyez au 
demeurant ce que nous avons dit à ce sujet plus haut, numéro 42. 

65. BIchromsitG et sulfate de cuivre. — Liquide de Kultschitzky 
(ZùiL f. wùu. Mili., IV, 3, 1887, p. 348). Solution saturée de bichromate de 
potasse et salfate de cuivre dans de Talcool à 50 p. 100 à laquelle on ajoute 
au momenl de s'en servir un peu d'acide acétique, soit 5 ou 6 gouttes pour 
100 ce. 

Pour préparer la solution, ajoutez les deux sels en excès à Falcool, et 
laissez le tout pendant vingt-quatre heures dans V obscurité absolue. 

Fixer pendant douze à vingt-quatre heures, également dans V obscurité 
(sans cela les sels se précipiteraient). Lavez à Talcool fort pendant douze à 
vingl-quatre heures. 

Kullschltzky explique que ce mélange fixe fidèlement l'élément plasma- 
tique des tissus sans provoquer les précipités réticulés des albuminoïdes 
qu'y produit si souvent Facide chromique (plus haut, n^ 41). Ce serait là le 
rôle des deux sels. La chromatine des noyaux serait également fixée fidèle- 
ment par Tacide organique. 

J'ai des doutes sur l'exactitude de cette manière de voir. Le sulfate de 
cuivre n'est pas ce qu'il y a de meilleur pour les noyaux. S'il ne dissout 
pas la chromatine, comme le croyait Schwartz, du moins il la prive plus 
ou moins de son allmité pour les matières colorantes (Halliburton). 

56. Liquide de Mûller. 

Diehromtttc de potasse 2à21/2 parties. 

Sulfate de soude 1 — 

Eau, . 100 — 

Pour les duTcmements seulement. S'emploie de la même manière 
que la solution simple de bichromate. Ce liquide fut recommandé 
par Millier pour le durcissement de la rétine, et, pour cet objet et 
d'autres semblables, a joui pendant longtemps d'une grande vogue 
dans le.^ laboratoires. Nous avouons que nous ne nous rendons pas 
liien compte du rùle que peut jouer le sel de soude dans ce mélange 
(à moins quUl ne serve à y provoquer la formation d'un peu d'acide 
chromique libre?) et que nous n'avons pas pu nous apercevoir que ce 
mélange donnai des résultats sensiblement différents de ceux du 
bichromate pur. Flemming a trouvé que son action sur les noyaux est 
identique à celui du bichromate pur. Fol dit que pour les embryons, 
pour lesquels on l'a beaucoup préconisé, il est absolument sans 
valeur. 

Zë£4rek a recommande d'additionner ce liquide de sublimé et d'acide 
acétique, voy. numéro 68 bis. 



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AGENTS FIXATEURS ET DURCISSANTS 45 

67. Liquide d'Erlicki {Warschauer Med. ZeiL, XXIII, n^* 15 

et 18). 

Bichromate de potasse 2,5 parties. 

Sulfate de cuivre 1,0 — 

Eau 100,0 — 

Pour les durcissements seulement. 

On comprend facilement Tutililé de l'addition du sulfate de cuivre 
au bichromate de potasse. Ge sulfate est lui-même un durcissant éner- 
gique, et sert ici à renforcer l'action un peu trop lente du bichromate ; 
et effectivement le liquide d'Erlicki durcit incomparablement plus 
vite que celui de MûUer ou que le bichromate simple. Avec ce 
mélange on peut durcir la moelle en quatre jours à la température 
d'un incubateur, en dix jours à la température normale (Fol). Cette 
formule est très usitée en Allemagne, et nous croyons qu'elle constitue 
l'un des meilleurs durcissants qui soient connus pour les objets volu- 
mineux. Nous l'avons vu largement employer au laboratoire de mor- 
phologie de l'Université de Genève pour les embryons humains âgés 
de plusieurs mois. 

On observe souvent, dans des portions des centres nerveux qui ont 
été durcis par le liquide d'Erlicki, des taches foncées, avec des pro- 
longements, qui simulent des cellules ganglionnaires. On les a consi- 
dérées comme des productions pathologiques, mais il est maintenant 
démontré que ce ne sont que des dépôts formés par l'action du liquide 
durcissant. On peut les faire disparaître par l'eau chaude, ou mieux 
par l'eau légèrement acidulée par l'HGl, ou bien en traitant les pièces 
par l'acide chromique à 0,5 p. 100 avant de les mettre dans l'alcool. 
(Edinger, Zeit. f. wiss. Mik.y 1885, p. 245; Loewental, liev. méd. de 
la Suisse romande, 6* année, I, p. 20.) 

58. Bichromate et chlorure de platine (Lindsay Johnson, in 

Bichromate de potasse à 2,5 p. 100 70 parties. 

Acide osmique à 2 p. 100 iO — 

Chlorure de platine à 1 p. 100 15 — 

Acide acétique ou formique ........ 5 — 

Ge mélange fut imaginé pour le durcissement préliminaire, après fixation, 
de la rétine, sur laquelle Tauteur le laissait agir pendant douze heures, puis 
achevait le durcissement dans du bichromate pur. M. Lindsay Johnson 
m'écrit que la présence de Tacide osmitiue sert à abréger beaucoup la durée 
du durcissement ; en trois jours on peut mener une rétine à travers toutes 
les étapes usuelles jusque dans la celloïdine. Si Ton voit que la préparation 
tend à se noircir, on peut prévenir cela en ajoutant 10 parties de solution 



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46 CHAPITIIK m 

de nitrate d'urane à 5 p. 100, qui forme une couche d'urane de couleur 
brune au-dessus de Tosmium réduit. L. Johnson a maintenant trouvé qu'au 
lieu de passer après douze heures au bichromate pur, il est quelquefois pré- 
férable après ce temps d'allonger le liquide d'eau, et d'y achever le durcis- 
sement (quatre jours). 

D'après notre expérience personnelle, ce mélange est excellent. Il 
ne faut pas chercher à augmenter la concentration du chlorure de 
platine au delà de la proportion indiquée, car les solutions trop 
fortes ont une tendance à cristalliser sur les tissus. 

59. Bichromate d'ammoniaque. — Ce sel a une action sensiblement 
identique à celle du bichromate de potasse. Nous avons constaté, en com- 
pulsant la littérature, qu'il devient maintenant fort à la mode, mais nous 
ne saurions trop dire pour quel motif. Fol dit qu'il pénètre plus rapidement 
que le sel potassique, et durcit en même temps plus lentement, ce qui fait 
qu'il est bon de l'employer à des doses un peu plus fortes, à savoir 5 p. 100 
au lieu de 4 p. 100. 

60 « Chromate neutre d'ammoniaque. — Quelques anatomistes 
ont trouvé que ce sel offrait des avantages pour le durcissement de certains 
organes. Klein l'a recommandé pour l'intestin, qu'il durcit en vingt-quatre 
heures, à une concentration de 5 p. 100. Fol trouve qu'il ne présente pas 
d'avantage sur les bichromates. 

61. Sulfate de cuivre. — Nous avons dit que ce sel est par lui-même 
un durcissement énergique. On ne l'emploie cependant guère seul, vu qu'il 
ne donne pas aux tissus une consistance suffisante. 

Friedlaender {BioL Centrait,^ X, 1890, p. 483; Joum. Roy. Mie. Soc, 
1890, p. 804) fixe les animaux pélagiques délicats en les inondant d'un 
mélange de sulfate de cuivre 125 parties, sulfate de zinc 125 parties, eau 
1000 parties. J*ai pu constater que le sulfate de cuivre possède certainement 
des qualités pour ce genre d'objets. Nous reviendrons là-dessus à propos 
de la méthode de Beuot pour la conservation des Siphonophores, n' 798. 

61 bis, — L'alun a été employé comme agent fixateur. 

J'en ai fait moi-même une expérience considérable, et si je le cite, 
c'est pour recommander de Téviter à tout prix. 



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CHAPITRE IV 

AGENTS FIXATEURS ET DURCISSANTS 

CHLORURES 

62. Bichlorure de mercure (sublimé corrosif). — Ce sel se 

trouve dans le commerce sous forme de poudre cristalline parfaitement 
stable. Sa solution aqueuse saturée à froid contient environ o p. 100 
du chlorure. Il est plus soluble dans Talcool que dans Teau, et en 
employant de Talcool de 50 à 60 degrés, on obtient des solutions bien 
plus fortes. 

Sa solubilité dans l'eau ou l'alcool est augmentée par l'addition 
d'acide chlorhydrique, de chlorure d'ammonium, de camphre ou 
d'iode. Avec du chlorure de sodium il forme un sel double beaucoup 
plus soluble; Peau de mer peut en dissoudre jusqu'à 15 p. 100 (de 
là la composition du liquide de Lang). 

Les solutions aqueuses se détériorent assez rapidement par la formation 
d'un précipité pulvérulent très fia. Je ne connais aucun moyen sûr de pré- 
venir la formation de ce précipité. Cependant, pensant qu'il peut être 
dû en partie à l'ammoniaque de l'air, j'ai pris le parti depuis quelque 
temps d'additionner mes solutions d'un peu d'acide nitrique, et je m'en suis 
bien trouvé. 

Néanmoins, toutes les fois qu'on veut déployer toute la puissance 
fixatrice du sublimé, il sera bon de n'employer que des solutions récemment 
préparées ; et même pour le travail ordinaire il est bon de ne pas préparer 
de grandes provisions de ce réactif à la fois. 

Pour les fixations nous recommandons (et nous croyons que c'est 
la pratique générale) de prendre des solutions aussi concentrées que 
possible. La solution aqueuse saturée à froid sufQra le plus souvent ; 
mais pour les Arthropodes il faudra souvent prendre une solution 



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48 CHAPITRE IV 

alcoolique^ et pour les animaux très contractiles (Goralliaires, Pla- 
naires) il faudra souvent avoir recours à des solutions chaudes, même 
bouillantes. 

Il y a très souvent utilité à acidiGer les solutions par l'acide acé- 
tique. On peut ajouter sans crainte 1 p. lOO de cet acide (liquide de 
Këiser). Une solution saturée de sublimé dans de Tacide acétique 
à 6 p. 100 m'a donné de très bons résultats poMr les animatix marins. 
Van Beneden a employé une solution saturée dans de l'acide acétique 
à 25 p. 100. 

Il est bon en règle générale, du moins si Ton a employé une solu- 
tion concentrée, de ne laisser les objets dans la solution que juste le 
temps nécessaire pour qu'ils en soient pénétrés. La pénétration se 
constate facilement à la vue de Topacité blanchâtre qui se produit 
dans les tissus. Elle est très rapide ; les petits objets (et autant que 
possible on ne doit pas en prendre de gros) sont fixés en quelque 
minutes ; nous avons trouvé que pour pénétrer une glande salivaire 
de Chironomus il ne faut pas plus de trois secondes. 

On lave à l'eau ou à l'alcool. Nous pensons que l'alcool vaut 
presque toujours mieux. 

Nous ajouterons qu'il est souvent important de ne pas prendre 
l'alcool trop faible, mais de commencer les lavages par l'alcool d'au 
moins 70 degrés. On peut y ajouter un peu de camphre, ce qui faci- 
lite l'extraction du sublimé. Ou bien ce qui vaut mieux, à cet effet on 
ajoute à l'eau ou à l'alcool de lavage de la teinture d'iode^ et on en 
renouvelle l'addition jusqu'à ce que les objets n'en absorbent plus, 
c'est-à-dire jusqu'à ce qu'ils ne décolorent plus le mélange au bout 
de quelque temps. Cette pratique a l'avantage de diminuer la ten- 
dance qu'a le sublimé à rendre les tissus cassants. Elle sert aussi dans 
certains cas à faciliter les colorations. On ne doit pas prendre la 
solution d'iode dans l'iodure de potassium (voy. n** 66). 

Il peut arriver que si l'extraction du sublimé a été insuffisante, ce sel 
vienne à former des cristaux dans les coupes, après le montage dans le 
baume. On prévient facilement cela en traitant les coupes pendant un quart 
d'heure par de la teinture d'iode. Si l'on a préféré cette manière de faire, 
Taddition d'iode à l'alcool de lavage après fixation est superflue, à moins 
que les pièces ne doivent être gardées longtemps dans l'alcool avant la con- 
fection des coupes. 

La croyance qu'il est nécessaire de laver par Veau les objets qui 
ont été traités par le sublimé est une erreur. Il importe que les lavages 
soient scrupuleusement faits, autrement les tissus deviendront granu- 
leux et cassants. Il faut aussi, autant que possible, ne pas laisser les 



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AGENTS FIXATEURS ET DURCISSANTS 49 

objets trop longtemps dans ralcool, autrement ils peuvent devenir 
cassants. 

On peut colorer avec n'importe quel colorant. II n'est pas même 
toujours nécessaire que le sublimé soit enlevé des pièces avant de les 
mettre dans la solution colorante. Ainsi, dans la pratique, il arrive 
souvent qu'on lave pendant quelques minutes ou une demi-heure dans 
l'eau, qu'on passe alors les pièces pendant une demi-heure dans du 
carmin au borax, du picro-carmin, du carmin à l'alun ou de Thé- 
matoxyline, et que l'on achève l'extraction du sublimé parles mêmes 
lavages qui servent à débarrasser les pièces de l'excès de matière 
colorante. On les passe alors aussi rapidement que possible à travers 
des alcools successivement plus forts, et, après vingt-quatre heures 
ou peut les enrober, couper, ou monter en préparations permanentes, 
selon la méthode que l'on préfère. 

Nous pensons que le sublimé corrosif est un fixateur de premier 
ordrey pourvu toutefois que l'on observe la précaution que nous avons 
indiquée, de ne le laisser agir que pendant le temps voulu sur les 
tissus, et de l'en éloigner ensuite rapidement et complètement. 11 est 
d'un emploi très commode, et permet d'aller très vite. Il permet des 
colorations très faciles et belles avec le carmin, etc. 

Le lecteur se souviendra qu'il ne doit pas employer d'instruments 
métalliques pour manipuler les objets contenus dans les solutions 
mercuriques, ces solutions se précipitant immédiatement au contact 
des métaux. Pour ces objets, il faut se servir d'instruments de verre, 
d'ivoire, de corne, de caoutchouc, de bois, de piquants de hérisson ou 
de porc-épic. 

Les solutions de sublimé pur, de même que les mélanges mercuriques 
qui vont suivre, paraissent convenir pour la grande majorité des orga- 
nismes, excepté les Arthropodes à squelette un peut fort, le sublimé ne 
pénétrant pas la chitine avec beaucoup d*énergie. 

MÉLANGES MERCURIQUES 

63. Liqueur de Lang [ZooL Anzeiger, 1878, p. 14). — On prend : 

Eau distillée 100 parties. 

Chlorure de sodium 6 à 10 — 

Acide acétique 5à 8 — 

Bichlorure de mercure 3 à 12 — 

AluQ (dans certains cas) 0,5 — 

Pour des Planaires surtout. On couche les animaux sur le dos et on les 
inonde du mélange versé brusquement. Ils meurent étendus. On les laisse 
une demi-heure dans le liquide, et on les passe dans l'alcool. 

ANAT. UICROSC. 4 



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50 CHAPITRE IV 

Nous avons trouvé ce mélange excellent pour fixer des animaux péla- 
giques mous, tels que Salpa, Doliolum* 

64. — Carnoy {La Biologie cellulaire^ p. 95) recommande les deux mé- 
langes suivants, selon qu'on désire employer un liquide alcalin ou acide. 

Liquide alcalin : 

Eau distillée 100 parties. 

Bichlorure de mercure 5 — 

Chlorure de sodium 3 — 

Liquide acide : 

Eau distillée 100 parties. 

Bichlorure de mercure 5 — 

Acide acétique 5 — 

66. — Les liquides de Harting {Micro, Diction,, art. Préservation) et de 
Pacini {Journal de Micrographie, IV, i880; Journ. Roy, Mie. Soc, N. S. 
II, 1882, p. 702) doivent être cités ici, quoiqu'ils ne constituent que des 
fixateurs peu énergiques et d'une application très restreinte. 

Harting prend : 

Sublimé 1 partie. 

Eau distillée 200 à 500 — 

(Pour corpuscules du sang et quelques autres éléments.) 

Pacini prend : 

1* Sublimé 1 partie. 

Sel de cuisine 2 — 

Eau 200 — 

(Pour Infusoires, globules du sang, spermatozoïdes.) 

2* Sublimé 1 partie. 

Sel de cuisine 4 — 

Eau 200 — 

(Corpuscules du sang des Vertébrés.} 

3* Sublimé 1 partie. 

Acide acétique 2 — 

Eau 300 — 

Noyaux des tissus des animaux. Ne conserve pas les corps cellulaires. 
(Pour remploi de ces mélanges comme liquides conservateurs, voyez 
au chapitre des Liquides additionnels,) 

Un liquide contenant 5 grammes de sublimé, 50 centigrammes de chlo- 
rure de sodium et 100 ce. d'eau a été cité sous le titre de Solution de 
Gaule. 

66. Liqueur de Gilson {La Cellule^ 1, 1886, p. 87). — Nous don- 



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WM- . 



AGENTS FIXATEURS ET DURQSSANTS 51 

nons ici une formule modifiée qui nous a été obligeamment commu- 
niquée par M. le professeur Gilson (1893 et 1895). 

Acide nitrique à 46° Baume 78 ce. 

Acide acétique cristallisable 22 — 

Sublimé 95 à 100 grammes 

Alcool à 60 p. 100 500 ce. 

Eau distillée 4400 — 

c Ce mélange donne en général une fixation très délicate et une 
bonne consistance, ce qui n'est pas le cas pour toutes les solutions 
mercuriques. Elle n'est en rien nuisible aux colorations.' Son action 
peut être prolongée non pas indéfiniment, mais du moins très long- 
temps sans trop d'inconvénient. Elle est très pénétrante. 

c Pour des animaux marins il est bon d'ajouter au fond de la bou- 
teille des cristaux d'iode ; on évite ainsi tout précipité par les «els. » 

€ Vous aurez peut-être remarqué (continue mon savant correspon- 
dant) que les solutions mercuriques donnent souvent des granules 
dans certains organes, par exemple, dans le testicule des larves de 
Lepidopter.es et autres organes à prolifération active. Cela pourrait 
bien être dû à une abondance de phosphates. On les évite grâce à 
riode, et en tout cas si on les constate dans une coupe on peut les 
faire disparaître en lavant à l'eau additionnée de teinture d'iode {il 
faut bien se garder de Viodure, qui précipiterait le sublimé). > 

Gilson recommande beaucoup ce re'actif comme donnant de bons 
résultats, et comme évitant bien des déboires dans les laboratoires 
où il y a des commençants. Car un excès de fixation, un lavage 
incomplet, etc., ne causent pas la perte irréparable de l'objet. 

On pourra trouver ce réactif utile pour débarrasser, les œufs des 
Batraciens de leur albumine ; ils s'y débarrassent aussi bien qu'avec 
les solutions chromiques et y prennent une bonne consistance. 

Je l'ai essayé, et j'ai eu de bons résultats. Trouvant la fixation un 
peu trop faible pour mes objets, j'ai augmenté considérablement la 
proportion de sublimé, et je m'en suis bien trouvé. J'ai également 
expérimenté avec des solutions simples de sublimé additionnées 
d'acide nitrique, et je crois cette addition très recommandable. Il 
paraît que Frenzel a déjà formulé l'addition de 1 goutte d'acide 
nitrique pour chaque centimètre cube de solution saturée de sublimé. 
(Makn, ZeiL f.wiss. Mik., XI, 4, 1894, p. 480.) 

67. Bichlorure de mercure et acide picro-salfurique {Formule 
deLx^G ; ZooL Anzeiger, 1879, p. 46j. — Solution saturée de sublimé cor- 
rosif dans de l'acide picro-sulfurique auquel on a ajouté 5 p. 100 d'acide 
acétique. 



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52 CHAPITRE IV 

68. Bichlorure et acide picrique (Rabl, Zeit. f, wiss. Mik,, XI, 
2, 1894, p. 165). 

Sublimé, sol. sat. aq 1 volume. 

Acide picrique, sol. sat. aq 1 — 

Eau distillée 2 — 

Rabl y laisse des embryons environ douze heures, lave pendant 
deux heures à Teau, et passe dans Talcool faible. 

La solution de Mann {op. cit.^ XI, 4, 1898, p. 480) contient 1 p. 100 
d'acide picrique avec ou sans 1 p. 100 de tanin dans une solution 
saturée de sublimé dans de la solution physiologique de sel. 

68 bis. Liquide de Zenker {Mûnchener med. Wochenschr., 
no 24, 1894, p. 832). — C'est du liquide de MUller (n**56) additionné 
de 8 p. 100 de sublimé corrosif et 8 p. 100 d'acide acétique cristalli- 
sable (il vaut mieux ajouter ce dernier au moment de s*en servir). 
Fixer plusieurs heures, laver à Teau, traiter les pièces ou les coupes 
par Talcool iodé (n® 62). Recommandé avec des détails minutieux, 
par Mercier, dans Zeit. f. wiss. Mik.^ XI, 4, 1894, p. 471. 

69. Sublimé alcooUque (Mann, Anal. Anz., YIII, 1893, p. 441-443). 

Alcool absolu 100 ce. 

Acide picrique 4 grammes. 

Sublimé 15 — 

Acide tannique 6à8 — 

L*acide tannique est ajouté pour prévenir un durcissement excessif. 

69 bis. Sublimé et acide osmique (Mann). — Ce mélange a été donné 
au numéro 39. 

Autres chlorures 

70. Chlorure de platine, PtGl^. — Ce sel étant extrêmement déli- 
'quescent, il vaut mieux se le procurer en solution. On trouve en eiïet dans 
le commerce des solutions à 10 p. 100. La solutioa aqueuse simple de ce 
sel a jusqu'à présent peu servi. R\bl (Morphol. Jahrb,. X Bd., 1884, p. 216) 
s'en est servi dans ses recherches sur la cytodiérèse. Elle a une action sem- 
blable à celle du chlorure d'or, avec l'avantage de ne pas être réduite par 
la lumière ou la chaleur. 

Rabl se sert d'une solution de 1/300. Il y laisse les objets pendant vingt- 
quatre heures. Il lave à l'eau, durcit ensuite à l'alcool, fait des coupes, et les 
colore avec l'hématoxyline de Delafield, ou la safranine. 

C'est surtout sous forme de mélanges que sert le chlorure de platine. Nous 
avons parlé plus haut (n^ 53) du mélange de Merkel, et nous allons main- 
tenant en citer un autre qui est très en vogue à Thcure qu'il est. 



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AGENTS FIXATEURS ET DURCISSANTS 53 

71. Mélange platino-acéto-osmique (Herhann, Arch. f. mik. 
Anat.y XXXIV, 1889, p. 88). — Hermann a proposé de substituer la 
solution de chlorure platinique à 1 p. 400 à la solution d*acide chro- 
mique dans la liqueur de FLEMinNO, Nouvelle Formule, soit Mélange 
fort, les autres ingrédients restant les mêmes, ou bien Tacide 
osmique étant diminué de moitié. Il croit avoir obtenu ainsi une 
fixation plus Qdële des parties plasmatiques des tissus. Nous avons 
noté plus haut (n^ 41) que Tacide chromique a le défaut de précipiter 
certains constituants liquides des tissus sous forme de réseaux ou de 
filaments qui peuvent simuler des éléments normaux des tissus. Le 
chlorure platinique n*a pas cet effet. 

C'est là certainement un avantage, qui peut être considérable en 
certains cas. J'ai trouvé aussi que les pièces brunissent moins qu'avec 
l'acide chromique, et il me semble que les coupes sont moins 
opaques. A part cela, après des essais soigneux de ce réactif, je n'ai 
pas pu trouver qu'il possède une supériorité réelle sur celui de 
Flehming, il m'a semblé même souvent qu'il donnait des fixations 
moins bonnes. Et comme il est en même temps extrêmement coûteux, 
il me semble qu'il y a lieu de le réserver pour des recherches spé- 
ciales, et de continuer à employer le liquide de Flembong pour les 
travaux ordinaires. 

Le traitement ultérieur des préparations est le même que pour le 
liquide de Flehming. 

71 his. Sublimé platinique (Rabl) v. numéro 553. 

72. Le chlorure de palladium a été employé comme fixateur en 
solutions aqueuses de 1/300, 1/600, ou 1/1000. La fixation se fait en une ou 
deux minutes, pour les petits objets. Cattâneo le recommande comme étant 
le meilleur flxateur pour les Infusoires. 

Ce sel se trouve à Tétat sec dans le commerce. Pour le dissoudre, il est 
nécessaire d'employer de Feau acidulée avec de Tacide chlorhydrique. Il 
faut prendre, pour 10 grammes du chlorure sec, un litre d*eau et 4 à 
6 gouttes de HCl. Il faut vingt-quatre heures pour que la dissolution soit 
complète. 

Ce chlorure imprègne les tissus en les colorant en brun. 

Il a été employé comme agent durcissant, voyez F.-E. Schultze, Arch, /. 
mik. AnaL, III, 1867, p. 477. 

73. Perohlorure de fer (H. Fol, ZeiL wiss. ZooL, XXXVIII, 1883, 
p. 491 ; Fol, Lehrb, d. vergl. mik, AnaL, p. 102). — Ce réactif a trop de 
défauts pour qu'on puisse le recommander. 

74. Z«e chlorure de zlno n'est employé que pour Yencéphale. Voyez 
dans la Deuxième partie. 



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CHAPITRE V 

AGENTS FIXATEURS ET DURCISSANTS 

ACIDES ORGANIQUES ET AUTRES AGENTS 

75. Acide picrique. — Cet acide se trouve dans le commerce sous 
forme de beaux cristaux d'un beau jaune serin. Ces cristaux stables, 
hexagonaux, peuvent commodément être conservés en nature. Ils se dis- 
solvent dans Teau et dans Talcool. Dans Teau froide, ils se dissolvent en 
raison d'environ 1 partie pour 75 d'eau ; dans l'eau chaude ils sont beau- 
coup plus solubles. 

Pour les fixations, on emploie en général la solution aqueuse saturée à 
froid. On doit toujours avoir soin d'employer des solutions fortes toutes les 
fois qu'il s'agit de faire des coupes ou de préparer des organes avec les élé- 
ments in silu, parce que les solutions faibles macèrent les tissus. Pour 
l'étude d'éléments cellulaires isolés, on peut prendre des solutions faibles. 

On peut laisser les objets à fixer très longtemps — jusqu'à vingt-quatre 
heures, par exemple — dans cet acide, sans qu'ils en souffrent. Il est 
cependant extrêmement pénétrant, et peut fixer de petits objets en quelques 
instants. 

On lave toujours à Valcool, pour les motifs que nous avons exposés dans 
l'introduction, au numéro 5. Cette règle ne souffre pas d'exception pour l'acide 
picrique pur, et s'applique également à l'acide picro-sulfurique, l'acide 
picro-nitrique et l'acide picro-chlorhydrique. L'acide picro-chromique permet 
un court lavage à l'eau (Fol). Pour la même raison, on doit éviter l'emploi 
des liquides aqueux pendant tout le cours de la préparation ultérieure ; on 
colore donc avec des teintures alcooliques. (On peut à la rigueur se servir 
de certaines teintures aqueuses, à condition qu'elles contiennent une pro- 
portion suffisante de quelque réactif durcissant pour leur permettre de ne 
pas déformer les cellules ; et l'on a cité à ce propos le picro-carmin, qui 
remplirait celte condition en vertu de l'acide picrique qu'il contient.) 

C'est avec l'alcool à 70 degrés que l'on commence les lavages en général. 
!1 faut le renouveler aussitôt qu'il devient trouble, et continuer les lavages 
us qu'à ce que les tissus soient bien débarrassés de la coloration jaune que 
leur a donnée l'acide picrique. Les lavages seront facilités de beaucoup si 
l'on emploie l'alcool à chaud ; à la température de 40<^ l'acide picrique est en 



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AGENTS FIXATEURS ET DURCISSANTS 55 

effet presque deux fois aussi soluble dans cet alcool qu'à la température 
normale (Fol). 

Jelinek {Zeit. f. wiss. Mik,, XI, % 1894, p. 242) dit que Textraction de 
Tacide est notablement activée par l'addition de carbonate de lilhine à 
Talcool de lavage. On y ajoute quelques gouttes d'une solution aqueuse 
saturée. Il se produit un léger précipité. On introduit maintenant les objets 
dans cet alcool trouble et l'on remarque qu'il commence à s'éclaircir en 
même temps qu'il prend une coloration jaune et que les objets se déco- 
lorent. On 'ajoute de nouvelles quantités de la solution de carbonate jusqu'à 
ce que la réaction ne se produise plus et que les objets soient devenus inco- 
lores. 

C'est l'un des grands avantages de l'acide picrique, qu'il se laisse entiè- 
rement extraire par l'alcool et laisse les tissus dans un état où ils sont sus- 
ceptibles des plus belles colorations par tous les colorants ordinaires. 

Une qualité très précieuse, c'est sa grande puissance de pénétration. Cette 
propriété, jointe à cette autre, qu'il ne nuit nullement aux éléments des 
tissus lors d'une immersion prolongée, fait des liquides picriques les fixa- 
teurs par excellence des Arthropodes. 

En dehors de cela il laisse à désirer sous beaucoup de rapports. Les 
lavages nécessaires pour l'éloigner des tissus n'opèrent que très lentement ; 
il faut souvent des semaines entières pour les mener à bonne fm. Il est un 
fixateur très peu énergique : on lui souhaiterait le plus souvent une action 
coagulante beaucoup plus prononcée. On n'arrive à parer que partiellement 
à ces deux inconvénients en combinant l'acide picrique avec d'autres réac- 
tifs, comme dans les mélanges qui vont suivre. 

76. Acide picro-sulforique {Liqueur de Kleinbnbbrg ; Quart. 
Joum. Mie. Science, avril 1879, p. 208. — Formule de Paul Mayer; 
Joum. Roy. Mie. Soc, N. S., 2, 1882, p. ,867» D'après Whitman). — 

Nous supprimons la formule originelle donnée par Kleinenberg 
pour la préparation de ce liquide, celle que nous donnons étant beau- 
coup plus commode. Prenez : 

Eau distillée 100 volumes. 

Acide sulfurique concentré ....... 2 — 

Mêlez et ajoutez de l'acide picrique autant qu*il s*èn dissoudra. 

Ce sera environ 0,25 p. 100, Tacide picrique étant beaucoup moins 
soluble dans Teau additionnée d'acide sulfurique que dans l'eau 
pure. 

Filtrez et ajoutez 3 volumes |d'eau (excepté pour les Arthropodes, 
pour lesquels on emploie la solution non diluée). (N'y aurait-il pas 
avantage à réserver le nom d'< acide picro-sulfurique » à la solution 
non diluée, et à appeler < Liqueur de Kleinenberg » la solution éten- 
due ? La solution non diluée est indispensable pour les Arthropodes, 
et nous paraît mériter une désignation propre.) 

On laisse les objets dans ce liquide, selon leurs dimensions, pen- 



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56 CHAPITRE V 

dant trois ou quatre heures, ou même jusqu'à vingt-quatre heures 
(les immersions prolongées ne nuisent nullement aux objets). On les 
porte alors dans de Talcool à 70 degrés, ou on les lave comme nous 
l'avons dit pour Tacide picrique. Nous croyons devoir répéter ce que 
nous avons déjà dit plus d'une fois, que les objets Gxés dans les 
liquides picriques ne doivent jamais être lavés à l'eau. 
On colore comme nous Pavons dit pour l'acide picrique. 

Il y a qaelqaes précautions à prendre avec l'acide picro-sulfurique. 
Quoiqu'il se diffuse assez rapidçment à travers les cuticules, il va sans dire 
que la chitine épaisse s'oppose à son passage. Les Arthropodes un peu 
gros, les Insectes et les Isopodes de grande taille, doivent être ouverts et 
injectés largement avec le liquide à l'aide d'une pipette. De plus, et ceci est 
un point très important, on emploiera des quantités très grandes de 
liquide, et [on aura le plus grand soin de renouveler le liquide aussitôt 
qu'il sera devenu trouble. On ne doit jamais laisser les objets pendant un 
temps considérable dans un liquide qui n'est pas parfaitement limpide. 

Ce liquide est un fixateur plus énergique que l'acide picrique pur. Il a en 
outre l'avantage de se laisser enlever au lavage bien plus facilement. Pour 
la zoologie marine, il a la propriété très précieuse de débarrasser les orga- 
nismes des sels de l'eau de mer en même temps qu'il les fixe. 

Il a quelques désavantages qui lui sont ]iarticuliers. À cause de la pré- 
sence de l'acide sulfurique, ce réactif gonfle le tissu conjonctif ; c'est assez 
dire que pour les Vertébrés il n'est que d'une application restreinte. Puis, 
pour les objets qui contiennent des éléments calcaires, il n'est pas à recom- 
mander, car il dissout la chaux et la laisse ensuite précipiter dans les tissus 
sous forme de cristaux insolubles de gypse. Pour de tels objets, il est pré- 
férable d'employer un des liquides suivants, acide picro-ni trique, ou acide 
picro-chlorhydrique. 

Dans beaucoup d'objets il produit des gonflements et des macérations. 
D'après une expérience assez étendue, je dois dire que pour la fixation d'or- 
ganismes délicats et ayant dans leur composition beaucoup d'eau, tels que 
les Méduses, ce liquide ne vaut rien. Pour les Arthropodes je trouve que 
c'est un réactif excellent à cause de sa grande puissance de pénétration 
pour la chitine. Mais pour le travail ordinaire il est beaucoup moins 
recommandable, et il me parait certain que c'est surtout grâce au pres- 
tige de l'autorité de Kleinenberg qu'il a pu jouir aussi longtemps de la 
faveur des anatomistes. On revient maintenant de cet engouement, et l'on 
fait bien. 

J'ajouterai que dans la plupart des cas le liquide no7i dilué m'a donné de 
meilleurs résultais que le liquide étendu de Kleinenberg. 

77. Acide picro-nitrique. (PaulMAYER; 3fitt.Zool.Stat. Neapel, 
1881, p. 5.) 

Eau distillée 100 volumes. 

Acide nitrique (Je 2o p. lUO Az^O"). ... 5 — 
Acide picrique, autant qu'il s'en dissoudra. 



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AGENTS FIXATEURS ET DURCISSANTS 57 

Propriétés très semblables à celles de Tacide picro-sulfurique, avec 
l'avantage de prévenir la formation decristaicx degypsCy et rincon- 
vénient d*ètre beaucoup plus difficile à éloigner des tissus par le 
lavage. Whitman {Joum. Roy. Mie. Soc, N. S. 2, 1882, p. 868) rap- 
porte que Paul Mayer le recommande beaucoup, et trouve qu'avec 
des œufs qui contiennent beaucoup de deutoplasme, comme ceux de 
Palinurus, il donne de meilleurs résultats que Tacide nitrique, l'acide 
picrique ou Tacide picro-sulfurique. 

78. Acide picro-chlorhydrique. (Paul Mayer, Mitlh. Zool. Stat. 
NeapeLy 1881, p. 5.) 

Eau distillée 100 volumes. 

Acide chlorhydrique (à 25 p. 100 HCl) 8 — 

Acide picrique, autant qu'il s'en dissoudra. 

Propriétés semblables à celles de l'acide picro-nitrique. 

79. — Note sur la décalcification au moyen de Pacide picro-nitrique ou 
l acide picro<hlorhydrique. Il vient naturellement à Tesprit que ces deux 
liquides pourraient être très utiles pour les décalcifications. Paul Mayer 
fait observer à ce sujet que l'action en est extrêmement rapide et que le 
dégagement de Tacide carbonique est souvent assez abondant pour produire 
des lésions dans les tissus par une action mécanique ; de sorte qu'il est 
souvent préférable d'employer l'acide chromique, d'autant plus que ce dur- 
cissant énergique sert d'une façon très efficace à agir contre raÎTaissement 
des tissus qui peut résulter de la disparition de leur charpente calcaire* 

80. Acide picro-chromique. — Nous en avons parlé au numéro 
45 bis. 

81. Mélanges picro-osmiques. ~ Flemming (Zells. Kern-u.-Zellth., 
p. 381) a essayé des mélanges faits en substituant à Tacide chromique des 
mélanges chromo-osmiquqs (Max Flesgii et Flemming) de Tacide picrique à 
50 p. 100. {Sic. Flemming a sans doute écrit 0,5 p. 100.) Ces mélanges 
donnent des résultats identiques à ceux des mélanges chromo-osmiques, si 
ce n'est qu'ils rendent les colorations encore plus difficiles. 

0. vom Rath {Zool. Anz., XIV, 1891, p. 363) s'est bien trouvé du 
mélange suivant: Acide picrique, sol. sat. aq., 1000 ce., acide acétique cris- 
tallisable 4 ce. et acide osmique 1 gramme. Fixer pendant une heure environ, 
laver seulement quelques minutes à Teau et porter dans l'alcool. Si on 
laisse les pièces trop longtemps dans le mélange, elles brunissent beau- 
coup. 

82. Alcool picrique (Gage, Proc. Amer. Soc. Mie-, 1890, p. 120;/ou?7i. 
Eoy. Mie. Soc, 1891, p. 418). — Alcool à 95 p. 100, 250 ; eau, 230 ; acide 
picrique, 1. Fixer pendant environ vingt-quatre heures, laver pendant un 
jour dans de Taicool de 67 à 70 p. 100, puis pendant encore un jour ou plus 
dans de l'alcool à 75 à 82 p. 100. 



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58 CHAPITRE V 

83. L'acide acétique et racido formique sont surtout employés 
comme fixateurs pour les noyaux. On peut dire d'une manière générale que 
les meilleures concentrations se trouvent entre les limites de 0,2 à 1 p. 100. 
Des concentrations supérieures, 5 p. 100 et plus, fixent bien les éléments 
nucléaires pendant un moment, mais ensuite les font gonfler et pâlir, ce 
qui n'arrive pas avec les solutions très diluées. Voyez, à ce sujet, Flemming, 
Zellsubstanz, etc., p. 102-103 et 380. 

L'action de ces deux acides est à peu près la même. L'acide acétique a 
sur Tacide formique l'avantage d'être cristallisable, ce qui permet de titrer 
facilement les solutions, en prenant pour point de départ VAcidum acelicum 
glaciale. 

L'acide acétique concentré est souvent fort utile, comme je puis en 
témoigner, pour tuer et fixer en même temps des organismes extrêmement 
contractiles, tels que certains Vers, Nudibranches et Cœlentérés. 11 a la 
précieuse qualité de tuer avec une rapidité foudroyante, son action étant 
peut-être plus rapide que celle d'aucun fixateur connu, sans excepter le 
sublimé bouillant. Il a une tendance marquée à fixer les organes dans Vétal 
d'extension^ ce qui est naturellement une qualité précieuse. 11 a aussi l'avan- 
tage de ne pas causer d'opacité dans les tissus, qu'il laisse aussi transpa- 
rents que pendant la vie. La raison pour laquelle on ne l'emploie pas plus 
souvent, c'est que son action laisse à désirer sous le rapport de la bonne 
conservation des fins détails histologiques et cytologiques. Lemodusoperandi 
est d'inonder brusquement les organismes à fixer avec de l'acide acétique 
cristallisable ; les y laisser le temps nécessaire pour qu'ils en soient 
pénétrés — temps qui ne doit pas dépasser cinq à six minutes ; puis les 
transporter dans l'alcool à 50 ou 70 degrés qu'on a soin de iienouveler fré- 
quemment jusqu'à ce que l'acide ait été éloigné. Cette méthode, quelquefois 
précieuse, est due à van Beneden, voyez « TtJNicffiRS ^. 

S. Le BiÂNCO ajoute à l'acide acétique concentré un dixième de solution 
d'acide chromique à 1 p. 100. Celte petite quantité sert à combattre utile- 
ment l'action trop ramollissante de l'acide organique. 

J'ai employé de la même manière le jus de citron, qui m'a donné des 
résultats admirables sous le rapport de l'extension, mais je ne suis pas 
encore à même de me prononcer sur l'état de conservation des tissus. 

83 bis. Alcool acétique. (Garnoy, La Cellule III, 1, 1886, p. 6, et 
1887, 2, p. 276 ; van Beneden et Neyt, Bull. Acad. Roy. Sci. Belg.y 
XIV, 1887, p. 218; Zacharias, Anal. Anz., III, 1888, p. 24-27 ; van 
Geuuchten, ibid., 8, p. 237.) — Réactif important. Garnoy en a donné 
deux formules. La première : 

Acide acétique cristallisable 1 volume. 

Alcool absolu 3 — 

La deuxième : 

Aide acétique cristallisable 1 volume. 

Alcool absolu 6 — 

Chloroforme 3 — 

L*addition de chloroforme rend Tacliondu mélange plus rapide. 



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AGENTS FIXATEURS ET DURCISSANTS 59 

Van Benbden et Neyt prennent des volumes égaux d'acide cristalli- 
sable et alcool absolu. 
Zacharias prend : 

Acide acétique cristallisable 1 volume. 

Alcool absolu 4 — 

Acide osmique, quelques gouttes. 

L'alcool acétique est un des fixateurs les plus pénétrants et des 
plus rapides qui existent. Il conserve admirablement les noyaux et 
admet toutes les colorations. Il fut imaginé par les auteurs cités pour 
la fixation des œufs d'Ascaris, objet des plus difficiles ; mais il peut 
également servir pour beaucoup de tissus. 

Lavez à Talcool, et dans le traitement ultérieur évitez autant que 
possible remploi de Teau. 

84. Liqueur aux sels de cuivre (Liqueur de Ripart et Petit). 
Carnoy. La Biologie cellulaire, p. 95. 

Eau camphrée 75 gr. 

Eau distillée 75 — 

Acide acétique cristallisé 1 — 

Acétate de cuivre — 30 

Chlorure de cuivre — 30 

Pour éviter le dépôt de cristaux de camphre dans les préparations, 
on emploie de Teau camphrée non saturée. 

Cette liqueur ne fixe que très modérément, mais conserve néan- 
moins d*une manière admirable les éléments cellulaires. Elle à le 
grand avantage de « permettre à l'observateur d'y ajouter, sans 
amener de précipité, divers corps dont les circonstances lui dictent 
remploi. Ainsi, on peut y ajouter impunément une goutte d'acide 
osmique, seul ou additionné d'eau de brome, pour fixer davantage 
les cellules riches en protoplasma. La coloration du noyau s'obtient 
instantanément au sein de cette liqueur par le vert de méthyle, et 
elle s'y conserve sans altération pendant longtemps. » [Loc. cit., 
p. 127.) C'est un réactif indispensable pour les travaux délicats qui 
reposent sur l'observation de eellMles fi^aîches, isolées par la disso- 
ciation ou observées ïn situ. 

85. L'acétate d'uranium a été employé par Schenk (voy. Mitlh, aus. 
d. embi'yol. Inst, Wien, 1882, p. 95). Il convient de se servir d'une solution 
saturée dans Teau. C'est un réactif qui, d'après Gilson, donne quelquefois 
(pas toujours) de fort bons résultats, surtout pour des tissus d'Arthropodes. 
< H a l'avantage sur bien d'autres agents fixateurs de ne pas précipiter le 
vert de méthyle, et de fixer les cellules modérément, sans les contracter. Il 



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60 CHAPITRE V 

a aussi la propriété, signalée par Schenk, de diffuser assez facilement à 
travers les cuticules. (Gilson, Spermatogenèse des arthropodes y dans La Cel- 
lule, I, 1885, p. 141.) 

86. L'iode est un réactif durcissant, qui pénètre rapidement, et qui, 
quoiqu'il ne conserve pas les cellules avec une grande fidélité, peut cepen- 
dant rendre des services pour des préparations exlemporanées. On s'en sert 
en solution aqueuse dans Tiodure de potassium. Voici, d'après Fol, la for- 
mule de la solution de Lugol. 

Eau 100 parties. 

lodure de potassium 6 — 

Iode 4 — 

Fol prend une solution saturée d'iode dans une solution aqueuse con- 
centrée d'iodure de potassium et l'étend selon les cas de 100 à 500 volumes 
d'eau. {Fol, Lehrb.y p. 103.) 

S. Kent a trouvé ce réactif souvent meilleur que l'acide osmique pour 
fixer les Infusoires. 

Nous faisons observer qu'il fonctionne comme fixateur dans le < Sérum 
iodé ». 

On peut fixer instantanément les petits objets par les vapeurs d'iode. On 
chauffe des cristaux d'iode dans un tube à essais jusqu'à ce que les vapeurs 
se dégagent ; puis en inclinant le tube on les fait couler sur la préparation 
déjà placée sur un porte-objet. Le porte-objet doit alors être chauffé à 
environ 40^ G. pendant deux ou trois minutes pour chasser l'iode de la pré- 
panation. (Overton, Zeil. f. wiss. Mik., VII, I, 1890, p. 14.) 

87. Les alcools. — Sous ce titre nous comprenons les divers 
mélanges d'alcool éthylique avec de Teau dont on se sert en histolo- 
gie. De tous ces mélanges, il n'y a guère que les alcools dilués, au 
tiers environ, d*un côté, et, de l'autre, l'alcool absolu, qui puissent 
être considérés comme des agents flxateurs. Valcool absolu a l'effet 
d'un fixateur parce qu'il tue et coagule les éléments avec une telle 
rapidité qu'ils sont fixés dans leur forme avant que l'action déshy- 
dratante, pourtant si énergique, de cet alcool, ait eu le temps de 
déformer les structures molles. Il y a bien déshydratation et ratati- 
nement, mais c'est l'action coagulante rapide qui l'emporte, et l'on 
obtient des fixations qui peuvent quelquefois compter parmi les 
meilleures. L'action des alcools dilués repose sur un principe opposé. 
Dans ce cas, on choisit une dilution telle que l'alcool, qui, tout en 
gardant une propriété coagulante suffisante, contienne cependant en 
même temps une proportion suffisante d'eau pour que son action 
déshydratante soit pratiquement nulle ou du moins insignifiante. 
C'est Vaicool au tiers qui réalise le plus complètement ces conditions. 
Dans les alcools intermédiaires entre celui-ci et l'alcool absolu, c'est 
l'action déshydratante qui a le dessus, de telle sorte qu'on ne peut 



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AGENTS FIXATEURS ET DURCISSANTS 



61 



pas les employer seuls comme fixateurs. Nous ferons observer cepen- 
dant qu'on peut très bien les employer comme véhicules d'un flxateur 
foudroyant, et qu'il est quelquefois même avantageux de le faire. 
Nous pouvons ainsi augmenter la puissance de pénétration du sublimé 
corrosif. On peut également combiner avec l'alcool Tacide chromique 
ou l'acide nitrique. C'est en général Yalcool à 70 degrés qu'il con- 
vient d*employer pour ces sortes de mélanges. 

Voici, d'après Gay Lussac, un tableau destiné à donner la proportion 
d'eau qu'il faut ajouter à 100 volumes d'alcool d'un titre supérieur pour 
le ramener à un titre inférieur demandé. On cherche dans la colonne 
horizontale, en haut, le titre de l'alcool à diluer, et dans la colonne 
verticale, à gauche, celui auquel on désire arriver. Le chiffre inscrit à 
l'angle où se rencontrent le prolongement en bas de la première 
colonne et le prolongement à droite de la seconde indique en volumes 
la proportion d'eau qu'il faut prendre. 

Ainsi, pour ramener 100 volumes d'alcool à 70 p. 100 au titre de 
30 p. 100, on trouve qu'il faut 136 volumes d'eau. 



ALCOOL 

faible 
demandé. 


ALCOOL FORT A DILUER 


90 

p. 100 


86 

p iOO 


80 

p. 100 


75 

p. 100 


70 

p. 100 


65 

p. 100 


60 

p. 100 


68 

p. 100 


So 

p. 100 


p. lUO. 
85 


6.56 


















80 


13.79 


6.83 
















76 


21.89 


14.48 


7.20 














70 


31.05 


23.14 


15.35 


7.64 












65 


41.53 


33.03 


24.66 


16.37 


8.15 










60 


53.65 


44.48 


35.44 


26.47 


17.58 


8.76 








65 


67.87 


57.90 


48.07 


38.32 


28.63 


19.02 


9.47 






60 


84.71 


73.90 


63.04 


52.43 


41.73 


31.25 


20.47 


10.35 




45 


105.34 


93.30 


81.38 


69.54 


57.78 


46.09 


34.4 6 


22.90 


11.41 


40 


130.80 


117.34 


104.01 


90.76 


77.58 


64.48 


51.43 


38.46 


25.55 


35 


163.28 


148.01 


132.88 


117.82 


102.84 


87.93 


73.08 


58.31 


43.59 


30 


206.22 


188.57 


171.05 


103.53 


136.04 


118.94 


101.71 


84.54 


67.45 



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62 CHAPITRE V 

88. Alcool absolu. — Se trouve dans le commerce. Difficile à 
préparer, il est également difficile à conserver, parce qu'il est très 
hygrométrique. Fol recommande de le conserver dans des flacons à 
double fermeture, et d'y ajouter quelques morceaux de chaux vive. 
L'addition de cette substance serait utile, non seulement pour mainte- 
nir le titre de l'alcool en absorbant à mesure l'eau qui peut s'y 
introduire, mais aussi pour neutraliser les acides qui se trouvent 
presque toujours présents dans l'alcool du commerce. Je crois devoir 
ajouter à cela que l'alcool du commerce, s'il est souvent acide, est 
aussi très souvent alcalin. 

Nous avons rencontré la recommandation d*y suspendre des bandes de 
gélatine, ce qui sufûrait non seulement à le maintenir absolu, mais même 
à le rendre tel. C'est possible, mais il ne faudrait pas oublier que par ce 
moyen on risquerait de le rendre en même temps acide. 

Ranvier a introduit dans son laboratoire la méthode suivante pour pré- 
parer soi-même un alcool suffisamment < absolu » pour tous les usages 
pratiques. On prend un flacon à large goulot et de la contenance d'un 
litre, et on le remplit aux trois quarts d'alcool ordinaire fort. On y verse 
alors une certaine quantité de sulfate de cuivre calciné, en poudre, on 
ferme vite le flacon et Ton agite. On laisse en contact pendant un jour, en 
agitant de temps à autre. Puis on décante et Ton répète l'opération avec 
une nouvelle dose de sulfate de cuivre. Dès qu'en ajoutant une nouvelle 
portion de sulfate de cuivre calciné, on n'obtient pas de bleuissement 
de ce sel, et qu'en mêlant une goutte de l'alcool à une goutte de téré- 
benthine on n'obtient pas de gouttelettes d'eau visibles au microscope, on 
peut estimer que l'alcool est suffisamment anhydre pour tous les usages 
ordinaires. 

Pour préparer le sulfate de cuivre, on prend du sulfate de cuivre ordi- 
naire (CuSO^ + 5Aq), on le réduit en poudre, et on le chauffe au rouge 
pour chasser l'eau de cristallisation. 

Nous faisons observer que pour les fixations on fait bien d'être extrême- 
ment exigeant quant au titre de l'alcool. 

Pour les fixations, il faut avoir soin d'employer une proportion 
très grande d'alcool. Les pièces fixées ne doivent pas être conservées 
dans l'alcool absolu, qui les rendrait cassantes, mais dans l'alcool à 
90 p. 100 environ. Et il est même bon de ne pas les laisser trop long- 
temps dans ce dernier, si Ton veut obtenir de bonnes colorations 
nucléaires. Comme colorant des objets traités par l'alcool absolu, on 
peut employer le picro-carminou le carmin à l'alun, ou le vert de 
mélhyle. 

Ce réactif est naturellement très pénétrant. Cette propriété fait 
qu'il est fort utile pour la conservation de certains organismes qui se 
trouvent être parmi les plus imperméables. Ainsi Mayer trouve que 
l'alcool absolu et bouillant est le seul réactif qui permette de flxer 



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AGENTS FIXATEURS ET DURCISSANTS 63 

certains Arthropodes assez rapidement pour éviter la macération des 
parties internes, macération qui a lieu lorsqu'on emploie Talcool ordi- 
naire et froid, qui pénètre avec une trop grande lenteur (surtout chez 
les Trachéates). Pour les Spongiaires et les larves de ce groupe, c'est 
apparemment l'alcool absolu qui fournit les pièces le mieux conservées. 

89. Alcool au tiers {allemand: Drittelalcohol ; Ranviersche 
Alcohol dllutus; anglais : One-third alcohol ; italien : Alcool al 
terzo). — (Ranvier, Traité technique d'Histologie, 241 eipassim.) 
Cet alcool est composé de 2 parties d'eau et de 1 partie d'alcool à 
36** Cartier (= environ 39^ Baume). Puisque l'alcool à 36*^ Cartier ou 
39® Baume contient 89, 6 p. 100 d'alcool absolu, il s'ensuit que l'al- 
cool au tiers contient un peu plus de 30 p. 100 d'alcool absolu. Nous 
recommandons de le titrer soigneusement, car les eflets peuvent 
dépendre en grande partie du degré de dilution. (Voy. le tableau du 
numéro 87.) 

L'action de ce réactif est très peu énergique et partant laisse beau- 
coup à désirer sous le rapport de la conservation. Les noyaux surtout 
sont conservés d'une façon tout à fait insuffisante. Il ne durcit même 
pas toujours suffisamment pour permettre aux tissus de résister au 
ratatinement causé par l'emploi subséquent d'alcools plus forts. 
C'est donc surtout pour les préparations exteynporanées, et comme 
moyen commode de préparer des organes pour la dissociation, qu'il 
peut rendre des services. On peut laisser les objets jusqu'à vingt- 
quatre heures dans cet alcool, mais pas davantage, à moins qu'on ne 
désire produire la macération des tissus. On peut colorer avec le 
picro-carmin, le carmin aluné ou le vert de méthylë. 

90. Alcool acidulé (Paul Mayer, Mitth. Zool. Stat. Neapei, II, 1881, 
p. 7). — On ajoute 3 volumes d'acide chlorhydrique pur à 97 volumes 
d*alcool à 90 degrés dans lequel on a préalablement fait dissoudre un peu 
d'acide picrique. On ne doit y laisser les objets que juste le temps nécessaire 
pour assurer la pénétration de Talcool. Ensuite on lave dans de Talcool pur 
à 90 degrés jusqu'à ce que la coloration jaune de Tacide picrique ait disparu, 
ce qui est un signe que facide chlorhydrique a également élé éloigné. 

Ce mélange ne remplit pas l'office d'un fixateur histologique proprement 
dit, vu qu'il ne conserve pas suffisamment bien les éléments ; il sert pour 
la préparation des pièces qu'on désire conserver dans l'alcool pour Tétude 
et la dissection macroscopiques. L'addition de l'acide chlorhydrique a pour 
bot de prévenir le collage des organes par les liquides périviscéraux qui 
est la suite ordinaire de l'action de l'alcool pur ; et aussi de prévenir la pré- 
cipitation à la surface des organes des sels de l'eau de mer, circonstance 
qui met obstacle à la pénétration de l'alcool lui-même, puis à celle des 
liquides destinés à la coloration. 



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64 GHAPIXaE V 

Whitman fail observer que ce mélange perd ses propriétés après avoir 
été gardé quelque temps, la présence de Tacide donnant lieu à la formation 
de certains éthers. Il ajoute qu'on peut prendre de Talcool à 10 degrés pour 
les lavages. 

91. Alcool pour les durcissements. — Pour la manière d'em- 
ployer Talcoolpour les durcissements prolongés, voy. au numéro 33. 

L^alcool qu'on emploie le plus souvent pour les durcissements est 
soit à 90, soit à 98^. L'alcool absolu est en général moins avantageux 
sous le rapport de la bonne conservation des tissus. Il ne faut pas 
négliger de commencer par des alcools faibles, pour passer ensuite 
graduellement aux degrés plus forts. Pour des objets bien fixés, l'al- 
cool à 70 p. 100 est un excellent liquide à employer en premier lieu. 
De petits fragments de tissus perméables, comme les muqueuses, 
peuvent être durcis suffisamment en vingt-quatre heures; la moelle 
et le cerveau demandent de longues semaines. 

Nous pouvons dire de l'alcool que, employé seul, il est en général 
de beaucoup inférieur à la plupart des autres réactifs durcissants : 
mais que, employé pour faire suite à un bon fixateur et en compléter 
Faction, il rend des services inappréciables. 

92. Pyridine (de Souza, Comptes rend. hebd. Soc. de BioL, 8« sér., IV, 
n^ 35, p. 622). — La pyridine agit en même temps, d'après de Souza, comme 
durcissant, comme déshydratant et comme éclaircissant. Elle durcit vite. 
Puisque cette substance est un dissolvant des graisses, il semblerait qu'elle 
ne puisse avoir en histologie qu'application restreinte. 

93. Formaline ou formol. — L'aldéhyde formique, HGHO, pro- 
duit de l'oxydation de l'alcool méthylique, est un gaz qui se dissout 
dans l'eau jusqu'à 40 p. 100. Sa solution concentrée se trouve dans le 
commerce. Elle est livrée par la maison Schering (adr. Schering's 
Griine Apotheke, Wittickund Benkendorf, 19, Ghaussée-Strasse, Ber-' 
lin, N.) sous le nom de c Formaline », et par la fabrique de teintures 
< vormals Meister, Lucius u. Brûning », à Hôchst am Main, sous le 
nom de c Formol ». 

Il a été découvert d'une façon indépendante par F. Blum (Zeit. f. 
wiss. Mik.y X, 3, 1893, p. 314) et par Hermann (Anat. Anz., 11 déc, 
1893, p. 112) que cette substance possède des propriétés durcissantes 
et conservatrices remarquables. 

Blum a expérimenté avec du formol allongé de 10 volumes d'eau 
(donc de 4 p. 100 d'aldéhyde formique). Il a trouvé que ce liquide 
pénétrait très bien et durcissait des pièces volumineuses telles que 
foie, reins, cerveau, plus rapidement que l'alcool, et qu'après dés- 



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AGENTS FIXATEURS ET DURCISSAKTS 65 

hydratation et inclusion à la celloïdine, les coupes se montraient bien 
conservées et susceptibles de belles colorations par Thématoxyline et 
par les couleurs d'aniline. 

Hermann a employé une solution de 0,5 à 1 p. 100 de < formaline » 
de Scherîng (je pense qu'il entend dire une solution de formaline 
allongée d'eaujusqu'àcontenir de 0,3 à 1 p. 100 d'aldéhyde formique). 
Il a trouvé que cette solution durcit un organe tel qu'un cœur de veau 
parfaitement en douze à vingt-quatre heures. Les organes durcis con- 
servent à peuprès la transparence de la vie. Un œil peut être durci en 
vingt-quatre heures de telle sorte qu'avec un rasoir on peut le couper 
en deux comme une pomme ; et après cinq mois dans la solution on peut 
encore lire des caractères imprimés à travers la cornée et le cristal- 
lin. Les pigments ne sont pas décolorés. Au point de vue de la fixa- 
lion proprement dite, Hermann trouve que la formaline ne fixe ni 
mieux ni moins bien que les fixateurs ordinaires. L'inconvénient qu'il 
lui trouve pour les travaux histologiques, c'est que le traitement ulté- 
rieur par l'alcool agit d'une façon délétère sur les tissus. Il faudrait 
donc trouver le moyen d'écarter cet inconvénient pour rendre la for- 
maline propre aux travaux histologiques ; il serait d'ores et déjà 
acquis qu'elle a pour la conservation de pièces destinées aux musées 
une certaine supériorité sur Talcool ; elle ratatine moins, conserve 
les couleurs naturelles et elle est meilleur marché (1 kilogramme 
coûte de 4 à S marks et fournit 40 litres de liqueur conservatrice). 
(Au sujet de l'emploi pour les musées, voyez aussi J. Blum, ZooL 
Anz., 1893, p. 450.) 

Weigert {Anat. Ergebnisse, 1893, p. 6) a trouvé que des organes 
de l'axe cérébro-spinal durcis dans le formol peuvent être mordancés 
avec des sels de chrome et fournir des imprégnations par la méthode 
de Golgi. 

Lavdowsky {Anat. Jlefte, IV, 3, 1894, p. 355 ; Zeit. f. wiss. Mik.y 
XI, 4, 1894, p. 507) trouve que le formol fixe très bien les noyaux, 
mais vacuolise le protoplasme. Combiné avec l'alcool, il donne de 
meilleurs résultats, d'où les deux formules suivantes : 

(1) Eau distillée 20 parties. 

Alcool à 95 p. 100 10 — 

Formol 3 — 

Acide acétique cristallisable 0,5 — 

(2) Eau distillée 30 — 

Alcool à 95 p. 100 15 — 

Formol 5 — 

Acide acétique cristaUisable 1 — 

ANAT. MICROSC. £» 



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66 



CHAPITRE V 



GiLSON (m litt,) a trouvé à peu près la même chose. « Jusqu'à pré- 
sent, m'écrit-il, il a trouvé qu'employé seul (à 2 p. 100, 5 p. 100, 
10 p. 100), c'est un fixateur énergique, assez pénétrant, mais qui 
déforme notablement. » 

Strong {Anat. Anz.^ X, n? 15, 1895, p. 494) a trouvé que la forma- 
line peut être substituée avec avantage à l'acide osmique dans le 
mélange osmio-bichromique de la méthode d'imprégnation de Golgi. 
(Pour des tissus embryonnaires cependant, le mélange à la formaline 
serait inférieur au mélange à l'acide osmique, parce qu'il ne durcit 
pas suffisamment.) Il ajoute à la solution de bichromate 2,5 à S p. 100 
de formaline. 

Van GiESON {ibid,) a trouvé que la formaline à 4, 6, 10 p. 100 
(je pense qu'il veut indiquer le pourcentage d'aldéhyde formique) 
donne une excellente fixation pour la moelle épinière, le cervelet et 
l'écorce cérébrale de l'homme. On peut appliquer à du matériel 
ainsi préparé les méthodes de coloration de Weigert, de Rehm et de 
Niss'l. 

DuRiG (Anat. Anz., X, n** 20, 1895, p. 659) a également substitué 
la formaline à l'acide osmique dans le mélange d'acide osmique et 
bichromate de potasse du procédé d'imprégnation au chromate d'ar- 
gent de Golgi et Ramôn y Gajal. Il recommande un mélange conte- 
nant 3 p. 100 de bichromate et 4 à 6 p. 100 d'aldéhyde formique 
(donc 3 p. 100 de bichromate dissous dans de la formaline allongée 
de 6 à 10 volumes d'eau). Il pense que la formaline pénètre mieux 
que l'acide osmique, et ne rend pas les tissus aussi cassants. L'impré- 
gnation paraît être plus certaine qu'avec le mélange de Golgi, et 
paraît démontrer une plus grande richesse d'éléments nerveux. 

HoYERJun. {Anat. Anz,, IX, 1894, Ergànzungshefi, p. 236; Zeit, 
f, wiss. Mik,, XII, I, 1895, p. 28) a eu avec des solutions diluées (de 
1-10 ou 1-100) de mauvais résultats. Avec la solution concentrée, il 
en a eu de bons, les tissus paraissaient mieux conservés que par le 
sublimé. Après quelques heures de fixation, il durcissait dans l'alcool 
et enrobait à la paraffine. 

Reimar {Fortschr. d. Med., XII, 1894, n*» 20, p. 773 ; Zeit. f. wiss. 
Mik. XII, 1, 1895, p. 29) a fait des essais comparatifs avec le formol, 
le sublimé, l'alcool absolu et le mélange de Hermann. Il a employé 
des solutions à 10 et à 4 p. 100. Ces deux solutions ont donné des 
résultats sensiblement identiques. Il a trouvé que de ces quatre réac- 
tifs, c'est le formol qui pénètre le mieux, et qui donne en général les 
fixations les plus fines, surtout du cytoplasme. Il conclut que le for- 
mol est un des fixateurs les plus fidèles qui existent. 11 a une action 



a 



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AGENTS FIXATEURS ET DURCISSANTS 67 

très rapide, mais durcit peu ; et il a Tavantage qu*on peut y laisser les 
pièces très longtemps sans qu*elles soufTreat. 

Lachi {Monit. Zool. liai, V, 1895, p. 15 ; Zeit. f. wiss. Mik., XII, 
1, 1895, p. 33) a trouvé que le formol, en solution faible ou en solu- 
tion forte, a une action très délétère sur le tissu conjonctif, dont il 
dissout la substance fondamentale, et sur les muscles, les muscles 
striés y perdant leur striation et se ratatinant. (Reimar [L c.) dit au 
contraire que chez les muscles striés, il y a une absence presque 
totale de ratatinement.) Mais pour le tissu nerveux et épithélial Laghi 
trouve que le formol est admirable. 

J'ai essayé moi-même de substituer le formol (concentré ou peu 
dilué) à la solution d'acide osmique des mélanges de Flemmino et de 
Hermann, et je m*en suis bien trouvé. Je ne Tai pas essayé pur : mais 
il semblerait déjà que cette substance doive se montrer plutôt utile 
comme durcissant que comme agent fixateur, et plutôt en mélange 
que pur. 



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Qoo^z 



CHAPITRE VI 
DES TEINTURES 



94. Des diverses sortes de teintures. — Les colorations hîsto- 
logiques peuvent se diviser en deux groupes : les colorations générales 
(ou diffuses), et les colorations électives (ou sélectives). 

Nous appelons coloration générale, une coloration qui intéresse 
également dans leur totalité tous les éléments anatomiques d^une 
préparation. 

Nous appelons coloration élective, une coloration qui n'intéresse 
que quelques-uns de ces éléments, les autres demeurant incolores ou 
se colorant d'une autre façon que les premiers. C'est cette différen- 
ciation des éléments hislologiques par la couleur qui est le but prin- 
cipal pour lequel on emploie des réactifs colorants dans la pratique 
de Tanatomie microscopique. 

Les colorations électives se laissent diviser en deux groupes : il y a 
l'élection histologique et l'élection cytologique. Dans l'élection histo- 
logique, la coloration se porte avec élection sur tous les éléments 
appartenant à un tissu donné, les autres éléments histologiques de 
la préparation demeurant incolores, ou du moins se colorant d'une 
autre façon ; exemple : coloration des terminaisons nerveuses par le 
chlorure d'or ou par le bleu de méthylène. Les colorations de cette 
sorte s'appellent aussi colorations spécifiques. 

Dans l'élection cytologique, au contraire, la coloration se porte 
avec élection sur l'un des éléments cytologiques des cellules de 
tous les tissus de la préparation, c'est-à-dire qu'elle choisit soit les 
noyaux en général ou un élément des noyaux, soit le cytoplasme 
ou un élément du cytoplasme, son réticulum, son enchylème, ses 
granulations ou autres enclaves. La première de ces colorations 
cytologiques s'appelle coloration nucléaire, la seconde, coloration 
plasmatique. Ce sont les teintures nucléaires qui sont, en anatomie 



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DES TEINTURES 69 

microscopique générale, la classe la plus importante de colorations. 
Car, la plupart du temps, c'est surtout en vertu de leurs propriétés 
d'élection pour la substance nucléaire que les teintures rendent des 
services à Tanatomiste. Il s'en sert quelquefois à titre de réactifs 
chimiques, comme cela arrive, par exemple, lorsqu'il fait usage du 
vert de métbyle pour déceler la présence de la nucléine, ou pour 
constater son absence, dans une structure quelconque ; de semblables 
réactions jouent un rôle considérable dans les études cytologiques. 
Mais, le plus souvent, le point de vue chimique est relégué àTarrière- 
plan, et tout ce que l'anatomiste demande aux teintures, c'est de lui 
fournir des jalons indiquant les centres histologiques des tissus. Ces 
jalons, qui sont des noyaux vivement colorés, attirent le regard, qui 
peut ensuite déchiffrer avec aisance les contours et les rapports des 
éléments auxquels ces centres appartiennent ; et Ton préfère en 
général que tout ce qui est en dehors des noyaux reste incolore pour 
ne rien enlever à la transparence des préparations. Les colorants à 
action diffuse, que nous avons dit être ceux qui se portent sur la 
totalité des éléments des tissus aussi bien que sur les noyaux, sont 
aujourd'hui de plus en plus abandonnés. Ainsi, Téosine, qui fut jadis 
un colorant extrêmement en vogue, ne s'emploie guère plus comme 
réactif normal, parce qu'elle fournit des colorations diffuses et inac- 
ceptables. De pareils réactifs ne s'emploient plus que dans ces cas tout 
à fait spéciaux, soit pour teindre fortement des membranes qui reste- 
raient invisibles par suite de leur grande ténuité si on ne les colo- 
rait pas, soit, quelquefois, en combinaison avec un colorant nucléaire, 
pour rendre le même service à l'égard d'autres éléments des prépa- 
rations. 

Les colorants plasmatiques électifs, au contraire, sont de la plus 
grande utilité pour certaines recherches spéciales et il devient tous 
les jours plus évident que pour les études cytologiques ils sont indis- 
pensables. 

95. Les deux méthodes de teinture. — Dans la pratique, on 
cherche à réaliser des colorations électives de deux manières qui 
reposent sur des principes opposés. Ce sont la méthode directe^ ou 
méthode de la teinture progressive; et la méthode indirecte, ou 
méthode de la teinture régressive. Dans la première, on fait usage 
de teintures électives, c'est-à-dire de couleurs qui ont une affinité spé- 
ciale pour les éléments qu'on désire mettre en relief et les colorent 
plus rapidement que les autres éléments de la préparation ; on inter- 
rompt la coloration et on procède au lavage et à la fixation de la cou- 



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70 CHAPITRE VI 

leur au moment où celle-ci a été suffisamment absorbée par les élé- 
ments à colorer sans avoir encore envahi les autres. G*est la méthode 
ordinaire des colorations histologiques. Elle présente deux grands 
avantages : elle permet de colorer en bloc des pièces volumineuses, 
car le progrès de la teinture n'exige pas un contrôle minutieux ; et 
elle permet l'emploi des couleurs les plus stables. C'est la méthode 
des colorations ordinaires par le carmin et l'hématoxyline. Nous 
indiquerons plus loin les couleurs dont l'emploi rentre dans cette caté- 
gorie. 

Dans l'autre manière de réaliser des colorations électives, ou méthode 
régressive, on ne cherche pas à produire une localisation directe de 
la couleur sur les éléments à colorer, en faisant usage de couleurs qui 
teignent ces éléments plus rapidement que ceux que l'on désire épar- 
gner ; mais on produit d'abord une coloration générale de tous les 
éléments et l'on cherche ensuite à enlever par des lavages la couleur 
absorbée par les éléments que l'on désire épargner. C'est la méthode 
de coloration suivie de décoloration, que nous pratiquons si souvent 
sous forme de teinture au carmin boracique ; c'est aussi la méthode 
connue sous le nom de procédé de Flemming. C'est le contre-pied 
exact de la première méthode ; dans celle-ci, on interrompt la tein- 
ture avant qu'elle ait intéressé les éléments à épargner ; dans l'autre, 
on interrompt les lavages avant qu'ils aient intéressé les éléments 
dont on désire conserver la coloration. On pourrait appeler la pre- 
mière la méthode de coloration interrompue ; la seconde, la mé- 
thode de décoloration interrompue. Celle-ci s'emploi surtout pour 
la coloration de coupes. Elle ne s'applique que dans des cas plutôt 
exceptionnels (carmin boracique) aux pièces volumineuses, car elle 
exige en général que la décoloration soit surveillée de près ; elle 
trouve son application la plus importante dans les recherches cyto- 
logiques. Elle a Tavange de fournir des colorations nucléaires d'une 
extrême précision, et, ce qui est encore plus important, de permettre 
d'utiliser des couleurs produisant leur effet sur des tissus qui ont été 
fixés par des réactifs, tels que l'acide chromique, qui font obstacle 
à la coloration directe par les colorants ordinaires. Nous donnerons 
dans le chapitre ix des instructions détaillées pour l'emploi des cou- 
leurs d'aniline en teinture régressive. 

Ces deux méthodes peuvent se combiner. Si, par exemple, nous 
avons cherché à arriver à une coloration nucléaire par voie directe 
avec le picro-carmin, et que, n'ayant pas interrompu la coloration à 
temps, nous avons laissé s'établir une coloration diffuse, nous pou- 
vons cependant arriver à la localisation voulue en procédant à la 



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DES TEINTURES 71 

décoloralion des éléments extra-nucléaires par le lavage avec une 
solution faible d'acide chlorhydrique, lavage que nous aurons soin 
d'interrompre avant qu'il ait intéressé les noyaux. 

96. De la préparation préalable des tissus à colorer. — Les 

fixations ont tout autant d'importance pour la réussite des colorations 
que pour la conservation des tissus. Les éléments des tissus (à part 
quelques exceptions) ne se colorent pas du tout dans les teintures à 
l'état vivant. Les tissus récemment morts et non fixés s'y colorent, 
mais mal, et ne prennent guère qu'une coloration fugitive. Seuls, les 
tissus convenablement fixés prennent dans les teintures des colorations 
à la fois énergiques et stables. Bien des considérations portent à 
croire que dans la plupart de nos colorations histologiques, ce n'est 
pas la substance originelle des éléments des tissus que nous colorons, 
mais, au contraire, certains composés chimiques inconnus (peut-être 
souvent des albuminates métalliques) résultant de la combinaison de 
cette substance avec d'autres substances qui lui sont apportées dans 
nos liquides fixateurs et durcissants. 

On comprendra donc facilement que la nature chimique des subs- 
tances que nous employons pour la fixation et pour la préparation 
ultérieure est d'une grande importance sous le rapport des colorations. 
Quelques-unes de ces substances produisent des modifications dans 
les tissus qui s'opposent à leur coloration avec certaines couleurs ; 
d'autres, au contraire, facilitent la teinture en jouant le rôle de mor- 
dants. Telles sont (pour certaines couleurs) le chrome et ses sels, puis 
le sublimé corrosif, les aluns, les sels de fer, de platine, de palladium 
et d'uranium. On cherchera donc à tirer parti de cette propriété de 
ces substances lorsque l'occasion s'en présentera, et l'on ne perdra 
pas de vue l'utilité que peut souvent avoir la présence d'une substance 
agissant comme mordant dans les teintures elles-mêmes. L'alun, par 
exemple, joue dans beaucoup de teintures un rôle très important, 
quoique jusqu'ici inexpliqué d'une façon satisfaisante. C'est une subs- 
tance qui pénètre facilement les tissus et s'y attache avec énergie, et 
qui, d'autre part, se combine facilement avec beaucoup de couleurs. 
De plus, comme le fait observer Gierke, il s'attache à certains éléments 
des tissus avec beaucoup plus d'énergie qu'à d'autres ; il a surtout 
une très grande affinité pour la substance des noyaux. Par suite de 
ces propriétés, il sert non seulement à rendre certaines couleurs plus 
stables, mais aussi à leur faire fournir des colorations plus électives 
que celles qu'elles donnent employées seules. 

L'iode, dans plus d'un procédé, joue un rôle semblable, qu'on ne 



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7Î CHAPITRE VI 

peut expliquer qu'en lui attribuant le caractère de mordant vis-à-vis 
de certains éléments et de ceiHaines couleurs. 

96 bis. Des colorations directes et par Mordançage. — On 

distingue des couleurs qui se fixent directement sur les tissus; et 
d'autres qui ne s'y fixent que par l'intermédiaire d'une substance 
appelée « mordant b. La pratique du mordançage est très peu déve- 
loppée dans la teinture histologique jusqu'à présent, mais elle com- 
mence à être employée. On la mise en œuvre depuis longtemps 
pour certaines colorations à l'hématoxyline (Heidenhain et d*autres), 
et plus récemment, mais rarement, pour les couleurs de la houille. 
Nous décrirons au chapitre vin plusieurs colorations par mordan- 
çage à l'hématoxyline, et au chapitre x les procédés de coloration 
par mordançage aux couleurs de la houille de Henneguy, de Rawitz 
et autres. En outre il faut noter que l'emploi de l'huile d'aniline dans 
les solutions colorantes, comme aussi celui de l'acide chromique, de 
l'acide picrique ou de l'iode employés avant la teinture ou ajoutés 
aux liquides de lavage paraît rentrer dans cette catégorie. Je pense 
qu^on peut regarder comme établi que l'iode sert de mordant pour 
plusieurs couleurs d'aniline (safranine, violet de gentiane, vert de 
méthyle, bleu Victoria). Pour ces deux dernières au moins il sufBt 
de traiter les coupes pendant un quart d'heure, avant coloration , par de 
la teinture d'iode ordinaire pour voir s'augmenter beaucoup la résis- 
tance de la couleur à l'alcool de lavage. Voy. au demeurant, cha- 
pitre vni, Safranine et Violet de Gentiane. 

97. Des colorations vitales. — Il a été très souvent question 
depuis quelques années de la propriété qu'auraient certaines subs- 
tances de colorer des éléments cellulaires pendant la vie et sans porter 
atteinte d'une façon sérieuse à leur vitalité. Telles sont, en solutions 
extrêmement diluées, la quinoléine, le bleu de méthylène, le brun 
Bismarck, le noir d'aniline, le dahlia, le violet de gentiane, le rouge 
neutre (Neutralroth). Le rouge Congo est inoifensif envers certains 
organismes, même en solutions assez concentrées et colore certains 
éléments des cellules pendant la vie (Scuqltz, Centrale, f, d. med. 
Wiss. 1886, p. 449 ; Cf. Journ. Roy. Mie. Soc, 1886, p. 1092). On 
peut y colorer des Rotifères, en partie (consultez aussi à ce sujette 
travail de Martinotti, Zeit. f. wiss. Mik., V, 3, 1888, p. 305). Pour 
obtenir les résultats dont nous parlons, il faut employer des solutions 
colorantes t: es diluées et à réaction neutre ou très faiblement alcaline 
(les acides, même très faibles, sont presque toujours toxiques pour 



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DES TEINTURES 73 

les cellules). On trouve alors qu'elles teignent légèrement pendant la 
vie le cytoplasme de certaines cellules, jamais le noyau d'après mon 
expérience, ou en tout cas jamais lachromatine du noyau; si celle-ci 
se colore, c'est un signe de la mort de l'élément. La coloration est tantôt 
répandue à travers toute la substance du cytoplasme, tantôt limitée 
à certains granules ou autres enclaves du cytoplasme (on a identifié 
ces granules avec les « bioblastes > d'ALiMANN, peut-être sans raison 
suffisante, voyez les Studien ûber die ZeUe, 1886, et autres travaux 
de cet auteur). J'ai fait, depuis la publication de la l'^ édition, des 
expériences assez étendues sur le sujet de ces prétendues colorations 
< vitales >. Je suis arrivé à la conclusion qu'en aucun cas il ne se 
produit une teinture de la matière vivante dans le sens propre de ces 
mots. Lorsqu'il se produit la coloration diffuse dont j'ai parlé plus haut 
on trouvera toujours, si la cellule est restée bien vivante, qu'il ne 
s'agit pas d'une teinture proprement dite, mais d'une simple absorp- 
tion ou imbibition de la solution colorée par la cellule. Si Ton trans- 
porte la cellule dans un milieu privé de la matière colorante, elle 
abandonnera telle quelle la couleur qu'elle avait absorbée, et qui 
n'avait donc subi pendant son séjour dans la cellule aucun changement 
chimique mais était restée simplement engagée d'une façon mécanique 
dans les interstices de sa substance. Si au contraire il se produit une 
coloration des granules ou autres enclaves dont j'ai parlé plus haut, 
il se peut bien que cette coloration soit quelquefois une véritable 
teinture (elle ne Test certainement pas toujours, ce qui se laisse démon- 
trer en remettant la cellule dans un milieu non coloré et en constatant 
la disparition de la couleur). Mais en ce cas, s'il y a eu teinture véri- 
table, on pourra toujours se convaincre que cette teinture est limitée 
à des enclaves, c'est-à-dire à des éléments ne faisant pas partie de la 
trame vivante de la cellule. Ce seront des granules de substances 
venues du dehors et en train d'être assimilées, du pabulum cellu- 
laire, ou des produits kataboliques, des matériaux de rebut, ou bien 
encore des parties de la cellule qui ont subi plus ou moins l'action 
toxique de la solution colorante et se trouvent en état de vitalité 
amoindrie sinon éteinte; en aucun cas, ce ne sera delà matière plei- 
nement et parfaitement vivante. Je pense en somme que la valeur 
scientifique principale de ces colorations se trouveradans le fait qu'elles 
nous fournissent un moyen de distinguer dans une cellule les éléments 
vitaux de ceux qui ne le sont pas, ou le sont à un degré moindre. Ces 
conclusions sont aussi celles de l'excellent travail de Galeotti, Zeit. 
f. wiss. Mik,, XI, 2, 1894, p. 172. Ce travail, dont je recommande 
beaucoup la lecture, apporte à l'appui de la thèse une abondance de 



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74 CHAPITRE VI 

preuves que je ne puis songer à donner dans Tespace très limité de ce 
paragraphe. 

Aux numéros 181 et 182 se trouvent des observations qui se rap- 
portent à ce sujet. 

Tout en étant d^avis qu*il n'ex^te pas de colorations « vitales ». 
proprement dites, je me hâte cependant de dire que l'emploi de solu- 
tions colorées inolTensives dans Tétude des cellules vivantes est souvent 
d'une utilité réelle. On trouvera souvent avantage à broyer un peu 
de gentiane, de dahlia, de brun Bismarck ou de bleu de méthylène 
dans un liquide « indifférent » et à s'en servir pour l'observation de cel- 
lules des tissus. Le bleu de mélhylëne offre l'avantage d'être ample- 
ment soluble dans l'eau de mer, ce qui permet de l'employer pour 
l'étude d'organismes marins. La gentiane et le dahlia ne sont pas 
suffisamment solubles dans l'eau salée pure, mais j'ai trouvé qu'ils le 
deviennent si l'on y ajoute une trace d'hydrate de chloral (0,25 p. 100 
suffit amplement). Au chapitre des Infusoires nous parlerons de 
l'emploi de la quinoléine et du brun Bismarck. La coloration du brun 
Bismarck peut être ViKée dans les cellules au moyen d 'acide chromique 
à 0,2 p. 100 ou de solution de sublimé (Mayer). Le bleu de méthy- 
lène fera l'objet d'un chapitre spécial (chap. ix). 

98. Choix d'une teinture. — Les quelques conseils qui suivent 
sont à l'usage des commençants seulement. 

A. Pour les objets qui doivent être colorés en entier, nous recom- 
mandons en premier lieu le carmin au borax alcoolique de Grena- 
CHER. C'est un réactif qui, pour les travaux ordinaires d'anatomie 
microscopique, rend de grands services. C'est un colorant des plus 
énergiques et des plus précis, et le plus facile de tous à employer. 
On y pourra substituer, selon les cas, le Paracarmin de Mayer. Ce 
colorant me paraît être un réactif plus délicat, mais qui demandera 
souvent la possession de plus de jugement de la part de l'opérateur. 

Pour les objets petits et facilement pénétrables, le carmin à l'alun 
(en comprenant sous ce titre les formules de Grenacuer et de Partscu 
et le Carmalun de Mayer, réussit très bien. Le carmin à l'alun est la 
plus délicatement élective de toutes les teintures faites de couleurs 
stables et employées pour la méthode de coloration progressive. Mal- 
heureusement c'est une teinture aqueuse, ce qui en limite l'appli- 
cation ; cependant, avec les modifications que nous indiquerons, 
elle peut encore servir pour la coloration de pièces assez volumi- 
neuses. Nous la recommandons particulièrement. Pour les objets 
fixés par les sels de chrome, nous recommandons, outre ces teintures 



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DES TEINTURES 1^ 

qui avec ces objets ne donnent pas toujours les résultats voulus, les 
colorants à Thématéine, soïiV Hémalun ou VHémacalctum deMAYER. 
B, Pour la coloration de coupesy outre THémâlun, nous recom- 
mandons la safranine ou le violet de gentiane, si Ton n'a besoin 
que d'une coloration nucléaire. Si Ton veut en même temps une 
coloration plasmatique, je conseille avant toutes autres la combinai- 
son de Kemschwarz suivi de safranine (voy. ces mots). Comme 
colorant plasmatique diffus, nous recommandons Vacide picrique, 
qu'on peut employer en coloration double avec Tun ou l'autre des 
réactifs que nous avons cités, et qui rend des services en mettant en 
évidence le cytoplasme des cellules. Ce procédé n'est pas à comparer 
comme résultats à ceux du Kernschwarz suivi de safranine ou des 
autres combinaisons connues, que nous apprécierons au chapitre des 
Colorations combinées, mais il a l'avantage d'être d'une simplicité 
élémentaire. Pour les objets frais et dissociés, nous recommandons 
le vert de méthyle. Il est bien certainement le réactif le plus absolu- 
ment précis que nous connaissions pour la coloration de la nucléine 
par teinture progressive. C'est le réactif par excellence des cytologistes. 
Malheureusement le vert de méthyle est une couleur fugitive, très 
difficile à monter au baume, et pour cette raison nous ne le recom- 
mandons pas pour les travaux ordinaires d'anatomie microscopique. 

99. Produits chimiques tinctoriaux. — Dans la plupart des 
procédés de coloration histologique il est important de travailler 
avec des produits chimiques purs. Cela est particulièrement essentiel 
pour les teintures aux couleurs de la houille. Pour celles-ci, il ne 
suffit pas de se procurer un produit portant le même nom qu'un 
produit qui a été décrit comme donnant tels ou tels résultats histolo- 
giques. Il faut que ce soit la même marque de la même fabriqua 
qui a été employée par l'auteur qui l'a recommandée. Des produits 
portant le même nom, mais fournis par des maisons diverses, donnent 
très souvent des résultats tout à fait différents. (Voy. au paragraphe 
Safranine ce qui est dit sur les différentes marques commerciales de 
cette substance.) Les auteurs les plus consciencieux indiquent en 
général la source originelle des produits qu'ils recommandent, et 
l'on peut se les procurer soit eu s'adressant directement à la maison 
d'origine, soit par l'intermédiaire d'un fournisseur connu de réactifs 
pour microscopie. Si l'on choisit cette dernière voie, il est bon de 
demander l'envoi dans l'emballage originel, avec date, ceci pour 
garantir une fraîcheur suffisante des substances, plusieurs d'entre 
elles ne se conservant pas indéfiniment. 



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76 CHAPITRE VI 

Je recommande particulièrement comme fournisseur la maison 
D*" G. Griibler and G°, 63, Bayersche Slrasse, Leipzig. Cette maison a 
la spécialité de réactifs histologiques vérifiés et ne livre que des cou- 
leurs qui ont bien fourni à Tessai la teinture désirée. La maison livre 
également des liquides colorants ou fixateurs, masses d'inclusion ou 
d'injection, etc., préparés selon les formules classiques. Je recom- 
mande beaucoup ces produits, qui sont en général supérieurs à ceux 
que les histologistes préparent eux-mêmes. On peut les commander 
d'après le prix courant, ou simplement en citant les numéros des 
formules de ce livre. 

Une autre maison allemande de conûance est celle du D** G. Miin- 
der, Mikroskopisch-chemisches Institut, Gôttingen. 

Le lecteur connaîtra sans doute des maisons françaises de confiance 
pour les réactifs chimiques ordinaires. J'ai tenu ici à insister sur ce 
que, pour les teintures histologiques aux couleurs d'aniline^ il est 
absolument nécessaire, pour les procédés classiques, que les cou- 
leurs employées proviennent en dernier lieu des sources indiquées 
par les auteurs, lesquelles sont presque toutes des fabriques alle- 
mandes. 



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■^ifnppiBiijuii I piip^pn^|rm«i9nn 



CHAPITRE VII 
CARMIN ET COCHENILLE* 



100. Théorie des teintures au carmin. — Les considérations 
suivantes sont prises dans Timportant mémoire de Paul Mayer, 
Ueber das Fdrben mit Carmin ^ Cochenille und Haernatëin-Tho- 
nerde, dans Mitlh. a. d. Zool. StaL zu Neapel, X, Hft 3, p. 480. 
Les principes de la teinture histologique au carmin ont été jusqu'à 
présent obscurcis par Tidée erronée que le carmin ne serait que de 
Tacide carminique avec au plus quelques impuretés. Or il n'en est 
pas ainsi. D'après l'analyse de Liebermann [Ber, d. chem. Ces,, Jahrg. 
18, 4886, p. 1969-1975), le caripin serait un très remarquable com- 
posé aluminO'Calcioprotéique de V acide carminique^ véritable com- 
posé chimique, duquel en tout cas Valuminium et le calcium ne peu- 
\ent pas plus être absents que le sodium du sel de cuisine. Son 
analyse donne environ 17 p. 100 d'eau, 20 p. 100 de matières azotées, 
56 p. 100 d'acide carminique, au moins 3 p. 100 d'alumine et 3 p. 100 
de chaux, avec une faible proportion de magnésie, de potasse, de 
soude, d'acide phosphorique, et une trace de cire. Les expériences de 
Mayer l'ont conduit à la conclusion que dans la teinture histologique 
(il ne s'agit pas ici de teinture industrielle) les éléments actifs de ce 
composé sont en général seulement l'acide carminique et l'alumine, 
avec, en certains cas particuliers, la chaux. Les autres bases sont 
inactives; et les matières azotées, si tant est qu'elles agissent, ont 
un effet nuisible, car c'est à leur présence qu'est due la putrescibilité 
des solutions. 

Ces conclusions une fois établies, il est tout à fait logique d'admettre 
qu'il convient de prendre comme base de nos teintures^ non le car- 

* Nous avons beaucoup d'obligation à M. le D' Paul Mayer, qui a bien voulu 
lire et critiquer ce chapitre, ainsi que le précédent et le suivant. 



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78 CHAPITRE VII 

min, mais V acide carminique. Cette proposition avait déjà été faite 
par DiMMOCK {Amer. NaiuraL, XVIII, 1884, p. 324-7). Mais la tenta- 
tive de DiMMOCK n'avait pas réussi, pour ce motif, que dans la com- 
position de ses teintures, il avait omis Vêlement essentiel, Valumine, 
11 colorait, par exemple, avec des solutions alcooliques d*acide car- 
minique pur, ou de carminate d'ammoniaque pur. De telles solutions 
colorent, il est vrai, mais faiblement et d'une manière diffuse. Mayer 
a donc cherché la manière de les combiner avec Talumine. 

L'acide carminique est une substance solide d*un brun pourpre, 
facilement soluble dans Teau et dans Talcool. D'après Nietzki, Chemie 
der organischen Farbstoffe, 1889, p. 231-234, c'est un acide dit 
basique faible (Liebermann dit fort), formant avec les métaux alca- 
lins des sels solubles, avec les métaux terreux et lourds des sels violets 
insolubles. 

Le sel aluminique (carminate d'alumine) s'obtient en précipitant 
une solution d'acide carminique ou de carminate d'ammoniaque par 
de l'acétate d'alumine. Il a la propriété remarquable d'être soluble 
en même temps dans les acides et les sels acides, tels que l'alun, et 
dans les alcalis et les sels alcalins, tels que le borax, à condition qu'on 
ne prenne comme dissolvant que l'eau ou de l'alcool allongé d'eau. 

Il se laisse précipiter également de ces solutions par le chlorure 
d'aluminium, mais seulement en partie ; l'alun ne donne pas lieu 
à un précipité, il se forme du carminate qui reste en solution. De là, 
la composition de la teinture décrite plus loin sous le titre de 
Garmalun. 

Nous avons dit que les solutions se précipitent en partie par le 
chlorure d'alumine. Le carminate ainsi précipité se redissout dans 
un excès de chlorure, ajouté avec précaution. Cette opération fournit 
la teinture décrite au numéro 105, teinture qui trouvera son utilité 
pour les cas où il est désirable de ne pas employer un liquide con- 
tenant de l'alun. 

L'une et l'autre de ces teintures colorent en un ton violet assez 
semblable à celui du carmin à l'alun de Grenacher. On peut obtenir 
un ton plus rouge en ajoutant du chlorure de calcium à la solution 
de Garmalun. Mais cela n'est pas à conseiller, car l'addition de chlo- 
rure de calcium précipite la solution en formant du gypse. L'addition 
de chlorure de calcium ne précipite naturellement pas la solution 
au chlorure d'aluminium; mais pour d'autres motifs on n'obtient 
pas de bons résultats en additionnant ainsi la solution de chlorure 
d'aluminium dont nous avons parlé jusqu'ici. On arrive au but en 
additionnant de chlorure de calcium une solution alcoolique de 



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'i H P fâi ii; 



CARMIN ET COCHENILLE 79 

chlorure d'aluminium. De cette façon on obtient une teinture alcoo- 
lique donnant une coloration rouge. Ce liquide sera étudié plus loin 
sous le titre de Paracarmin. 

II sera intéressant de comparer ces considérations théoriques sur 
les teintures à Tacide carminique avec ce qui sera dit plus loin 
(n* 124) sur la théorie des teintures à Thématoxyline. On y remar- 
quera un certain parallélisme instructif. Dans les deux cas, ce n'est 
pas la matière colorante seule qui agit, c'est toujours cette matière 
associée à Valumine. 

La teinture s'obtient toujours au moyen de l'acide carminique plus 
l'alumine ou au moyen de l'hématéine plus l'alumine ; d'autres subs- 
tances, telles que la chaux, jouant rarement un rôle dans la teinture. 

101. Théorie des teintures à, la cochenille. — D'après Mater, 
dont les plus anciennes recherches sur cette matière se trouvent con- 
firmées par ses études les plus récentes [Mitth. ZooL Slat. Neapel, 
X, 3, 189â, p. 496), le principe actif des extraits ou teintures histolo- 
giques de cochenille n'est pas l'acide carminique libre, mais un com- 
posé de cet acide avec une base, laquelle n'est pas la chaux mais un 
alcali. L'extrait aqueux de cochenille ne contient que des traces de 
chaux, l'extrait alcoolique n'en renferme pas même des traces. 
L'extrait aqueux, préparé au moyen de Yalun (soit cochenille de 
Partsch ou de Czokor), doit ses propriétés tinctoriales à la formation 
d'un canninate d'alumine^ sel dont les propriétés générales ont été 
discutées dans le paragraphe précédent. La teinture préparée avec 
Yalcool pur ne contient au contraire que ce carminate d'un alcali 
que nous avons mentionné tout à l'heure. Ce carminate seul colore 
d'une façon faible et diffuse, comme le fait l'acide carminique seul. 
Mais s'il se rencontre, dans les tissus à teindre, avec des sels de 
chaux, d'alumine ou de magnésie qui soient capables d'entrer en com- 
binaison avec lui et de fournir au sein des tissus des précipités colorés 
insolubles, alors il peut résulter une coloration énergique et très élec- 
tive. En efTet, Vancienne teinture alcooliqu^e simple de Mayer donne 
des colorations superbes avec certains objets, c'est-à-dire avec ceux 
qui contiennent les sels en question. Malheureusement les objets 
ainsi constitués sont plutôt rares, et avec la plupart des objets histo- 
logiques la coloration fournie par cette teinture est assez pâle. 

Or Mayer a trouvé qu'en ajoutant les sels en question à la teinture 
on obtient une solution colorante qui contient elle-même tous les 
éléments nécessaires pour fournir une coloration forte et élective 
avec toutes sortes d'objets. D'où la nouvelle formule, n** 120. 



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80 



CHAPITRE VU 



102. Acide carminique pur. — On peutseleprocurerchezE. Merck 
à Darnir^tadl, ou chez Grûbler (adr. dans le chap. précédent). Le prix 
(variable 1 est dans les environs de 2 fr. 50 âS fr. parlOgrammes.M.le 
D"" Maycr m'écrit du reste que la qualité laisse souvent à désirer ; des 
ôchaïUillons récemment fournis se sont trouvés contenir souvent un 
peu d*aiïimoniaque ou d'alcali fixe. 

103. Choix d'une teinture au carmin. — Dans mon opinion, 
l'uLililù ^ îisentielle des teintures au carmin se trouve dans leurs 
exccllLuites qualités pour les colorations d'objets entiers. Pour les 
coupes, je les trouve décidément inférieures aux anilines classiques 
et à plusieurs teintures à Thématéine. On peut donc rejeter toutes 
les anciLMioes formules proposées pour la coloration de coupes. Pour 
les autres, il y a lieu de croire que les formules de Mayer viendront 
sous peu, en vertu de leur rationalité et de l'égalité constante des 
produils (|u*elles fournissent, à prendre la place de bien des teintures 
jus«|u'ici fort estimées. Ce ne sera peut-être pas tant en vertu d'une 
supériorilé absolue des liquides de Mayer au point de vue de la pré- 
cision oi] de l'énergie de la coloration^ que pour d'autres motifs. Je 
n'ai pas pu trouver (Mayer du reste ne Ta jamais affirmé) que le 
I^aracaiMiin soit toujours supérieur au carmin boracique sous ces 
rapportai, bien qu'il fournisse certainement souvent une coloration 
plus fine. IjC carmalun m'a donné dea colorations égales en beauté 
et eu prt cision à celles du carmin aluné, mais pas supérieures. Les 
deux liquides de Mayer ont cependant d'autres points de supériorité 
que nous cnumérerons dans leurs paragraphes respectifs. Je pense 
f|ue, s'il n'était un peu coûteux, le Carmalun pourrait remplacer avec 
avaiilage le carmin aluné dans les laboratoires, mais que pour le 
iDonient il faudra maintenir le carmin boracique à côté du Paracarmin. 

En tout cas, il y a lieu d'espérer que les démonstrations de Mayer 
auront rrossi à barrer le flot de formules irrationnelles pour tein- 
tures au carmin qui nous a si longtemps assiégés. 

TEINTURES AQUEUSES 

a. Solutions acides *. 

104. Carmalun (Mayer, 3fitth, ZooL Stat. Neapel, X, 3, 1892, 
p, 481Ï). — Acide carminique, 1 gr. ; alun, 10 gr. ; eau distillée, 

* Les sohilions aluniqiies qui vonl suivre doivent être évitées pour les objets 
qui contiennent des éléments calcaires. 



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CARMIN ET COCHENILLE 



8t 



200 ce. Faire dissoudre à l'aide de la chaleur * ; décanter ou flitrer. Il 
faut ajouter un antiseptique, soit quelques cristaux de thymol, ou 
1 p. 1000 d'acide salicylique ou enfin 8 p. 1000 de salicylate de soude. 
Liquide d'un rouge clair, d'un ton violacé. Il colore bien les pièces 
volumineuses, même après traitement par les solutions osmiques. On 
peut laver à l'eau distillée, mais en ce cas le plasma demeurera un 
peu coloré. Si l'on désire éviter cela, il faut laver, avec précaution, 
dans une solution d'alun, ou dans des cas difûciles, avec un acide 
très faible. L'effet général est celui d'une coloration au carmin aluné. 
La différence principale, c'est que le Garmalun est très approprié aux 
colorations en masse de pièces assez volumineuses, besogne pour 
laquelle le carmin à Talun n'est pas très adapté si l'on s'en sert sans 
autres précautions (mais voyez au n*» 107). 

On peut faire une solution moins forte en prenant de 2 à 3 fois autant 
d'alun et 5 fois autant d'eau et faisant dissoudre à froid. On obtient une 
80 ution qui ressemble peut-être encore plus au carmin aluné, mais qui 
colore cependant en un ton un peu plus rouge. Celte teinture me parait 
bien un peu faible pour le travail ordinaire. 

Il faut bien observer qu'avec l'une ou l'autre de ces solutions les 
tissus à colorer ne doivent pas avoir une réaction alcaline. 

Les autres propriétés de ces solutions sont très semblables à celles 
du carmin aluné (voyez § 106). 

105. Solution au chlorure d'aluminium (Mayer, ibid,, p. 490) — 
Acide carminique, 1 gr. ; chlorure d'aluminium, 3 gr. ; eau, 200 ce. Ajouter 
un antiseptique, comme pour le Carmalun. 

Emploi comme pour le Carmalun. La coloration est d'un violet bleu 
énergique et élective ; le plasma cependant s'y colore un peu plus fortement 
qu'avec le Carmalun. Mayer recommande cette teinture seulement à titre de 
succédané du Carmalun, pour les cas où celui-ci serait contre-indiqué à cause 
de l'alun qu'il contient, ou pour un autre motif semblable. 

106. Carmin à l'alun ; Carmin aluné ; Carmin alunique 

(Grenacher, Arch, f, mik. Anat., XVI, 1879, p. 465). — A une solu- 
tion aqueuse d'alun de potasse ou d'ammoniaque, d'une concentra- 
tion de 1 à 5 p. 100, ou de toute autre concentration qu'on préfère, 
on ajoute 0,5 à 1 p. 100 de carmin en poudre, et l'on fait bouillir 
pendant dix à vingt minutes. 11 vaut peut-être mieux se servir d'une 
solution d'alun très concentrée, et, après l'avoir fait bouillir avec le 
carmin, l'allonger au degré voulu. Après refroidissement, filtrer. 
(Nous avons l'babitude d'ajouter à notre solution un peu d'acide phé- 

* J'ai pu facilement faire mes solutions & froid. 

AÏIAT. IIICROSC. a 



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82 CHAPITRE VII 

nique ou un cristal de thymol pour prévenir le développement de 
moisissures.). 

Nous avons déjà dit que le carmin à Talun est, de tous les carmins^ 
le réactif le plus délicat dans ses résultats. C'est un colorant nucléaire 
presque absolument pur. En dehors de la chromatine des noyaux, il 
n'y a guère que les nucléoles et la substance contractile des muscles 
striés qui s'y colorent. Ce carmin présente le grand avantage qu'on 
peut laisser les préparations indéfiniment dans les solutions sans 
crainte de voir se produire des surcolorations. Les colorations sont 
stables dans le baume et dans la glycérine neutre ; elles le sont moins 
dans la glycérine acidulée. 

Il ne faut pas employer ce colorant pour des objets contenant des 
éléments calcaires qu'on désire conserver. 

Cette teinture a deux défauts : elle colore lentement, et pénètre 
assez mal. Ce dernier inconvénient peut être écarté par l'emploi du 
procédé de Henneguy, que nous allons donner. 

Des modifications de celte formule, qui nous paraissent peu utiles, ont 
été proposées par Tizzoni. (Bull. Se. Med. Bologna, 1884, p. 259 ; Jouni. Roy. 
Mie, Soc, 1885, p. 730) ; Pjsenti (Gazetta degli Ospetali, n'* 24, 1885 ; Zeit. 
f. wiss. Mik., II, 188o, p. 376); et Grieb (Mem. Soe. liai. Set., t. VI, d® 9, 
1887 ; ZeiUf. wiss. Mik., VII, I, 1890, p. 47.) 

107. Carmin aluné à l'acide acétique (Henneguy). , — On 
fait bouillir du carmin en excès dans une solution saturée d'alun de 
potasse. Après refroidissement, on ajoute 10 p. 100 d'acide acétique 
cristallisable, et on laisse reposer le mélange pendant plusieurs jours. 
Il se fait un dépôt de carmin et d'alun ; on Oltre. 

Pour colorer les pièces, on les met dans l'eau dislillée, à laquelle 
on ajoute quelques gouttes de la solution de carmin, de manière à 
obtenir une teinte rose foncée. Elles restent dans la teinture vingt- 
quatre à quarante-huit heures, selon leur nature ; puis on les lave 
pendant une heure ou deux dans de l'eau distillée. Il importe d'em- 
ployer de l'eau distillée, pour éviter la formation de cristaux dans 
les pièces. On traite ensuite par l'alcool à la manière ordinaire. 

L'avantage de ce carmin est d'avoir un pouvoir pénélrant très 
grand et de colorer également toutes les parties aussi bien profondes 
que superficielles. Il a l'inconvénient de donner une coloration lilas 
qui n'est pas agréable à Tœil ; mais on peut rendre la coloration plus 
rouge en plaçant les pièces lavées dans de l'alcool additionné d'acide 
chlorhydrique, comme lorsqu'on emploie le carmin au borax. 

Les préparations se conservent très bien dans le baume, moins 
bien dans la glycérine. 



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CARMIN ET COCHENILLE 83 

Une autre manière d'employer le carmin aluné pour la coloration de 
pièces volumineuses est celle qui m'a été communiquée par Zoltan von 
RoBOZ (solution très allongée de carmin aluné additionnée de quelques 
gouttes de solution faible d'acide osmique). 

Ce procédé donne des colorations superbes, mais j'en supprime les détails, 
parce qu'il est assez difficile à régler avec exactitude, et parce qu'on arrive 
à peu près aux mêmes résultats, et avec une complète certitude, par le 
Carmalun, ou par le procédé de Flenneguy. 

108. Cochenille à Talun (Partsch, Arch. f, mik. Anat,, XIV, 
1877, p. 100). — Faire bouillir de la cochenille avec une solution 
d*alun à S p. 100, filtrer, et ajouter un peu d'acide salicylique pour 
prévenir le développement de moisissures. 

Une autre formule a été donnée par Czokor {Arch. f, mik. Anal,, XVIII, 
1880, p. 413). 

Les deux formules de Partsch et de Czokor ont été soigneusement étu- 
diées par Paul Mayer {Mùlh. SlaL Zool. Neapel., X, 3, 1892, p. 496), qui 
trouve que celle de P.aBtscii est la plus rationnelle. Elle contient la bonne 
proportion d'alun, tandis que la formule de Czokor n'en contient pas assez. 
Aussi la solution de Partsch se conserve mieux ; celle de Czokor précipite 
volontiers. 

Le mode de préparation conseillé par Rabl, leit. f. wiss. Mik., Xï, 2, 
1894, p. 168, n'est qu'une modification insignifiante de celui de Czokor. 

Ces deux formules fonrnissent une teinture de la plus haute pré- 
cision. La chromatine des noyaux se colore en bleu, d'autres éléments 
prennent des teintes rouges diverses, ce qui produit reffet d'une 
coloration double. Ces solutions colorent en un temps plus ou moins 
long des tissus qui ont subi n'importe quel genre de préparation 
préalable. Des tissus préparés par l'alcool se colorent en trois à quatre 
minutes; ceux qui ont été préparés par l'acide chromique demandent 
trois à cinq heures. 

Ces solutions sont peut-être supérieures comme richesse de colora- 
tion au carmin à l'alun. Nous ne saurions dire si les colorations sont 
également stables. Il faut en tout cas éviter les milieux acides, et 
monter dans la glycérine neutre ou, ce qui est mieux, dans le baume. 

109. Carmins picro-alunés. — Les préparations faites au car- 
min aluné peuvent être traite'es après coup par Tacide picrique, et 
fournir ainsi des colorations doubles qui sont quelquefois très utiles. 
Légal combine les deux teintures, en raison de dix volumes de carmin 
à l'alun et un volume de solution saturée d'acide picrique [Morphol. 
Jahrh,^ VIII Bd., p. 353.) On peut en agir ainsi avec n'importe 
lequel des carmins alunés que nous venons de passer en revue. Les 
résultats sont quelquefois fort beaux. 



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84 CHAPITRE Vil 

110. Carmin acétique (Schneider, ZooL Anzeig., 1880, p. 254). — On 
fait bouillir une solution d'acide acétique d'une concentration de 45 p. 100, 
et Ton ajoute du carmin jusqu'à ce qu'il ne s'en dissolve plus ; puis on filtre. 
(C'est, à ce que dit Schneider, à la concentration de 45 p. 100 que l'acide 
acétique dissout la plus grande proportion de carmin.) 

Pour s'en servir, on peut ajouter une goutte de la solution concentrée à 
des objets frais placés sur le porte-objets : c'est la méthode dont Flemming 
s'est servi dans ses importantes recherches sur la fécondation de l'œuf des 
Ëchinides. Ou bien on peut se servir d'une solution diluée à 1 p. 100, pour 
la coloration lente. 

Ce réactif a ceci de particulier, qu'il fixe en même temps qu'il colore. La 
solution est extrêmement pénétrante, fixe bien pour un certain temps (mais 
seulement pour un certain temps) et peut ainsi servir pour l'élude d'objets 
frais. Coloration nucléaire. Malheureusement les préparations ne se con- 
servent pas. 

Ce carmin a rendu des services autrefois comme fixateur colorant. Je 
pense qu'aujourd'hui il vaut infiniment mieux s'adresser pour cela au vert 
de méthyle acide. 

110 bis. Carmin acéto-ferrique de Zacharias (Zool. Anz.y 
n<> 440, 1894, p. 62). 

Acide acétique dil. à 3 p. 100 150 à 200 gr. 

Carmin 1 — 

Faire bouillir en remuant continuellement pendant 20 minutes, 
laisser refroidir et filtrer plusieurs fois. Colorer pendant plusieurs 
heures, 6 à 24 ou plus. Rincer à Tacide acétique dilué, et mettre (il 
faut éviter de toucher les objets avec des instruments métalliques) 
dans une solution à 1 p. 100 de citrate de fer ammoniacal (c'est bien le 
Ferriet AmmonimCitras des pharmacies). On peut y laisser les objets 
jusqu'à 2 ou 3 heures. Ils y prennent une teinte noire (pour les coupes, 
c'est une teinte grise, qui arrive déjà au bout de quelques minutes). 
Il ne faut pas prolonger le séjour dans la solution de sel de fer au delà 
du temps nécessaire, car les surcoloralions sont à craindre. On lave 
pendant plusieurs heures à l'eau distillée, on déshydrate, on éclaircit 
(Zacharias se sert pour cela de créosote), et on monte au baume. 

Après essai, je pense que celte méthode pourra bien rendre des 
services dans certains cas. L'eflet générai est plutôt celui du Kern- 
schwarz que de l'hématoxyline, à laquelle Zacharias a comparé son 
colorant. Lachromatine est bleuâtre (franchement bleue à l'état kiné- 
tique), les éléments plasmatiques brunâtres. J'engage l'observateur à 
ne pas se laisser rebuter par l'aspect peu esthétique des préparations. 
On observera que ce procédé a l'avantage de pouvoir s'appliquer à la 
coloration d'o6;'e/s entiers. (M. le D'Paul Mayer me fait observer qu'il 
faut que les objets soient j^e^eïs, sans cela le sel de fer envahit tout.) 



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CARMIN ET COCHENILLE 



85 



Au point de vue surtout de la coloration plasmatigtce^ j'estime que 
c'est une méthode sérieuse. Je n'en connais guère qui démontrent 
aussi bien les fuseaux karyokinétiques. 

Comme me Ta fait observer M. le D*" Paul Mayer, on obtient le même 
effet en traitant par Je sel de fer après coloration par le Garmalun. 
Après un essai comparatif des deux carmins, je pense que celui 
de Zacharias est superflu, mais que son procédé constitue une manière 
de faire virer les préparations au Garmalun qui peut souvent avoir 
son utilité pour l'étude des éléments plasmatiques. 

b. Solutions alcalines ou neutralisées. 

111. Le c pioro-oarminate d'ammoniaque », ou picro-oarminest 

un réactif qui possède certaines qualités importantes. Il ne nuit guère aux 
tissus les plus délicats ; et, quand il est bien préparé, il donne des colora- 
tions assez précises. Malheureusement la préparation en est toujours incer- 
taine, à cause de la difficulté que présentent le dosage des ingrédients et la 
détermination du point exact de neutralisation. Les solutions sont passable- 
ment stables* ; et les colorations sont parfaitement permanentes, soit dans 
le baume, soit dans la glycérine, à condition cependant que la glycérine 
soit acidulée avec 1 p. 100 environ d'acide acétique, ou d'acide formique (ce 
qui est mieux). 

Dans une bonne préparation au picro-carmin, les noyaux doivent être d'un 
beau rouge, le cytoplasme orange. On peut facilement corriger les surcolora- 
tions ou les colorations diffuses en lavant à l'acide chlorhydrique. On peut 
prendre à cette fm le mélange d'acide chlorhydrique et d'alcool dont on se 
sert pour décolorer les pièces qui ont été colorées par le carmin au borax ; 
ou bien on peut avec avantage employer un mélange de glycérine et de HCl 
(jusqu'à 0,5 p. 100). 

Ce n'est point selon nous dans la coloration double que fournit le picro- 
carmin qu'il faut voir la valeur essentielle de ce réactif. C'est plutôt en ce 
qu'il est assez inoffensif pour les cellules, et en conserve bien les formes, 
tout en donnant lieu à une légère macération. 11 est souvent fort utile pour 
produire en même temps la macération et la coloration. Grâce à l'action 
conservatrice de l'acide picrique, on peut souvent laisser les pièces fort 
longtemps dans la teinture sans inconvénient. 

J'ai essayé bon nombre des formules de préparation citées ci-dessous. 
■ Aucune ne m'a paru avoir des avantages réels sur les autres. 

112. Picro-carmin (Ranvier, Traité technique d'Histologie^ p. 100). 
— Dans une solution saturée d'acide picrique, on verse du carmin dissous 
dans l'ammoniaque, jusqu'à saturation; puis on évapore dans une étuve. 
Après réduction des quatre cinquièmes, la liqueur refroidie abandonne un 
dépôt, peu riche en carmin, qui est séparé par flltration. Les eaux mères 

* Il est cependant bon d'y ajouter un antiseptique pour prévenir le dévelop- 
pement de moisissures. On peut employer à cet effet l'hydrate de chloral (l p. 100/, 
ou l'acide phénlque. 



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86 CHAPITRE Vil 

évaporées donnent le picro-carminate solide sous la iorme d*une poudre 
cristalline de la couleur de Focre rouge. Cette poudre doit se dissoudre 
entièrement dans Teau distillée ; une solution au centième est la plus con- 
venable. 

Ce mode de préparation ne donnant nullement toujours un produit 
constant, Vignal recommande le suivant : 

113. Picro-cannin. Mode de préparation employé dans le laboratoire 
d*Histologie du Collège de France. — Nous devons la formule suivante à 
l'obligeance de M. Vignal ; 

Eau 1,000 

Acide picrique 20 

Carmin 10 

Ammoniaque 50 

Mettre dans un flacon bouché et laisser pendant deux ou trois mois dans 
un endroit chaud. Puis laisser pourrir dans un grand cristallisoir; lorsque 
le liquide est évaporé jusqu'à ne plus occuper que les 4/5 du volume pri- 
mitif, enlever les cristaux d'acide picrique qui sont au fond du vase. Laisser 
sécher, puis dissoudre dans un peu d'eau chaude. Filtrer et examiner au 
microscope si le carmjn est bien dissous. Dans le cas où il ne l'est pas, 
ajouter de l'eau et de l'ammoniaque et laisser pourrir de nouveau ; puis 
refaire la même opération que précédemment. 

Lorsque le carmin est combiné, faire sécher la liqueur à Tétuve et la 
réduire en poudre. 

Un gramme de poudre dissous à chaud dans 100 grammes d'eau donne 
le picro-carmin. On y ajoute un petit cristal de thymol au moment où l'on 
fait dissoudre la poudre, pour éviter le développement des moisissures. 

114. Autres formules pour la préparation du picro-carmin. 

Weigert, Virchow's Archiv., LXXXIV, p. 275, 315 (très aléatoire). Gage, 
Am. Mon, Mie. Jowm., 1, 1880, p. 22; Joum, Roy. Mie. Soc.^ lll, p. 501 
(compliqué, et ne m'a pas fourni un produit soluble). Fol, Lehrbuch, p. 195. 
RuTiiERFORD, Pract. Ilist.y p. 173. Mayer, Milth, Zool. Stat. Neapel, II, p. 20. 
Baber, Mon. Mie, Jovm,^ XII, p. 48. Peroens, Biologie cellulaire de Carnoy, 
p. 92. IIOYER, BioL Centralb., II, 1882, p. 17. Bizzozero, Zeit. f. wiss. Mik.^ 
1885, p. 539. Klemensiewics, Sitzb.Akad. Wiss. Wien, LXXVIII, IgT/S, III, 
JuNi; Zeit. f. wiss. Mik., I, 1884, p. 501. Cuccati, ibid., VI, I, 1889, p. 42. 
(Picro-carmin à la soude) Loewentiial, Anat. Anz., II, 1887, p. 22, et Zeit. 
f. wiss. Mik., X, 3, 1893, p. 313. Anonyme, Joum. Boy. Mie. Soc. y 1888, 
p. 518. Squire, Methods and Formulas, etc., 1892, p. 35. 

115. Carmin au lithium (Ortii, Berliner klin. Wochenschy 28, 1883, 
p. 421). — Superflu. Macère du reste considérablement (Mayer). 

116. Carmin à l'ammoniaque. — Je regarde le carmin à l'ammoniaque 
dans toutes les modifications qui ont été proposées comme entièrement 
suranné, si ce n'est pour l'emploi unique de la coloration des coupes des 
centres nerveux (voir à la deuxième partie), ou bien de tissus macérés au 
point de ne plus tolérer, sans se ratatiner, des corps comme l'alun, l'alcool, 



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CARMIN ET COCHENILLE 87 

etc. (Mayer). Voyez au besoin Beale, Hoiv to toùrk, etc.. 4* éd., p. 109-304. 
Betz, Arch. f, mik, AnaL, IX, 4873, p. Ii2. Bôun (pas Bohm), Arch. Anal. 
K. Phys,^ Anat, Abth., 1882, p. 4. Frey, Le Microscope, p. 167. Gierke, 
Zeit. /*. wiss. Mik.y I, 1884, p. 76 (carmin pourri). Carmin acétique neutre 
de Hauann., Intern. Mon. /*. Anat. w. Ilist., I, 1884, p. 346 ; Zeit. f. wiss. 
Mik., Il, 1885, p. 87. Heidenhain, Arch. f. mik. Anat., VI, 1870, p. 402. 
HoYER, Biol. Centralb., II, 1882, p. 17. c Carmin neutre » de Ranvier. 
1™ édition de ce traité. 



c. Autres solutions aqueuses, acides ou alcalines. 

117. Carmin acide de Sch-weigger-Seidel, Traité de Ranvier, 
p. 99. Carmin-borax neutre, Woodward, Mon. Mie. Journ., VII, 1872, p. 38 ; 
Am. Quart. Mie. Joum., I, 1879, p. 220; Journ. Roy. Mie. Soc, II, p. 613; 
de Grenacher, Arch. f. mik Anat., XVI, 1879, p. 466 ; des modifications 
de cette formule par IIaug, Zeit. f. wiss. Mik.^ VII, 2, 1890, p. 151, et VIII, 
I, 1891, p. 52; de Gibbes, Journ. Boy. Mie. Soc, III, 1883, p. 390; de 
NiKiFOROW, Zeit. f. v)iss. Mik., V, 3, 1«88, p. 337. Carmin à Tacide osmique 
de Delage, Arch. de Zool. exp. et gén., IV. sér. 2, 1886. Carminroth de 
RoLLETT, Zei7. f. wiss. Mik., I, p. 91. Carmin soluble de Perls, Zeit. f. wiss. 
Mik., I, p. 91. Acide carminique, Dimmock, Amei\ Natural., XVIII, 1884, 
p. 324, Q\. Journ. Roy. Mie. Soc, 1884, p. 471. Carmin à Tacide borique, 
Arcangeli, Proc Verb. Soc. Tosc. Se Nat., 1885, p. 283 et Zeit. f. wiss. 
Mik., 1885, p. 377. Carmin à Tacide salicylique, Arcangeli, ibid. Carmin h 
Tacide picrique, Arcangeli, ibid. Minot, Methods in mie Anat. de Whitman, 
p. 42. Carmin à Turane de Gierke, Zeit. f. wiss. mik., I, 1884, p. 92; de 
ScHMAUS, ibid. VIII, 2, 189J, p. 230. Carmin au carbonate de soude, Cuccati, 
ibid., IV, I, 1887, p. 50. . 



TEINTURES ALCOOLIQUES 

118. Carmin au borax, alcoolique (Grenacher ; Arch. f. mik. 
Anat., XVI, 1879, p. 466 et suivante). — On fait une solution 
concentrée de carmin dans une solution de borax(carniin, 2à3p.i0i); 
borax, 4 p. 100) * ; on ajoute un volume égal d'alcool à 70 degrés ; 
on laisse reposer ', et Ton Oltre. On y laisse les préparations le 
temps nécessaire pour qu'elles soient pénétrées, et on les porte, sans 
lavage préalable, dans de l'alcool ^ contenant 4 à 6 gouttes d'acide 
chlorhydrique par 100 ce. On les laisse dans ce liquide jusqu'à ce 
qu'elles soient bien pénétrées*, puis on les lave à l'alcool pur. 

* Faire bouillir pendant une demi-heure ou plus (Mayer). 
■ Vingt-quatre heures (Mayer). 

' A 70 p. 100 ; cela est absolument nécessaire (Mayer). 

* Celte indication n'accorde pas assez de temps à la difTérenciation ; il faut 
parfois des jours entiers (Mayer). 



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88 CHAPITRE VII 

La proportion d'alcool contenue dans cette solution suffit pour la 
bonne conservation de tous les objets qui ne sont pas très délicats et 
qui ne demandent pas une immersion très prolongée pour être 
imbibés. Pour les objets qui demandent par exemple une immersion 
de plusieurs jours au lieu de quelques heures, il y a utilité à 
augmenter la dose d'alcool. Nous trouvons même, pour notre part, 
que les solutions plus alcooliques sont, dans la plupart des cas, pré- 
férables à la solution ordinaire; la conservation des cellules est 
souvent sensiblement meilleure, la solution étant en même temps 
plus neutre et moins aqueuse ; et nous croyons que la coloration est 
plus précise et plus facile à contrôler. On peut ajouter de Talcool 
visqu*à concurrence de 50 p. 100 ; en tout cas pas au delà de 60p. 100 
(Mayer). 

Pour la décoloration, nous nous servons d'une solution d'acide 
chlorhydrique encore plus étendue, que nous avons appris à con- 
naître dans le Laboratoire de Morphologie de l'Université de Genève ; 
à savoir, 33 gouttes d'acide par litre d'alcool. On- y laisse les objets 
jusqu'à ce qu'ils présentent une certaine transparence et un certain 
aspect brillant qui indiquent que les tissus sont suffisamment décolo- 
rés et la couleur fixée dans les noyaux. 

Ce carmin peut servir à colorer des objets qui ont été fixés dans le 
mélanjge de Flemming, à condition qu'ils aient été bien lavés. 

Il est certainement l'une des plus importantes de toutes les tein- 
tures histologiques. Tous les observateurs sont d'accord pour recon- 
naître à quel point il est d'iXn emploi commode. 

Les colorations sont parfaitement stables dans tous les milieux 
conservateurs *. 

119. Paracarmin (Mayer, Mitth. Zool.Stat. Neapel, X, 3, 1894, 
p. 491). — Acide carminique, 1 gr. ; chlorure d'aluminium, 0, 5 gr. ; 
chlorure de calcium, 4 gr. ; alcool, 70 p. 100 à 100 ce. Faire dissoudre 
au froid ou à l'aide delà chaleur, laisser déposer, et filtrer. Liquide 
d'un rouge clair, très propre aux colorations en masse ; c'est la tein- 
ture qui se rapproche le plus du carmin au borax alcoolique de 
Grenacher. 

Les tissus à colorer ne doivent pas avoir une réaction alcaline*. 
Après coloration, les coupes (ou les objets destinés à être débités en 
coupes) doivent être lavées à l'alcool pur à 70 p. 100. Les objets desli- 

1 Le seraient-elles dans la glycérine ? (Mayer.) 

s Ni contenir beaucoup de carbonate de chaux (spicules ou portions squelet* 
tiques calcaires des Coraux, etc.), qui donnerait lieu à des précipités. (Mayer.) 



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CARMIN ET COCHENILLE 89 

nés à être montés entiers peuvent être lavés dans une solution faible 
de chlorure d'aluminium dans Talcool ; ou, si cela ne suffit pas, avec 
de Tacide acétique (à 8 p, 100 si pn prend Tacide ordinaire, 2, 8 p. 100 
si Ton prend l'acide cristallisable) dans Talcool. 

Coloration nucléaire, rouge, mais d'un rouge moins éclatant que 
celui du carmin au borax. Cette teinture possède les points suivants 
de supériorité sur le carmin au borax. Elle n'est pas alcaline, ce qui 
fait qu'elle est plus inolîensive au point de vue de la conservation des 
tissus ; elle est plus fortement alcoolisée, ce qui fait qu'elle a plus de 
pénétration ; elle n'a pas cette tendance qu'a le carmin au borax de 
former des précipités granuleux à l'intérieur de certains objets et 
elle se conserve parfaitement sans précipiter. Il me semble pour ma 
part que c'est un réactif plus fin que le carmin borax, qui a certaine- 
ment ses qualités brillantes, mais qui est comparativement un peu 
brutal. 

120. Teintura de cochenille de Mayer, nouvelle formule (Mitth, 
ZooL Stat. Neapel, X, 3, 1892, p. 498). — Cochenille, 5 gr. ; chlorure de 
calcium, 5 gr. ; chlorure d'aluminium, 0,5 gr. ; acide nitrique (d'une densité 
de 1,20), 8 gouttes; alcool à 50 p. 100, 100 ce. On pulvérise finement la coche- 
nille et on la broyé intimement avec les sels en nature, on ajoute Talcool 
et Tacide, on chauffe à rébullition, on laisse refroidir, on laisse le tout 
pendant quelques jours en agitant fréquemment, et Ton filtre. 

Les objets doivent être saturés d*alcool à 50 p. 100 avant la coloration, 
et c'est dans de Talcool de ce titre qu'il faut les laver ensuite. 

Coloration assez semblable à celle du Paracarmin, mais ni aussi énergique 
ni aussi élective. Mayer propose cette teinture seulement comme succédané du 
Paracarmin. ' 

Ce liquide est contre-indiqué pour des tissus contenant des éléments cal- 
caires. 

121. Teinture de cochenille de Mayer, ancienne formule. (Paul 
Mayer, Mitth. Zool. Stat. Neapel, II, 1881, p. 14.) — On fait macérer de la 
cochenille en poudre pendant plusieurs jours dans de Talcool à 70 degrés. 
Il faut prendre environ 8 à 10 ce. d'alcool pour chaque gramme de coche- 
nille, remuer fréquemment, puis filtrer. 

Les objets à colorer doivent être imbibés d'alcool du même titre que 
celui qui a servi à faire la solution ; et il faut avoir soin d'employer tou- 
jours de l'alcool de ce titre pour le lavage des objets ou pour diluer la 
solution elle-même. 

Il est très important de bien débarrasser les objets d'acide avant de les 
colorer. Si l'on néglige cette précaution, on n'obtient que des colorations 
diffuses. Les objets préparés à l'acide osmiqne ne se colorent que faiblement, 
à moins qu'on ne les ait préalablement blanchis. Les objets préparés à 
l'acide chromique se colorent bien, encore mieux ceux qui ont été fixés 
par un liquide picrique ou par l'alcool absolu. 

Les colorations excessives ont très rarement lieu. On peut les corriger 



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90 CHAPITRE VII 

par de Talcool acidulé avec 1 p. 100 d'acide acétique ou 1 p. 100 d'acide 
chlorhydrique. 

Nous avons indiqué plus haut (n<> 101) les raisons pour lesquelles cette 
teinture ne fournit des colorations parfaitement réussies qu'avec certains 
objets. Pour ces motifs Mayer lui-même parait disposé à l'abandonner 
entièrement en faveur de la nouvelle formule. Je l'ai conservée ici parce 
qu'il me semble toujours que c'est un réactif qu'il est bon de connaître. 
Pour celui qui étudie l'histologie des Arthropodes, j'estime que c'est un 
réactif indispensable. La nouvelle formule donne un liquide, qui pour bien 
des objets est insuffisamment alcoolique. Ajoutons que l'ancienne teinture 
est à réaction neutre et peut être employée avec des objets calcaires. Quoi 
de meilleur, par exemple, pour préparer un Pluteus ? 

122. Carmin à Tacide chlorhydrique, alcoolique. — Ce carmin 
est assez important. Seul il permet d'obtenir une coloration à la fois éner- 
gique et rapide, par le moyen de solutions faites avec de Valcool très fort, 
jusqu'à l'alcool absolu. Gela est précieux pour la coloration en masse d'ob- 
jets très difficilement pénétrables (pièces protégées par la chitine). Ces 
solutions ont sur le carmin au borax l'avantage de contenir incomparable- 
ment plus de carmin dans l'alcool fort. On les emploie comme le carmin 
au borax, en opérant la décoloration avec le même alcool acidulé ' d'acide 
chlorhydrique. Cependant, avec une solution heureusement combinée, on 
peut obtenir de prime abord des colorations électives qui n'ont pas besoin 
de décoloration. Les colorations sont permanentes dans tous les milieux 
conservateurs. 

a. Formule de Grenaciier (Arch. f. mik. Anat,, XVI, 1879, p. 468). — 
Demande le plus souvent des opérations ennuyeuses de neutralisation. 

b. Formule de Paul Mayer (Garbini, Manuale per la Technica modema 
del microscopio, p. 46). — Mayer prend 100 grammes d'alcool absolu (ou 
d'un titre plus faible), il ajoute 1 ou 2 gouttes d'acide chlorhydrique, et du 
carmin à saturation. Il faut faire bouillir jusqu'à ce que l'on obtienne une 
solution claire. 

D'après notre expérience, celle-ci est la manière la plus sûre de préparer 
le carmin à l'acide chlorhydrique. Il est à remarquer qu'il doit toujours 
rester un excès de carmin dans la solution. Bien préparé, ce carmin doit 
donner une coloration parfaitement nucléaire, sans décoloration par l'HCl. 

c. Ancienne formule de P. Mayer {Mitth. ZooL Stat. Neapd, IV, 1883, 
p. 521). 

d. Formule plus récente de P. Mayer (Intern. Monalschr. f, Anat. w. 
Phys,^ IV, 1887, p. 43). -— Carmin, 4 grammes ; eau, 15 ce. ; acide chlorhy- 
drique, 30 gouttes. Faire bouillir jusqu'à dissolution du carmin, ajouter 
95 ce. d'alcool à 85 p. 100, et neutraliser en ajoutant de l'ammoniaque jus- 
qu'à ce que le carmin commence à se déposer. 

Celte solution donne toujours des colorations diffuses; pour les rendre 
électives, il faut décolorer par l'IICl. 

e. Formule de Brass (ZexL f, wiss. Mik., II, 1885, p. 303. 

Il convient d'observer que si l'on désire diluer l'une ou l'autre de ces 
solutions, il ne faut pas employer à cet effet de l'eau, mais de l'alcool du 
même titre que celui qui a servi à faire la solution. 



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CARMIN ET COCHENILLE 



91 



123. Antres carmins alcooliqnes. — Nous ne citons que pour mé- 
moire les solutions suivantes, qui sont toutes mauvaises ou superflues. Car- 
mixl lilas au borax (TmERscu,Arch. /*. mik. Anat., 1, 1865, p. 150). Car- 
min picroboraté (Dutilleul, Bull, scient, dép. Nordy XVI, 1885, p. 371). 
Carmin sulfurique, alcoolique (Hoyer; Arch. f. mik. Anal., XIII, 
1876, p. 650). Carmin à Tacide borique, alcoolique (Francotte; 
Bull. Soc. Belge micr., 1886, p. 48). 



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CHAPITRE VIII 

HÉMATOXYLINE (HÉMATÉINE) 
ET AUTRES COLORANTS VÉGÉTAUX 



124. Théorie des teintures à rhématéine ou à l'hématoxy- 
line. — Il paraît maintenant parfaitement établi (Nietzki, Chemie 
der organischen Farbsloffe, 1889, p. 215) que le principe colorant 
des teintures d'hématoxyline n'est pas autre chose que Vhématéine. 
De plus, il faut également admettre que Thématéine des solutions 
histologiques usuelles est un produit de Toxydation (par le moyen de 
Tair) de leur hématoxyline originelle (Mayer, Ueber das Fàrhen mit 
Haetnatoxlin, dans Mitth, Zool. Stat. Neapel, X, i, 1891 , p. 170-186; 
puis Unna, Ueber die Reifung unserer Farbstolfe, dans Zeit. f. wiss. 
Mik., VIII, IV, 1892, p. 483). Le changement produit dans les solu- 
tions par cette oxydation a été connu des histologistes depuis long- 
temps sous le nom de c maturation » des solutions; on se rendait 
bien compte que, jusqu'à ce qu'il se fût produit, les solutions n'étaient 
pas en état de fournir des colorations ayant les qualités désirées. 

Pour réaliser la c maturation » voulue, les histologistes se fiaient 
jadis (d'après une tradition tout empirique et indépendante de toute 
théorique chimique) à l'absorption spontanée de l'oxygène de l'air 
par les solutions d'hématoxyline. Nous devons à Mayer et à Unna la 
découverte importante qu'il n'y a rien de plus facile que de réaliser 
cette réaction d'une manière artificielle. Il suffit, par exemple, 
d'ajouter à une solution alunique d'hématoxyline une faible quantité 
de solution neutralisée de peroxyde d'hydrogène. La solution héma- 
toxylique c mûrit > instantanément, virant à un bleu foncé, et se 
trouve dès l'instant dans l'état de maturité voulue pour les colorations. 

Il faut donc admettre que ï hénialéine est toujours l'élément essen- 
tiel par excellence de nos solutions. Faut-il également admettre que 



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uématoxylim: et autres colorants végétaux 93 

cet élément seul sufQrait ? Les recherches de Mayer {loc. cit.) ont 
démontré qu'il ne sufGrait pas. Une solution d'hématéine pure et 
libre ne fournirait pas une coloration élective semblable à nos colo- 
rations histologiques ; elle ne saurait fournir au plus qu'une teinture 
plate et confuse de tous les éléments, teinture faible et sans relief et 
par conséquent pas du tout bonne. Si nous faisons abstraction pour 
le moment de certains procédés de coloration au moyen des laques 
chromiques ou ferriques d'hématoxyline (Weigert, Heidenuain), nous 
trouvons que les teintures histologiques usuelles se font toutes au 
moyen de solutions contenant de Valun. Mayer a conclu que le prin- 
cipe actif de ces solutions est un composé d'hématéine et d'alumine, 
un véritable sel. 

Il suppose que ce sel se laisse précipiter au sein des tissus (surtout 
dans les noyaux), par certains sels organiques et inorganiques des 
tissus (des phosphates, par exemple) ; peut-être aussi par d'autres 
corps organiques appartenant au?c tissus. Nous savons que ces sels 
existent dans les tissus vivants. Par nos procédés de « fixation » 
histologique, ils y sont fixés, soit dans leur état chimique originel, 
comme cela doit arriver lors de la fixation par un agent neutre comme 
l'alcool ; ou bien sous forme de nouveaux composés formés par la 
combinaison de ces sels avec l'agent fixateur lui-même, comme ce 
serait le cas, par exemple, pour le sublimé. 

Il y a donc dans ces solutions à côté de l'hématéine un autre fac- 
teur essentiel, Valumine , à laquelle peuvent s'ajouter certains autres 
corps qui peuvent jouer un rôle secondaire dans la coloration, comme 
par exemple le chlorure de calcium dans la solution de Kleinenberg. 
En un mot, il y a, comme nous l'avons fait remarquer au numéro 100, 
un parallélisme étroit entre les teintures à l'hématéine et les teintures 
au carmin. Ces principes étant admis, il suit que la première préoccu- 
pation de l'histologiste qui travaille avec des teintures à base d'héma- 
toxyline doit être de réaliser la conversion de l'hématoxyline de ses 
solutions en hématéine, afin d'obtenir la formation de la laque alumi- 
niquc d'hématéine désirée. S'il se contente de laisser l'oxydation se 
faire par le procédé anciennement usité de c maturation > des solu- 
tions par l'action de l'air, il surgit des inconvénients. En premier lieu, 
la maturation spontanée est fort longue ; elle exige des semaines, sou- 
vent même des mois. Ensuite, le processus d'oxydation ainsi mis en 
jeu ne s'arrête pas au moment voulu, c'est-à-dire aussitôt que l'héma- 
toxyline a été convertie en hématéine. Il continue, et l'hématéine 
iormée subit à son tour une oxydation ultérieure qui la convertit en 
des composés incolores ; la solution devient trop muret et commence 



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94 CHAPITRE VIII 

à précipiter. Une telle solution est donc en réalité un mélange, dans 
des proportions toujours changeantes, d'éléments pas mûrs, d'élé- 
ments mûrs et d'éléments trop mûrs. Les premiers et les derniers de 
ces éléments sont sans effet pour la teinture ; et en conséquence la 
puissance colorante de la solution est très inconstante. 

Cet inconvénient ne se laisse éliminer que très imparfaitement 
par les anciennes méthodes^ Maintenant, grâce aux importantes 
recherches de Mayer et d'UNNA, un grand progrès a été réalisé. 

Le point essentiel des résultats de Mayer, c'est qu'il faut prendre 
pour base des solutions colorantes, non Thématoxyline mais l'héma- 
téine. Nous sommes ainsi soulagés du coup de l'obligation de la 
maturation ennuyeuse et aléatoire des solutions par l'air,. d'après la 
vieille méthode. Nous avons d'emblée une solution mûre. Et pour 
empêcher la surmaturation spontanée de cette solution, nous avons 
une méthode très simple d'UNNA, dont il sera question tout à l'heure. 

125. De rhématéine (Mayer, loc. cit.). — L'hématéine en subs- 
tance est une masse d'un vert foncé, rouge à la lumière transmise, 
qui se résout si on la bi*oye en une poudre brune. Elle se dissout 
entièrement, quoique non sans peine, dans Teau distillée et dans 
l'alcool, en donnant une solution d'un brun jaunâtre qui ne se trouble 
pas par l'addition d'acide acétique. Avec les alcalis elle donne des 
solutions d'un violet bleu. 

L'hématéine se trouve aujourd'hui dans le commerce ; mais Mayer 
n'a pu se la procurer pure que chez Geigy and G^, à Bâle. Heureuse- 
ment il se trouve aussi dans le commerce un composé ammoniacal 
d'hématéine, c'est YMaernatein-Ammoniak, ou hémaiéate iTainmo- 
niaque connu aussi sous le nom de haemateinum crystallisatum. On 
trouve ce produit, d'une pureté sufOsante, chez E. Merck, à Darms- 
tadt. Ce composé est plus facilement soluble dans l'eau et dans l'al- 
cool que ne l'est l'hématéine, et sert tout aussi bien pour les tein- 
tures. On peut du reste très facilement se le préparer soi-même, ce 
qui se fait de la manière suivante. 

126. Hématéate d'ammoniaque (Mayer, ibid.). — On fait 
dissoudre à l'aide de la chaleur 1 gramme d'hématoxyline dans 
20 ce. d'eau distillée et l'on filtre s'il y a lieu. On ajoute 1 ce. d'am- 
moniaque caustique (d'une densité de 08'^,875) et l'on porte le liquide 
pourpre qu'on a ainsi obtenu dans une capsule de telles dimensions 
que le fond n'en soit pas couvert à plus d'un demi-centimètre de pro* 
fondeur. On laisse évaporer à la température de l'air et à l'abri de la 



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HÉMATOXYLINE ET AUTRES COLORANTS VÉGÉTAUX 95 

poussière. On doit recueillir en hématéate d'ammoniaque une quan- 
tité approximativement égale à celle de l'hématoxyline employée. Il 
ne faut pas activer Tévaporation par la chaleur, car cela pourrait 
provoquer la formation de composés insolubles dans Talcool. Le 
produit ne doit pas être touché par des instruments d'une substance 
autre que le verre, la porcelaine ou le platine, jusqu'à ce qu'il soit 
devenu parfaitement sec. 

Nous donnons plus loin les formules de Mayer pour la préparation 
de teintures au moyen d'hématéine ou d*hématéate d'ammoniaque ; 
mais avant de le faire, nous décrirons la méthode d'UNNA pour la con- 
servation de solutions d'hématéine. (Sa méthode d*oxydation par le 
peroxyde d'hydrogène n'est rien moins que pratique, et nous la sup- 
primons.) 

127. Solution mi-mûre et constante d'Unna {Zeit. f. wiss. Mik,, 
VIII, 4, 1892, p. 483). — Unna a cherché le moyen d'arrêter au point voulu ce 
processus d'oxydation continue et spontanée qui, comme nous l'avons dit, 
conduit rapidement à un étal de maturité excessive. Et il a trouvé le moyen 
de l'arrêter à une étape quelconque, de manière à produire une solution 
mi-mûre constante. On arrive à ce résultat par le simple moyen d'addition- 
ner la solution d'un agent réducteur» Unna recommande la formule sui- 
vante : 

Uématoiyline 1 

Alun 10 

Alcool 100 

Eau 200 

Soufre sublimé 2 

' En ajoutant le soufre à la solution hématoxylique au moment où celle-ci 
est devenue assez fortement bleuie, par exemple, après avoir attendu deux 
ou trois jours, on fixe le degré d*oxydation que la solution a atteint à ce 
moment. On peut alors employer la solution telle quelle pour la teinture. 
Elle ne donnera pas en cet état une coloration aussi énergique et aussi 
précise qu'une solution rendue totalement mûre par le peroxyde d'hydro- 
gène; mais on aura l'avantage d'avoir une coloration qui ne demandera pas 
de décoloration subséquente par des acides. 

Je pense qu'il est bon de connaître ce procédé, qui peut avoir son utilité 
dans certafns cas qui peuvent se présenter. Mais je pense qu'il ne saurait 
prétendre à être mis sur le même rang que les méthodes de Mayer. 

128. Caractères des teintures à l'hématéine (soit hémato- 
zyline). — Les solutions aluminiques d'hématéine (soit hématoxyline, 
nous avons suftisamment expliqué que les soi-disant teintures à Thé- 
matoxyline sont en réalité des teintures à l'hématéine) colorent en 
divers tons de bleu ou de violet rougeâtre selon la réaction de la solu* 
tion employée. Les solutions neutres ou alcalines colorent en bleu pur ; 



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96 CHAPITRE VllI 

les solutions acides donnent un ton rougeâlre. Pour faire virer au 
bleu le ton rouge produit par les solutions acides, c*est une pratique 
assez générale de traiter les préparations par de Tammoniaque très 
diluée. Cette pratique repose sur la croyance que le virage au bleu 
serait TelTet de la neutralisation par Tammoniaque de Tacide qui 
aurait été la cause du ton rouge. Il est des motifs pour croire que 
cette croyance est erronée. Squire [Methods and Formulae^ etc., 4892, 
p. 22) a démontré que des tissus colorés par la solution acide 
d'Ehrlich peuvent être bleuis par Teau distillée parfaitement pure et 
ne contenant pas même une trace d'ammoniaque. Squire admet cepen- 
dant que le virage est activé par la présence dans l'eau d'une trace 
d'un alcali; ce qui explique la pratique, également très répandue, 
qui consiste à bleuir les préparations en les lavant pendant un temps 
suffisant (qui peut être jusqu'à plusieurs heures) dans de l'eau de 
source, qui est généralement chargée d'une quantité suffisante de car- 
bonate de chaux ou autres corps basiques. Mayer donne une autre 
explication de la réaction. L'ammoniaque n'agirait pas en neutrali- 
sant l'acide, mais en précipitant l'alumine combinée à i'hématéine. 
S'il n'y avait pas d'alumine enjeu, l'ammoniaque produirait un virage 
au violet, non au bleu. 

En tout cas, ce qu'il importe de retenir, c'est qu'on peut le plus 
souvent arriver au but par la simple eau de source, et qu'on y arrive 
avec une entière certitude par une solution de bicarbonate de soude, 
ou d'acétate de soude ou de potasse. C'est ce dernier qui est le plus 
inoffensif (Mayer). (Le virage de coupes peut être obtenu en quelques 
minutes en les traitant par une solution à 1 p. dOOO de bicarbonate 
de soude dans l'eau distillée (Squire, L c). (Voyez aussi Hœmacal- 
ciurriy n^ 139.) Et c'est bien là la marche à préférer, car l'ammo- 
niaque n'est certes pas un réactif inoffensif pour les éléments histo- 
logiques délicats. Naturellement toute cette question de virage est 
à distinguer de celle de la nécessité qu'il peut y avoir de neutraliser 
par un alcali des tissus qui ont été traités par un acide pour corriger 
une sur-coloration. Dans ce cas la neutralisation peut être indiquée 
dans l'intérêt de la permanence de la coloration. 

D'après Watney (PhiL Trans., 1882, p. 1075; Krause, Intern. Zeit. f, 
Anat. u, Hist.^ I, p. 154), nous citons d'après Max Flesch, Zeit, f. wiss. 
Mik.^ 1885, p. 353), on obtient un bleu ialense si l'oa emploie des teintures 
faites avec de l'alun fraîchement préparé; tandis qu'on obtient un ton rouge 
si l'on emploie de l'alun vieux dans lequel il s'est développé de l'acide 
libre, comme cela arrive presque toujours pour l'alun longtemps conservé. 
On obtient cette réaction surtout avec les solutions dans lesquelles la pro- 
portion d'alun est moindre que le tiers de l'extrait de bois de Gampéche 



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HÉMATOXYLINE ET AUTRES COLORANTS VÉGÉTAUX 97 

employé. Les solutions rouges colorent le tissu conjonctif et le protoplasma 
de ses cellules, de même que les granules des cellules à granulations 
(« Plasmazellen ») ; tandis que les solutions bleues présentent une affinité 
spéciale pour la mucineet pour presque toutes les sortes de noyaux. 

Or, Langhans (d'après Max Flesch, loc. cit.) a découvert qu'on peut 
obtenir ces deux réactions électives avec une seule solution. Il sufOt pour 
cela de colorer par Thématoxyline de Delafield et après avoir monté les 
préparations au baume, de les exposer pendant un temps prolongé à la 
lumière. (Les préparations à la glycérine ne fournissent pas cette réaction.) 

Aucune des anciennes solutions préparées avec Vhématoxyline 
n'est parfaitement stable (ni du reste le Hémalun non plus) comme 
nous Tavons suffisamment expliqué plus haut; tout au plus en trou- 
verait-on une ou deux qui soient un peu tolérables à cet égard (celle 
d'Ehrlich cependant se maintient très bien) (Mayer). 

Les teintures hématoxyliques à laque alunique passent pour être 
des colorants nucléaires. Elles le sont en ce sens qu'elles ont une 
affinité énergique pour la chromatine des noyaux. Mais elles ont 
aussi des affinités très marquées pour bien des éléments de la cellule 
en dehors du noyau. Elles ne fourniront donc des élections pures de 
la chromatine que moyennant les précautions voulues, teinture pas 
trop prolongée, ou bien lente, mais faite dans des solutions très 
diluées. Avec la plupart de ces solutions les colorations excessives 
s'établissent avec la plus grande facilité. On les corrige par des lavages 
prolongés dans de la solution d'alun (d'une concentration de 0,8 à 
1 p. 100 par exemple), mais cela demande le plus souvent beaucoup 
de patience. On arrive plus vite au but en employant un acide quel- 
conque, par exemple, l'acide chlorhydrique (de 0,1 à 0,2 ou même 
0,5 p. 100). Après ces lavages, pour assurer la permanence de la tein- 
ture, il faut neutraliser les tissus avec un alcali (voyez plus haut ce 
qui a été dit à propos du bleuissage de la coloration). 

Le bicarbonate de soude à 0,1 p. 100 sert bien pour ces neutralisa- 
tions. Si l'on désire employer ce sel en solution alcoolique, on peut 
procéder comme l'indique von Wistinguausen (Mitth, Stat. ZooL 
Neapel, X, 1891, p. 41 ; Zeit.f. wiss. Mik., X, 4,1893, p. 480). On fait 
dissoudre du bicarbonate de soude à l'aide de la chaleur dans de 
l'alcool à 70 p. 100 (il s'en dissout très peu), et l'on filtre après refroi- 
dissement. Pour les lavages, on ajoute 3 à S gouttes de la solution à 
un verre de montre d'alcool à 70 p. 100. 

Il faut user de précautions sérieuses pour assurer la permanence 
de la coloration. Si l'on a employé des acides, il faut les enlever com- 
plètement ou les neutraliser avec le plus grand soin. La plupart des 
teintures donnent des colorations qui se conservent mieux dans le 

ANAT. mCROSC. 7 



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CHAPITRE VIII 



baume que dans les milieux aqueux. Mayer trouve que ses prépara- 
tions à l'hématéine se sont bien conservées tant dans des milieux 
aqueux que dans le baume (voyez plus loin). 

Les nouvelles teintures à base dhématéine sont en grande partie 
exemptes des inconvénients que nous venons d'énumérer. 

129. Emploi. — Ces teintures servent à des besognes très variées, 
il en est une pour laquelle elles sont à peu près indispensables, c'est 
la coloration en masse d'objets qui ont été fortement fixés dans des 
liquides chromiques ou osmiques. Pour ces cas, l'hématéine peut 
réussir là où tout autre colorant échouerait. Elle rend aussi de grands 
services pour certaines recherches spéciales, telles que l'étude du Ne- 
benkern et de la figure achromatique de la division mitosique, agissant 
en ces cas comme colorant plasmatique. Elle fournit aussi des colora- 
tions spécifiques et très importantes d'éléments nerveux (voir à la 
Deuxième Partie). Bien des histologistes s*en servent à titre de colorant 
normal pour leurs coupes. On peut admettre que depuis que les tra- 
vaux de Mayer et d'autres nous ont mis à même de régler d'une manière 
scientifiquQ l'emploi de l'hématéine, cette pratique est justifiable. 

Pour les coupes je recommande beaucoup, outre l'Hémalun de 
Mayer le procédé à la laque d'alun de fer de M. Heidenhain, qui m'a 
donné des résultats superbes et est en somme assez facile à exécuter. 

Pour les colorations eu masse, l'Hémalun ou THémacalcium de 
Mayer. 

Quant aux anciennes méthodes, je n'hésite pas à dire que, eu 
égard aux grands avantages offerts par les procédés de Mayer, les 
anciennes méthodes doivent être abandonnées, et seules les formules 
de Mayer, ou du moins des formules qui se conforment aux prin- 
cipes établis par ce savant, doivent être employées par les travail- 
leurs sérieux. (Ceci s'entend seulement des procédés usuels de colo- 
ration par les laques aluminiques, et non des procédés spéciaux par 
les laques chromiques, etc.) 

A. — Laques aluminiques 

a. Solutions aqueuses. 

130. Hémalun (Mayer, Mitth. ZooL Stat. Neapel, X, i, 1891, 
p. ITâ). — On fait dissoudre 1 gramme d'hématéine. ou d'hématéate 
d'ammoniaque (no 125) à l'aide de la chaleur dans 50 ce. d!alcool à 90 
p. 100 et on l'ajoute à une solution de 50 grammes d'alun dans un litre 



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HÉMATOXYLINE ET AUTRES COLORANTS VÉGÉTAUX 99 

d'eau distillée. On laisse refroidir et déposer, on filtre s'il y a lieu, et 
Ton ajoute un cristal de thymol. On obtient un liquide foncé d'un ton 
violet rougeâtre. Le ton exact dépendra beaucoup de la qualité de l'alun 
(Mayer). Celte teinture correspond à l'hématoxyline de Bôumer*. Elle 
colore largement aussi bien, et cela soit immédiatement, soit plus 
tard, car elle est naturellement mûre dès le premier moment. On peut 
s'en servir, soit concentrée, soit diluée. A l'état concentré, elle colore 
presque instantanément (des coupes ont été colorées en les inondant 
une seule fois du liquide). Allongée de vingt volumes d'eau distillée, 
elle colorera des tentacules de Tubularia à travers toute leur épais- 
seur en une heure (pour allonger les solutions, il faut avoir soin de 
n'employer que l'eau distillée ou plutôt une solution faible d'alun 
dans l'eau distillée). Les lavages peuvent se faire soit à leau distillée, 
soit à l'eau de source. ' 

Cette teinture est admirable pour les coloVaiions d'objets entiers. 
Des objets volumineux demanderont cependant un bain de vingt- 
quatre heures et un lavage de même durée (au mieux dans de la solu- 
tion d'alun au centième, si l'on désire une coloration nucléaire très 
précise). 

Les préparations se conservent bien dans la glycérine, pourvu que 
celle-ci ne soit pas acide, et aussi dans le baume. Il faut observer que 
si l'on a employé l'essence de. bergamote pour l'éclaircissement, il 
faut l'enlever soigneusement par de l'essence de térébenthine avant 
de passer au baume ; et que remploi de l'essence de giroQes n'est pas 
sans danger. Il vaut mieux (Mayer, in litt.) n'employer que le xylol, 
le benzol et le chloroforme, et monter dans le baume au xylol ou au 
chloroforme. La solution d'hémalun peut être additionnée de carmin 
à l'alun, de fuchsine-acide, etc., afin de produire des colorations 
doubles; mais pour ce but il semble préférable d'employer les deux 
teintures successivement. 

131. Hémalun acide (Mayer, loc. cit., p. 174, note). — C'est de 
rhémalun additionné de 2 p. 100 d'acide acétique cristallisable (ou 
de 4 p. 100 d'acide acétique ordinaire). Emploi comme pour* Thé- 
malun simple, lavage à l'eau de source pour bleuir la coloration. 
Celte solution donne une coloration nucléaire peut-être encore plus 
précise qtie Thémalun simple. Elle a aussi l'avantage de ne pas donner 

* Comme pour la formule de Bôhmer, il n^est pas nécessaire de se conformer 
exactement aux proportions indiquées. On peut toujours improviser une solution 
d'hémalun en ajoutant quelques gouttes de solution alcoolique d'hématéine à une 
solution d*alun de la. concentration qu'on voudra. 



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100 



CHAPITRE YIII 



de précipités par suite d'une décomposition partielle provoquée par 
Tammoniaque de l'air et Talcali du verre des flacons, phénomène qui 
se manifeste bien à un certain degré pour l'hémalun simple, cependant 
pas au point de nuire à sa puissance tinctoriale. 

131 bis. Solution mûre deHsLiiaeniZooLAnz.^ 1895, p. 158). — Après 
avoir essayé plusieurs moyens d'oxydation, Hansen s'est arrêté au pe^'inan- 
ganale de potasse. On fait dissoudre 1 gr. d'hématoxyiine cristallisée dans 
10 gr. d'alcool absolu. 

Ou fait dissoudre à Taide de la chaleur 20 gr. d*alun de potasse dans 
200 gr. d'eau distillée et l'on filtre après refroidissement. Le lendemain on 
mêle les deux solutions. 

On met dans une capsule de porcelaine 3 ce. de solution aqueuse concen- 
trée de permanganate de potasse (à 15° G. il se dissout une partie de per- 
manganate pour 16 d'eau). On ajoute la solution d'hématoxyiine, et tout 
en remuant continuellement on chauffe graduellement jusqu'à ébulUtion. 
Le liquide devient violet-rouge foncé. On laisse bouillir pendant une demi- 
minute à une minute. Alors on refroidit le mélange, au mieux rapidement, 
en faisant flotter la capsule sur de l'eau froide. On filtre après refroidisse- 
ment, mais en général la filtration n'est guère nécessaire. La solution est 
maintenant mûre et prête à servir. 

Le motif pour lequel Hansen a été conduit à élaborer ce procédé de pré- 
paration, c'est qu'il avait fait l'expérience que l'hématéine du commerce 
n'est pas d'une qualité constante et ne fournit pas toujours des solutions 
identiques sous le rapport de la coloration des tissus. Hansen trouve que 
son procédé fournit un produit plus égal. Et il parait trouver son procédé 
plus simple et plus rapide que celui de Mayer pour la préparation d'hé- 
matéate d'ammoniaque. 

Une solution fraîchement préparée m'a donné des résultats de toute 
beauté. La marche de la coloration est semblable à celle de Thémalun, et 
les résultats sont à tel point identiques qu'il serait fort difficile sinon 
impossible de reconnaître les coupes colorées par les deux méthodes, si elles 
venaient à perdre leurs étiquettes. 

Hansen dit que sa solution se conserve mieux que les autres. Celle que 
j'ai préparée a formé en peu de jours une pellicule qui a rendu nécessaire 
une filtration ; et peu de jours après le phénomène s'est renouvelé. Et 
Mayer {in liU.) a trouvé après peu de jours un fort précipité. La précipita- 
tion dans mon flacon continue ; et je pense qu'en vue de ce grave inconvé- 
nient la solution de Hansen ne peut pas prétendre à remplacer celle de 
Mayer. 

132. Solution ammoniacale (Ammoniated Hematoxyline de Squire, 
Sqitire, Melhods and Formula*, etc., 1892, p. 24). 

Je l'ai essayée. Elle me fait fefTet de ne pas être d'une maturité constante, 
et je ne puis pas la recommander au même titre que l'hémaiun de Mayer, 
dont la coloration me parait d'ailleurs sensiblement plus délicate. 

133. Hematoxyline de Bœhmer (Arch. f. mik. AnaL, IV, 1868, p. 345 ; 
— parait avoir été publiée en premier lieu, avec des proportions un peu 



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HÉMATOXYLINE ET AUTRES COLORANTS VÉGÉTAUX lOi 

différentes, dans le AerzUiches IntelligenzbL^ Baiera, 1865, n^ 38). ~ On 
fait une solution de : 

Hématoxyline cristallisée 1 partie. 

Alcool absolu 12 — 

Et une seconde solution de : 

Alun puriné 1 partie. 

Eau distillée 240 — 

On ajoute deux ou trois gouttes de la première à un verre de montre 
plein de la seconde. 

Pour avoir de bonnes colorations il faut laisser mûrir longtemps (selon 
Mayer, deux mois). 

On peut conserver en réserve une provision de la solution alcoolique 
d'hématoxyline. Elle devient brune, mais ne perd pas ses qualités pendant 
des années. 

Nous pensons que quiconque a réfléchi aux principes exposés dans les 
premiers paragraphes de ce chapitre ne se servira plus de cette formule 
ancienne que comme dernière ressource dans des moments où il n*aurait 
pas sous la main une teinture se conformant mieux à ces principes 

134. Hématoxyline à ralun; Ranvier {Comptes rendus Acad. 5c., 
1882, 2° Sem., t. XCV, p. 1375, — et Contejean {Bull. Soc. Philomath. Paris, 
8, 3, 1891, p. 117). 

135. Hématoxyline de Delafield. — Cette formule a une histoire 
curieuse. Employée depuis longtemps dans l'Institut pathologique de Hei- 
delberg, elle fut communiquée par Pfîtzner à Flemming, qui, en la recom- 
mandant d'une façon particulière dans son Zellsubstanz Kern u, Zelltheilung, 
la fit connaître et apprécier. Flemming Tattribua d'abord h Grenacher. 
Plus tard, ajant appris que cette attribution était erronée, il crut devoir 
l'attribuer à Prudden ; et ce n'est que récemment {Zeit. /*. wiss, Mikroskopie, 
II, 1885, p. 288) que nous avons appris par Prudden que la formule est due 
à Delafield. Nous la donnons d'après Prudden, loc, cit. A 400 ce. d'une solu- 
tion saturée d'alun d'ammoniaque dans l'eau (il se dissout environ i partie 
dans 11 d'eau), on ajoute 4 grammes d'hématoxyline cristallisée dissoute 
dans 25 ce. d'alcool fort. On laisse le tout exposé à l'air et à la lumière 
pendant trois ou quatre jours, on filtre et on ajoute 100 ce. de glycérine et 
100 ce. d'alcool méthylique (esprit-de-bois, CIl^O). On laisse reposer jusqu'à 
ce que la solution ait acquis une couleur suffisamment foncée (on fera bien 
de laisser mûrir très longtemps, six semaines à deux mois), on filtre, et 
l'on conserve la solution dans un flacon bien bouché. Au moment de s'en 
servir, on doit l'étendre d'une quantité considérable d'eau. 

On peut, et avec avantage, se servir d'hémaléine pour fabriquer cette 
teinture (Mann, Zeit. f. wiss. Mik., XI, 4, 1895, p. 487). 

Cette solution est une teinture très énergique. Elle colore en général des 
éléments extra-nucléaires en même temps que la chromatine des noyaux. 
En effet, c'est à titre de colorant plasmatique qu'elle fut préconisée par 
Flemming (/. c). Je l'ai employée comme colorant plasmatique pour des 
coupes, avec de bons résultats. Mais je pense que pour cette fin elle a fait 



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102 CHAPITRE VIII 

son temps. Bien d'autres teintures seraient à lui être préférées à cet 
égard (hématoxyline à Talun de fer de M. Heidenhain,- Kernschwarz, safra- 
nine et Lichtgrûn de Benda, et d'autres encore). Elle pourra peut-être encore 
être utile pour la coloration en masse de tissus très réfractaires à la colora- 
tion. 

BuTSCHLi {Unters. ueb, mikroskopische Schàume, etc., 1892 ; Zext.f. wiss. 
Mik.f IX, 2, 1892, p. 197) a recommandé d'allonger la solution fortement 
d'eau et d'y ajouter, assez d'acide acétique pour donner un ton franchement 
rouge. 

136. Hématoxyline acide d'EHRLiCH (Zeit, f\ wiss Mik., 1886, 
p. 150) : 

Eau 100 ce. 

Alcool jabsolu 100 — 

Glycérine . . . 100 — 

Acide acétique crislallisable 10 — 

Hématoxyline 2 gr. 

Alun en excès. 

On laisse ce mélange exposé pendant longtemps à la lumière, 
jusqu'à ce qu'il ait pris une teinte rouge saturée. A partir de ce 
moment, la solution est devenue stable ; sa puissance de coloration 
ne varie pas, même pendant des années ; et il ne s'y forme pas de 
précipités, du moins si l'on a soin de conserver la solution dans un 
ilacon bien bouché. Pour obtenir des colorations doubles, on peut y 
ajouter des matières colorantes sous forme d'acides libres (par exemple 
de l'éosine) ou de bases colorantes. 

Des coupes de matériaux durcis soit par l'alcool, soit par le bichro- 
mate se colorent en quelques minutes, et donnent une coloration 
nucléaire sans aucune surcoloration, laquelle n'a même pas lieu 
après une immersion prolongée. Pour cette raison, cette teinture est 
très propre à la coloration de pièces en masse. 

Pour avoir la coloration bleue, il faut laver à l'eau de source. 

Il me semble que de toutes les anciennes formules que j'ai essayées, 
c'est celle-ci qui m'a donné les colorations nucléaires les plus précises 
et les plus faciles à réaliser. 

On peut avec avantage se servir d'hématéine pour faire la teinture 
(Mann, Zeit. f. wiss. Mih, XI, 4, 1895, p. 487.) 

137. Glycérine hématoxyline de Renaut {Arch. de Physiol.y 4881^- 
p. 640). 

138. Autres solutions aluniques aqueuses. Arnold, Quart. 
Journ. Mie. Sci., 1878, p. 86. Mitcuell, Journ. Roy. Mie. Soc., -1884, p. 311 - 
(méthode très compliquée d'extraire 1q bois de Campôche}. IIigkson, Qwrtw' 



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' m mm. ** \^^ r^ 



HÉHATOXYLINE ET AUTRES COLORANTS VÉGÉTAUX 103 

Joum. Mic. Scù, 4883, p. 244 (idem). Cook, JoUm. of Anat. and Phys.y 
1879, p. 140 (solution au sulfate de cuivre; j'en ai trouvé la préparatioi^ 
par trop aléatoire). Haug, ZeiL f. v)iss. Mik., VIII, I, 1891, p. 51 (solution 
à l'acétate d'alumine). Sanfeuce, Joum. de Microgr.y XIII, 1889, p. 335; 
Joum. Boy. Mie. Soc, 1889, p. 837) (Mayer, qui a étudié cette teinture (Vk 
MiUh. ZooL Stat. Neapel, X, I, 1891, p. 178-182) dit que c'est essentielle- 
ment une solution de Boehmer contenant une plus grande proportion d'aU 
cool et un peu d'iode. L'iode n'aurait pas d'autre utilité que d'empêcher la 
précipitation de la matière colorante à la surface des organes). Gage, Proc. 
Amer. Mie. Soe., 1893» p. 123; cf. Journ. Roy. Mie. Soe., 1893, p. 564 
(solution additionnée d'hydrate de chloral pour prévenir le développement 
de ferments vivants. Elle ne se conserve pas mieux pour cela (Mayer, in lilt.). 
Hache, Comptes rend. Soc. Biol. Paris, 10, I, 1894, p. 253-369 (complique 
et superflu, Mayer, in litL). 

b. Solutions alcooliques. 

- 139. Hœmacalcium (Mayer, MiUh. ZooL Stat. NBapel, X, 1, 1891, 
p, 182). — Hématéine (ou bien hématéate d'ammoAiaque, n** 125)^ 
.1 gr. ; chlorure d'aluminium, 1 gr. ; chlorure de calcium, SO gr. ; 
acide acétique cristallisable, 10 ce. (ou 20 ce. de Tacide ordinaire) ; 
alcool à 70 p. 100, 600 ce. Broyez intimement ensemble les deux 
premiers ingrédients.; ajoutez l'acide et l'alcool et faites dissoudre à 
l'aide de la chaleur ou à froid ; ajoutez en dernier lieu le chlorure 
de calcium. 

Liquide d'un violet rougeâtre, imaginé pour remplacer Thématoxy- 
line de Kleinenberg en vue des sérieux désavantages qui sont insépa- 
rables de la préparation de celte dernière (voyez plus bas, n** 141). Em- 
ploi comme pour celle-ci. Si les tissus se colorent en un ton trop rouge, 
■il faut les traiter par une solution de chlorure d'aluminium dans 
l'alcool (2 p. 100 environ), ou par une solution (de 0,8 à 1 p. 100) 
d'acétate de soude ou de potasse dans l'alcool absolu, ou par du 
bicarbonate de soude (voyez au n° 128, vers la fin). 

Avec certains objets, la pénétration de cette teinture laisse à 
désirer, la coloration ne se faisant bien que dans les couches super<- 
ficielles. On remédie à cela soit en acidifiant la solution, soit (ce qui 
vaut mieux) en laissant les objets pendant quelque temps avant la 
coloration dans de Talcool acidifié. En tout cas, les tissus à colorer 
ne doivent pas avoir une réaction alcaline. En prenant ces précau- 
tions, il ne sera pas nécessaire d'employer des acides pour les lavages. 

Enfin, pour certains objets (Hydraires, par exemple), on peut 
augmenter la puissance de pénétration du liquide en l'allongeant 
d'environ un tiers de glycérine ou en augmentant la proportion de 
chlorure d'aluminium, jusqu'à environ huit fois celle de l'hématéineu 



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104 CHAPITRE VIII 

Mayer a trouvé depuis (Milth.^ X, 3, 1892, p. 499) que a solution n'est 
pas parfaitement stable, mais vire au bleu avec le temps et précipité. Pour 
éviter cet inconvénient on peut faire le mélange dans deux flacons, dont cha- 
cun contiendra la moitié de Talcool et de l'acide, mais l'un d'eux contiendra 
en outre tout le chlorure de calcium, et Tautre toute l'hématéine et tout 
le chlorure d'aluminium. On prend alors pour préparer le bain de teinture 
une quantité égale dans chaque flacon. 

Il faut bien comprendre que Mater ne recommande pas cette solu- 
tion comme donnant d'aussi bons résultats, comme teinlure^ que 
THémalun ; elle lui est au contraire inférieure sous le rapport de la 
caloration. Mayer est même d'avis qu'aucune solution alcoolique 
d'hématéine ne saurait fournir une coloration aussi précise que les 
solutions aqueuses ; car la nature aqueuse de la menstrue parait être 
en elle-même une condition favorable pour la qualité de la colora- 
tion. Il la recommande seulement à titre de remplaçant de Théma- 
toxyline de Kleinenberg pour les cas qui demandent une teinture 
alcoolique, comme étant facile à préparer, commode à employer, 
et d'un effet constant. Or aucune de ces qualités ne peut être attri- 
buée à Thématoxyline de Kleinenberg. 

140. Hémalun alcoolique (Mayer, l, c, p. 183, note). 

C'est suivant le conseil de Mayer lui-même que je supprime cette 
formule. 

141. Hématoxyllne alcoolique de Kleinenberg {Éléments (Vembiyo- 
logie de Poster et Balfour, 1877, p. 296 ; Quart. Joum, Mie, Science, 1879, 
p. 208). — On fait une solution saturée de chlorure de calcium dans de 
l'alcool à 10^ et l'on ajoute un peu d'alun (on peut saturer d'alun si Ton 
veut). On filtre cette solution et on l'étend de 6 à 8 volumes d'alcool à 70^ 
Au moment d'employer ce liquide, on l'additionne de quelques gouttes d'une 
solution concentrée d'hématoxyline dans l'alcool absolu, de manière à for- 
mer une teinture plus ou moins foncée, selon la nature des objets à colorer. 
(Nous citons les instructions données par Kleinenberg. Nous avons trouvé, 
pour notre part, qu'il est préférable de ne pas colorer avec une solution 
préparée sur rheure, mais de laisser mûrir la teinture pendant au moins 
vingt-quatre ou quarante-huit heures.) 

La teinture d'hématoxyline récemment préparée doit être d'un violet 
virant au bleu, et ne doit pas présenter une nuance rouge. On comprend 
facilement la faveur dont ce liquide a joui auprès des naturalistes pendant 
si longtemps. C'est que c'était la seule teinture vraiment alcoolique d'héma- 
toxyline qui eût été proposée. Elle répondait à un besoin véritable, et 
lorsque tout avait réussi dans la préparation et dans l'emploi elle donnait 
des résultats excellents. Mais cette préparation était toujours chose des 
plus incertaines. La formule de Kleinenberg esta tel point irrationnelle qu'il 
est impossible de l'exécuter à la lettre ; en conséquence, les propriétés du 
produit qu'elle fournissait étaient tout ce qu'il y a de moins constant. Et 



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HÉMATOXYLINE ET AUTRES COLORANTS VÉGÉTAUX 105 

naturellement les résultats de la teinture étaient inconstants aussi. Pour 
ces motifs je pense que ce liquide, qui m'a rendu pourtant dans le temps 
de bons services, doit être abandonné en faveur de THémacalcium de Mayer. 
J*ai donc supprimé les très longues et minutieuses instructions obligées 
concernant son emploi. J*ai aussi supprimé, à regret, par manque de 
place uniquement, la très instructive et très détaillée critique de Paul Mayer 
(Mitth.Zool. Slat, Neapel, X, J, 1891, p. 174), (à qui je suis en une large 
mesure redevable du point de vue auquel je me place maintenant), comme 
aussi la critique excellente et parfaitement autorisée de Squire {Methods 
and FonnulXy etc., 1892, p. 25). 

Deux formules alternatives ont été proposées parDiPPEL (dans son Handb. 
der Mikroskopié) dans le but d'éviter la double décomposition de Talun et 
du chlorure de calcium en prenant du chlorure d*aluminium en premier 
lieu. Voyez les critiques de cette proposition dans les travaux précités de 
Mayer et de Squire. 

Les formules modifiées de Squire {L c.) et de von Wistingiuusen (Mitth. 
ZooL Stat. Neapel, X, 1891, p. 41 ; cf. ZexL f, wiss. Mik., X^ 4, 1893, p. 479) 
ne paraissent pas écarter la difficulté qu'il y a à arriver à la production de 
la proportion voulue de chlorure d'aluminium par la double décomposition 
d'alun et de chlorure de calcium. 

142 . Hématoxyline à l'iodiure de potassium (Guccati, ZeiL f. wiss. 
Mik,, V, I, 1888, p. 55). 

B. — Autres laques 

143. Hématoxyline au bichromate de potasse (Hbiden- 
HAiN, Arch, f. mik, Anat., 24 Bd., 1884, p. 468). — On colore pen- 
dant huit à dix heures dans une solution d'hématoxyline dans l'eau 
d'une concentration de 0,5 à 1 p. 100. Puis on met les objets pendant 
le même temps dans une solution de bichromate de potasse de la 
même concentration. On enlève l'excès de bichromate par le lavage 
à Teau, on traite par Talcool suivant les méthodes connues, et Ton 
pratique l'inclusion, s'il y a lieu, dans la parafOne ou dans le baume. 

Les noyaux se trouvent colorés en noir, les autres éléments en 
diverses nuances de gris. L'avantage de la méthode consiste précisé- 
ment dans la clarté avec laquelle elle fait ressortir ces autres éléments 
qui, par les méthodes ordinaires de teinture élective, ne se voient 
pas facilement. Elle réussit avec tous les tissus, excepté le foie et le 
rein. 

On ne doit employer que de petits objets. Les pièces doivent avoir 
été préalablement bien durcies à l'alcool. 

(Les pièces qui ont été fixées par le sublimé doivent en avoir été 
débarrassées par un lavage prolongé à l'eau, car les traces de sublimé 
qui restent dans les tissus forment av^ec l'hématoxyline neutre un 



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106 CHAPITRE Vin 

précipilé noir foncé; pour éviter là formation de ce précipité, il est 
bon de colorera Tobscurité. (Tornier, Arch, f. mik. Anat.^ XXVIII, 
1886, p. 181 ; ZeiL f. wiss. Mik, III, 3, 1886, p. 467.) 

On peut employer des objets chromiques, à condition qu'ils aient 
été bien lavés. On peut atténuer les colorations excessives en lavant 
plus longtemps dans le bichromate. Gierke a trouvé que des pièces 
qui étaient presque noires dans Thématoxylino se décoloraient entiè- 
rement par un lavage de quarante-huit heures dans la solution de 
.bichromate. 

Heidenhain recommande maintenant {Arch, f. mik, Anat., 1886, 
p. 383) la modification suivante : — Les pièces durcies à l'alcool ou à 
Tacide picrique sont colorées pendant douze à vingt-quatre heures 
.dans une solution aqueuse d'hématoxyline à 1/3 p. 100 et décolorées 
ensuite dans une solution à. 0,5 p. 100 de chromate simple de 
potasse, au lieu de bichromate. L'avantage de cette modification du 
procédé est que, appliquée à des pièces peu volumineuses, elle donne 
une coloration extrêmement précise de la chromatine. 
» L'un et l'autre de ces procédés donnent de très belles colorations. 
Ils offrent le grand avantage de permettre à l'opérateur d'arriver 
toujours au degré de différenciation voulue par le lavage dans la 
solution décolorante. S'il s'agit de coupes, le contrôle peut se faire 
au microscope. 

144. Procédé au bichromate d'Apathy \Zeit. f, wiss, Mih,, 
V, I, 1888, p. 47). Cette modification de la teinture de Heidenhain 
est un procédé alcoolique. On colore dans une solution à 1 p. 100 
d'hématoxyline dans de l'alcool à 70 ou 80 p. 100. On difl'érencie dans 
une solution à 1 p. 100 de bichromate de potasse dans de l'alcool à 
70 ou 80 p. 100, Des coupes minces, c'est-à-dire de 10 à 15 {jl, deman- 
deront une différenciation durant la moitié du temps employé à la 
coloration ; et des coupes épaisses, c'est-à-dire de 25 à 40 p., deman- 
• deront une diff'érenciation de deux fois la durée de la coloration. 

Le bichromate de potasse est très peu soluble dans l'alcool fort. 
On peut commodément préparer la solution en mélangeant 1 partie 
d'une solution aqueuse à 5 p. 100 avec environ 4 parties d'alcool de 
80 à 90 p. 100. Le mélange doit être fraîchement préparé au moment 
de servir^ et il doit être tenu à l'obscurité complète pendant toute la 
durée de la diff'érenciation, vu que la lumière le ferait précipiter. Il 
doit être renouvelé plusieurs fois pendant la durée de la diff'érencia- 
tion. Lorsque les objets auront été suffisamment décolorés, ils doivent 
être soigneusement lavés (toujours dans l'obscurité) dans de l'alcool 



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HÉB14T0XYLINE ET AUTRES COLORANTS VÉGÉTAUX 107 

à 70 p. 100 plusieurs fois renouvelé. Ce procédé doiineFait, d'après 
Âpalhy, des préparations plus transparentes et d*une coloration plus 
précise'ment localisée que le procédé de Heidenhain. Il est évident 
que la nature alcoolique des liquides employés peut souvent avoir son 
importance. 

- Pour la coloration de séries de coupes faites à la cellôidine Apatuy 
{ibid.j VI, 2, 1889, p. 170) modifie le procédé comme suit. Les coupes 
sont colorées dans la teinture d'hématoxyline pendant 10 minutes- 
L'excès de teinture est alors enlevé de chaque coupe au moyen de 
papier buvard, et les coupes sont portées dans de Talcool à 70 p. 100 
additionné seulement de quelques gouttes de la solution aqueuse de 
bichromate. Elles y restent 5 à 10 minutes (toujours dans Tobscurité). 
On obtient une coloration semblable à celle qui est donnée par le 
traitement en masse du premier procédé. 

145. Hématoxyline à l'alun de fer de M. Heidenhain ^ 

(M. Heidenhain, Ueber Kern. u. Protoplasma^ àQXi^Festschr.f.Kôlli" 
ker, 1892, p. 118). — Pour les coupes seulement. Des coupes sont trai- 
tées pendant une demi-heure, ou au plus deux ou trois heures, par 
une solution aqueuse d'alun ferrique (sulfate double d'ammoniaque 
et de sesquioxyde de fer « (NH Jj Fe, (SO J^. On les lave un moment à 
Teau et on colore (de une demi-heure jusqu'à douze heures) dans une 
solution aqueuse d'hématoxyline (0,5 p. 100 environ). On rince à 
Teau, et Ton traite de nouveau par la même solution d'alun de fer qui a 
servi au mordançage. La décoloration se fait assez lentement» (Elle 
sera cependant souvent assez complète au bout d'une vingtaine de 
minutes, à ce que j'ai trouvé.) On peut et on doit en contrôler le progrès 
sous le microscope (on peut dans ce but remettre les coupes dans de 
l'efiiu autant de fois qu'on voudra). La différenciation obtenue, on 
Jave bien à l'eau (je conseille de laver beaucoup, au moins un quart 
d'heure dans de l'eau courante, cependant pas plus de trente minutes 
à une heure (Heidenhain). On déshydrate, et l'on monte au baume* 
Voici quelques détails supplémentaires qui ont été donnés par 
Heidenhain dans Arch. f. mik. Anat. XLIII, 3, 1894, p. 431, 435. 
Pour faire la teinture, il vaut mieux employer Thématoxyline que 

^ Ceci est une modification d'une ancienne méthode, maintenant abandonnée, 
de Benda (Vei'h, phys. Ges. Berlin, 1885-6, n" 12, 13, 14 ; A7'ch, f. Anal, u, Phys, 
1886, p. 562). Benda mordançait dans Talun ferrique, mais difTérenciait dans de 
Tacide chromique. 

* « SchvrefelsaureH Eisenammont)xyd », sel double du sesquioxyde, en beaïix 
cristaux violets ; ne pas confondre avec le «el double du protoxyde- (cristaux 
verts, sel de Mohr), qui ne peut pas servir. 



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i08 CHAPITRE VIII 

rhématéine. L'alun de fer à employer doit se présenter sous forme 
de cristaux transparents d'un violet clair ; si ces cristaux deviennent 
jaunâtres et opaques, c'est qu'ils sont vieillis et ne peuvent plus servir. 
Il faut les conserver dans un flacon bien bouché à l'émeri. La solution 
doit être faite sans chaleur. 

Les résultats diffèrent selon la durée du mordançage et de la colo- 
ration. Si Ton n'a donné que des bains de peu de durée dans le mor- 
dant et dans la teinture, par exemple une demi-heure dans chaque, 
on obtiendra une coloration bleue ^ Ces préparations montreront une 
coloration très intense et élective de tous les éléments des noyaux, 
tant achromatiques que chromatiques, les éléments du cytoplasme 
demeurant peu colorés. Si au contraire on a donné des bains pro- 
longés (12 à 18 heures) dans le mordant et dans la teinture (ce 
qui rendra nécessaire une différenciation un peu prolongée dans le 
deuxième bain de fer), on obtiendra une coloration noire. Ces prépa- 
rations montrent les éléments des noyaux colorés comme dans la 
première méthode, mais en outre les « centrosomes > ou corpuscules 
polaires colorés en noir intense, la masse générale du cytoplasme 
tantôt incolore, tantôt grise, et en ce cas les fuseaux achromatiques 
et les plaques cellulaires sont colorés ; en outre, les flbres du tissu 
conjonctif sont noires, les corpuscules rouges du sang sont noirs, et 
les micro-organismes, s'il en existe dans les tissus, sont nettement 
démontrés. Le tissu musculaire strié devient également très beau 
(Mayer). Les préparations sont dites parfaitement permanentes. 

Je ne puis que recommander beaucoup cette méthode, qui m'a 
donné pour certains objets de meilleurs résultats qu'aucune autre 
méthode à l'hématoxyline. On peut l'employer après ûxation par le 
sublimé ou par les mélanges chromo-osmiques ou par Talcool. Elle 
est facile à exécuter et donne des colorations de toute beauté *. Je 
lui reprocherais cependant de ne pas donner toujours des prépara- 
tions parfaitement propres. On y rencontre souvent des précipités 
amorphes. 

146. Hématoxyline à Tacétate de fer de Bûtschli (Bûtschu, 
Untei's. ueber mikroskopische Schaume u. dos Pi'otoplasma, 1892 ; Zeit, A 
wiss, Mik,y IX, 2, 1892, p. 197). — Les tissus sont traités d*abord par une 
faible solution d^acétate de fer, d'un brun clair, puis lavés, et colorés dans 
une solution d'hématoxyline à 0,5 p. 100 dans Teau. Ce procédé donne une 
coloration d*un noir bleu ou brun d^une intensité extraordinaire, qui inté- 

* Mayer {in litL) doute que le ton de la coloration puisse dépendre de la durée 
des bains. 

* Pas toujours (Mayer). 



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HÉMATOXYLINE ET AUTRES COLORANTS VÉGÉTAUX 109 

resse le protoplasma eo même temps que les noyaux. Il n'a de raison d'être 
que là où Ton demande surtout une intensité spéciale de coloration. 

146 bis. Nouvelle méthode au sulfate de fer de Benda 

{Verh. d. anal, Ges,, VII, Vers. Gottingen, 1893, p. 161 ; Zeit.f. wiss. 
Mik. XI, 1, 1894, p. 69, et Rawitz, Leitfaden, 1895, p. 73). — Le mor- 
dançage à Talun ferrique (n® 148) a le grand inconvénient de donner 
lieu à la formation de précipités amorphes dans les préparations. 
Pour les éviter Benda procède maintenant comme suit. On emploie un 
matériel fixé de n importe quelle façon. Les coupes sont mordancées 
pendant vingt-quatre heures dans le Liquor ferri sulfurici oxydati de 
la Pharmacopœa Germanica S allongé d'un ou de deux volumes d'eau. 
On lave bien à Teau distillée, puis à Teau de source, et Ton porte 
les coupes dans une solution aqueuse d'hématoxyline à 1 p. 100 ou 
on les laisse jusqu'à ce qu'elles soient devenues noires. On lave et 
différencie dans de l'acide acétique à 30 p. 100 en surveillant la 
marche delà décoloration ; ou bien dans un acide plus faible, auquel 
cas il n'y aura pas besoin de surveiller la décoloration ; ou bien aussi 
dans la solution de sulfate de fer fortement allongée d'eau. Ce pro- 
cédé s'applique à toute sorte d'organes et donne en particulier une 
excellente coloration pour les cylindres-axes, et les éléments achroma- 
tiques de cellules en spermatogénèse. On peut pour ce dernier objet 
ajouter une deuxième coloration par la fuchsine acide (auquel cas il 
est bon d'avoir différencié dans la solution de fer, qui agit comme mor- 
dant pour la fuchsine). On doit obtenir la chromatine, les centrosomes 
et les vestiges fusoriaux (Zwischenkôrper) colorés en noir ; les fila- 
ments de linine et les filaments des fuseaux en rouge. 

146 ter. Hématoxyline à l'acétate de cuivre de Benda. — 

(Du Bois Reymond's, Arch. f. AnaL u. Phys., Phys. Abth., 1886, 
p. 186 et Arch. f. mik. Anat,, XXX, p. 49). — Des coupes de matériel 
fixé dans le liquide de Flemming sont collées sur des verres à couvrir 
et mises pendant vingt-quatre heures dans une forte solution d'acétate 
de cuivre, le tout étant tenu dans un incubateur à une température 
de 40*^ G. environ ou laissé pendant 48 heures à la température de la 
chambre. On lave et on colore pendant cinq minutes, ou jusqu'à une 
teinte grise foncée ou noire dans une solution à 1 p. 100 d'hématoxyline 
dans l'eau. On décolore par le lavage dans de l'acide chlorhydrique 
(à 1/300 ou 1/800 d'eau), lavage que l'on prolonge plus ou moins 
selon qu'on désire obtenir une coloration purement nucléaire ou une 

' Sulfate de fer, 80; eau, 40; acide sulfurique, 15; acide nitrique, 18. 



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110 CHAPITRE VllI 

coloration plus ou moins plasmatique. Par celte décoloration, les 
préparations passent à une teinte jaune ; pour restituer la coloration 
bleu-gris de Thématoxyline et la flxer, on remet les préparations 
dans la solution d'acétate de cuivre. Puis on lave, on déshydrate et 
monte au baume. Ge procédé a l'avantage de différencier les mitoses 
d'une manière très énergique, et donne en même temps une colora- 
lion plasmatique plus ou moins prononcée. Voyez aussi les observa- 
tions de PiERSOL dans Amer. Mie, Mon. Joum.^ 1887, p. 158 ; ou dans 
Journ. Roy. Mie. Soc.^ 1888, p. 158; ou dans ZeiL f. wiss. Mik., 
V, 4, 1888, p. 499. 

147. Méthodes de Minot {ZeiL f. wiss: MiL, 1880, p. 177). — Ce sont 
des modifications des procédés de Weigert, de Heidenhain et de Bœhmer, 

148. Hématoxyline de Weigert. — Celte méthode s'applique sur- 
tout à l'étude de la distribution des nerfs à myéline. Nous la décrirons, avec 
ses congénères, dans la deuxième partie. 

C. — Autres colorants végétaux 

149. La purpurine. — (Voy. Ranvier, Traité teehnique, p. 280.) 

" 150. Purpurine glycérique (Grenaceer, Areh., f. mik. Anat., 
XVI, 1879, p. 470). 

151. L'indigo n'est employé en histologie que sous forme de Carmin 
d'indigo. Cette substance, qui est le sel potassique ou sodique de Tacide 
sulfindigolique ou sulfocœruléiuique, se trouve dans le commerce. Elle 
donne des colorations diffuses, plutôt plasmaliques, qui, combinées avec 
une teinture au carmin ou un autre réactif agissant seulement surles noyaux, 
fournissent des colorations doubles, qui sont capables de rendre des 
services. Nous en parlerons au chapitre des Colorations combinées. Per- 
sonnellement, j'ai trouvé ce colorant énergique et envahissant, par trop 
difficile à régler, et je pense qu'il* n'y a pas lieu de faire grand fonds sur 
lui. 

Le Carmin d'indigo à l'acide oxalique (Thiersch, Arch. f. mik. 
Anat.j 1, 1865, p. 150) est une solution démodée et qui parait être superflue. 

152. Le safran (Blanc, Zool. Anzeiger, 1883, p. 23). 

153. L'orseille est une matière colorante extraite d'un lichen, la Roc- 
cella tinctoria. Elle donne des colorations plasmatiques. 

Wedl (Arch. f. path. AnaL, LXXIV, p. 148) prend de l'extrait d'orseille 
française, le chauffe doucement au bain-marie pour chasser l'excès d'ammo- 
niaque qui existe habituellement dans l'orseille du commerce, et l'ajoute à 
un mélange de 20 ce. d'alcool absolu, 5 ce. d'acide acétique d'une densité 
de 1.070, et 40 ce. d'eau, de manière à obtenir une solution saturée d'un 
rouge foncé. Il faut filtrer une ou deux fois. 



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HÉMATOXYLINE ET AUTRES COLORANTS VÉGÉTAUX lll 

On doit laver les coupes dans Teau avant de les colorer. Pour les con- 
server, Wedl les monte dans de la lévulose. Les noyaux demeurent inco- 
lores, le protoplasma se colore, les cellules du tissu conjonctif se colorent 
d'une façon très intense, la substance intermédiaire moins. Les cellules 
ganglionnaires et leurs prolongements se colorent, de même que la subs- 
tance fondamentale du tissu des os et des dents. 

Fol (Lehrb., p. 192) recommande de colorer pendant une heure dans la 
solution de Wedl, puis de rincer à Talcool et de passer à la teinture complé- 
mentaire des noyaux. 

154. Orcéine (Israël, Virchow's Archiv., CV, 1886, p. 169 ; 
Joum. Roy. Mie, Soc, 1887, p. 514). — L'orcéine est une matière 
colorante extraite d'un lichen, Lecanora parella (ne pas confondre 
avec Torcine, autre dérivé du même lichen). Elle se trouve dans le 
commerce. D'après Israël, elle réunit en elle-même les qualités tincto- 
riales à la fois des couleurs « basiques » et des couleurs « acides » et 
donne en même temps une coloration en deux couleurs contrastées. 
Il colore (des coupes seulement) dans une solution contenant 
2 grammes d'orcéine, 2 grammes d'acide acétique cristallisable et 
100 grammes d'eau distillée, lave à l'eau, déshydrate aussi rapide- 
ment que possible dans l'alcool absolu et monte dans de l'essence de 
cèdre épaissie *. Les préparations réussies doivent montrer les noyaux 
bleus, le protoplasma rouge. 

L'orcéine fournit en outre une coloration spécifique du tissu élas- 
tique ; nous en parlerons dans la deuxième partie. 

155. Kemsch-warz (Platner, Zeit. f. wiss. Mik,, IV, 3, 1887, 
p. 349). — Le Kernschwarz est un liquide noir de composition incon- 
nue, qui est préparé en Russie et qu'on peut se procurer chez Grûbler 
(n** 99). D'après Grûbler, ce serait une solution d'une base métallique 
combinée à un acide organique. Platner recommandait d'y colorer 
des coupes pendant quelques minutes seulement (à moins que le maté- 
riel n'ait été fixé dans le liquide de Flemming, auquel cas il faudrait 
vingt-quatre heures), puis de dilTérencier dans un liquide alcalin. On 
peut prendre pour cela de l'eau ammoniacale (8 à 6 gouttes d'ammo- 
niaque pour un verre de montre d'eau). Mais il vaut mieux prendre 
une solution concentrée ou plus ou moins diluée de carbonate de 
lithine. On obtient, selon la durée de la décoloration, soit une colo- 
ration pure de la chromatine des noyaux, soit en même temps une 
coloration des éléments protoplasmiques, surtout d'un élément cyto- 

* Israël, Prakticum der path, Hist,, 2 Aufl., Berlin, 1893, p. 72. Je dois cette 
iiKlication à robligeance de M. le l)r Mayer. 



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112 CHAPITRE Vin 

plasmique des cellules glandulaires que Platner appelle « Nebenkern » 
(ne pas confondre avec le Nebenkern des spermalocytes). On déshy- 
drate et Ton monte au baume de la manière usuelle. 

En somme, Platner recommandait le Kernschwarz à titre de colo* 
raut de la chromatine. J'ai déjà dit ailleurs que, d'après mon expé- 
rience, il ne me semblait pas avoir des qualités très spéciales à cet 
égard. Après une expérience plus étendue j'ajoute maintenant qu'en- 
visagé comme colorant pldsmatiquey le Kernschwarz me paraît être 
\in réactif des plus importants. C'est en tout cas un des colorants plasma- 
tiques les plus utiles et les plus instructifs que je connaisse, — je ne dis 
pas un des plus beaux, car la coloration teinte neutre, très sobre, qu'il 
fournit n'a rien de flatteur pour l'œil. Je l'emploie comme suit : les 
coupes, collées sur porte-objet (de matériel fixé au mélange de 
Flemming, je n'ai pas réussi avec du matériel au sublimé) sont 
traitées par le Kernschwarz jusqu'à ce qu'elles accusent une teinte 
gris-jaune légère. (Si le matériel est frais et que le Kernschwarz soit 
frais aussi, cela peut arriver en quelques secondes ; en ce cas, il sera 
prudent d'allonger le Kernschwarz d'une dizaine de volumes d'eau, 
car il est important de ne pas surcolorer. Si le matériel est vieux (de 
quelques mois ou années) et si la provision de Kernschwarz est éga- 
lement vieille, il sera peut-être nécessaire de colorer pendant vingt- 
quatre heures). Je renonce à la différenciation alcaline, qui est inutile 
si l'on a soin de ne pas surcolorer. Après coloration, on rince à l'eau 
et l'on colore pendant dix-huit à vingt-quatre heures ou jusqu'à qua- 
rante-huit heures dans soit la safranine anilinée de Bases ou de Zwaar- 
DEMAKER, soit dans le violet gentiane, le bleu Victoria ou un autre colo- 
rant de la chromatine qu'on préfère. On lave à l'alcool pur ou très 
légèrement acidulé par l'acide chlorhydrique et l'on monte au baume 
selon la méthode usuelle pour les teintures d'aniline. On doit obte- 
nir ainsi une coloration double presque parfaitement pure. C'est-à- 
dire que la chromatine des noyaux (ainsi que leurs nucléoles) doit 
montrer le rouge de la safranine sans aucun mélange important du 
gris du Kernschwarz, et que l'élément plastinien des noyaux et du 
cytoplasme doit être d'un gris-brun plus ou moins foncé sans aucun 
mélange du rouge de la safranine. L'enchylème, soit l'hyaloplasme, 
des noyaux et du cytoplfiisme, est totalement ou presque totalement 
incolore ; diverses enclaves du cytoplasme sont assez fortement colo- 
rées, ainsi que le Nebenkern des spermatocytes. J'ai expliqué ailleurs 
[La Cellule^ t. XI, 1®" fasc, mars 1895, p. 31) que cette méthode est 
la seule qui m'ait permis de colorer avec certitude les vestiges de 
fuseaux en régression. C'est ce que j'ai trouvé de mieux pour ce 



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, ^.wf r * ■ 



HÉMATOXYLINE ET AUTRES COLORANTS VÉGÉTAUX 413 

genre de recherches, et je pense que c'est une méthode d'une appli- 
calion assez générale. 

166. Autres teintures végétales. — Les suivantes sont les unes 
mauvaises, les autres superflues : le tournesol (Lawson-Tait, Joum» of 
Anal, and PhysioL, IX, p. 230) ; le chou rouge (Lawson-Tait) ; le Myr- 
tillus, extrait de baies de Myrtilles (Lavdowsky, Arch. /*. mik. Anat.y 
XXIII, 1884, p. 506); la Ribésine, extrait de baies de cassis (Fol, 
Lehrb., p. 184) ; la Nucine, soit brou de noix (Léon, ZooL Anz,, 1888» 
p. 624). 



ANAT. UICROSC. 



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CHAPITRE IX 

DES COULEURS DE LA HOUILLE 
ET DES COLORATIONS RÉGRESSIVES 



157. — Nous renvoyons aux traités de Chimie et de Teinturerie pour tout 
ce qui regarde la chimie si compliquée de ces nombreux corps colorants. 
Le lecteur trouvera du reste un exposé succinct mais admirablement fait 
dû ce sujet difficile dans Gierke, Fœrberei zu mik. Zwecken (ZeU. f, wiss, 
Mikroskopie, II, 1885, p. 21 à 36, et 164 à 183). Nous nous bornons à donner 
ici une classification abrégée de ces corps, qui pourra servir à guider Tétu- 
I liant dans ses lectures, et un tableau des solubilités et réactions histolo- 
^^iques des principales couleurs de la houille employées en histologie, qui 
pourra avoir une utilité pratique. Nous avons combiné ces tableaux d'après 
lo travail précité de Gierke, et d'après les tableaux donnés par Griesbacu 
(Arch, f. mik, Anat,^ XXII, p. 134), par Harris [Quart. Jouim. Mie, Science, 
XC, 1883, p. 301), et d'après les Tabellen de Behrens, et d'autres sources. 

158. Classification des Couleurs de la houille. 

Les couleurs de la houille se divisent en trois groupes principaux, com- 
prenant : 1<> les dérivés de l'Aniline ; 2<* les dérivés de la Naphtaline, 
et 3<^ les dérivés de TAnthracène. 

Le groupe des Anilines (y compris la Safranine, qui dérive non de 
TAniline, mais de son homologue la Toluidine) peut être subdivisé de la 
manière suivante : 

i. Produits de l'oxydation de l'Aniline : — Noir d'aniline, Induline, 
Nigrosine, Bleu de méthylène. 

2. Produits de l'oxydation de la Toluidine : — Safranine. 

3. Produits de l'oxydation de mélanges d'Aniline et de Toluidine ; — ce 
sont les composés de la Rosaniline : — Fuchsine et autres. 

4. Produits de la substitution des atomes d'hydrogène de la Rosaniline par 
les radicaux méthyle ou éthyle : — ce sont les importants violets et verts, 
— Dahlia, Violet de méthyle. Vert de méthyle. Vert d'iode. 

5. Produits de la substitution des atomes d'hydrogène de la Rosaniline par 
le groupe moléculaire phényle : — Bleus d'Aniline et quelques verts qui ne 
âont guère employés en histologie. 



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Qoo^^ 



DES COULEURS DE LA HOUILLE 



115 



6. Couleurs azoïques : -r« Jaunes, Brun Bismarck, etc* 

7. Dérivés azotés du Phénol : — Acide picrique, Dinitrosorésorcine. 
8- Couleurs oxyazoïques ; — les Tropaeolines, FOrange G, etc. 

9. Les Phtaléines, obtenues par Faction de Fanhydride phtalique sur 
te Phénol : — Éosine. 

10. Produits de Foxydation du Phénol : — Aurine. 

11. Dérivés de la base Quinoline (ou Leucol) : — Bleu de Quinoléine. 

Le groupe des dérivés de la Naphtaline comprend : 

1. L'Amidoazonaphtaline :. — Rose de naphtaline (ou Rouge de Mag- 
dala). 

2. Les azo-composés des deux Naphtols (a et p Naphtol] : — les 
Bordeaux, les Tropœolines, Ponceau, et autres rouges ; avec d'autres dérivés 
qui ne trouvent pas d'emploi en histologie. 

Le groupe des dérivés de FAnthracène comprend les Alizarines et les 
Purpurines artificielles. 

TABLEAU 

DES COULEURS DS LA HOUILLE EMPLOYÉES EN HISTOLOGIE, AVEC LEURS SOLUBILITÉS 
ET PROPRIÉTÉS HISTOLOGIQUES 



SUBSTANCE 



GROUPE DES ANILINES 

!• 
Noir d'aniline (Noir 
de Colin; Nigraniline, 
Aniline blue black.) 



Les Indulines (Indu- 
Une, Nigrosine, Benga- 
line, Indigo artificiel, 
Bleu noir, Blackley- 
blue). 

Bleu de méthylène. 

Thîonine (Violet de 
Lauth). 



Safranine. 



Mauvéine. 



SOLUBILITÉ 



Insoluble à 
Feau, soluble 
dans le phé- 
nol et Fani 
Une. 



Eau et al- 
cool, selon l'é- 
tiquette. 



Rau et alcool, 
Eau. 



Eau et alcool. 



COULEUR 



Noir. 



Bleu. 



Bleu. 
Violet. 



Rouge. 



Violet. 



OBSERVATIONS 



Employé vraisembla- 
blement par LuYS et 
d'autres pour coupes de 
cerveau durci & Tacide 
chromique (mais voyez 
n« 203). 

lnduline,marque bleue, 
nigrosine nuance plus 
noire. Voyez 172 et 202. 



Voyez 172 et 180 à 188. 

Homologue du bleu de 
méthylène. N''172. 



Très important. Voyez 
n» 167. ' 

172. Ne se fabrique 
plus. 



* Les chiffres dans celle colonne renvoient aux sabdivisions de la liste donnée dans le para- 
graphe précédent. 



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116 



CHAPITRE IX 



SUBSTANCE 


SOLUBILITÉ 


COULEUR 


OBSERVATIONS 


GROUPE DES ANILINES 








Rouge neutre (Neu- 


Eau. 


Rouge. 


Colorations vitales. 


tralrolb). 






192. 


3 
Fuchsine (rouge d'a- 


Selon rèti- 


Rouge.- 


On appelle « Fuchsine » 


niline, Rubine,Ro8éine, 


quette. 




toute une série de sels 


MagenU, Solférino, Co- 






de Rosaniline.Le produit 


ralline, Azaléine), ces 






commercial est un mé- 


sels sont des couleurs 






lange des sels de deux 


« basiques ». 






bases, rosaniline et pa- 
rarosaniline. Le violet 
Magenta, la fuchsine V, 
la cerise, le cardinal, 
l'amaranth, sont des mé- 
langes de Magenta avec 
d'autres couleurs. Voyez 
n» 172. 


Fuchsine acide (Saû- 


Eau. 


Rouge. 


Tous ces noms sontdes 


refuchsin, Fuchsin S. 






synonymes. La fuchsine 


Saûrerubin, Magenta 






acide est le sel de so- 


S., Magenta acide, Ru- 






dium de la rosaniline 


bine S., Rubine acide), 






disolfoconjuguée; elle 


dans laquelle le prin- 






se présente sous des 


cipe colorant est un 






nuances plus violettes 


acide y au lieu d'être 






ou plus jaunes selon les 


une base comme dans 






procédés de fabrication. 


la Fuchsine ordinaire. 






Colorant plasmatique 


On peut s*en procurer 
chez le D' Grûbler, 17. 






très important, n« 189. 








Dufourslrasse, Leipzig. 








N^est fabriquée que par 








la Badische Anilin und 






^ 


Soda Fabrik. 








4 

Violet de méthyle. 


Eau et Alcool. 


Violet. 


Réactif pour matière 


(Violet de méthylani- 






amyloïde, et pour Bacté- 


line, Violet de Paris.) 






ries .-voyez aussi n*'172, 
179. 


Violet B. 


Eau. 


Violet. 


Colorant spécifique des 
vaisseaux du tissu con- 
jonctifetadipeux(MAYER, 
S), voyez n* 199. 


Violet de Gentiane. 


Eau et alcool. 


Violet. 


Vun des plus impor- 


(Chimiquement le 






tants des colorants des 


même corps que Vio- 






noyaux. Stable (Flem- 


let B, plus un corps 






iiiNG). Important pour 


inactif.) 






Bactéries (Weigert, Ehr- 
lich), voyez n* 168. 



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DES COULEURS DE LÀ HOUILLE 



117 



SUBSTANCE 


SOLUBILITÉ 


COULEUR 


OBSERVATIONS 


GROUPE DES ANILINES 








Dahlia (Primula. — 
«VioletsdeHofmano»). 


Eau et alcool. 


Violet-bleu. 


Dahlia, nuance bleue, 
Primula, nuance rose; 
utile. Spécifique pour 
cellules plasmatiques 
(Mastzellen)-(EHRLiCH). 
Colorant nucléaire : 
voyez n' 169. 


Bleu Victoria. 


Eau et alcool. 


Bleu. 


Colorant nucléaire im- 
portant. Spécifique pour 
fibres élastiques, n» 170. 


VertdMode. 


Eau et alcool. 


Vert. 


Bon colorant histolo- 
gique, résistant à Tal- 
cool, mais ne se fabrique 
plus, et n'est plus em- 
ployé en histologie. 


Vert de méthyle 
(ou Vert Lumière), Li- 
chtgrûn, Grùnpulver, 
Vert de Méthylaniline. 
Le synonyme de « vert 
lumière » se doit plu- 
tôt rapporter au vert 
d'Iode (Benedikt), et 
pour le Lichtgrûn , 
voyez à la subdivision 
suivante (5). 

5 

Bleus de Rosaniline. 


Eau et alcool. 


Vert. 


Réactif le plus électif 
pour les noyaux des 
tissus frais. Très impor- 
tant. N» 174. 








Bleu de Lyon (Bleu 
de Nuit, Grûnstichbiau, 
Bleu opal). 


Alcool. 


Bleu. 


Colorant n'affectant 
pas les noyaux, n"" 200. 


Bleu de toluidine 
(Bleu de Parme, Licht- 
blau. Bleu alcool, Bleu 
gentiane). 


Eau et alcool. 


Bleu. 


Ces marques sont des 
mélanges de dérivés de 
la rosaniline plus ou 
moins « substitués ». 
Voyez n- 172 (bleu de 
toluidine) et 200. 


Bleus de triphényl-ro- 
saniline (Bleu de mé- 
thyle, bleu coton, Was- 
serblau, waterblue). 
Bleu de Chine, bleu 
soluble. 


Eau. 


Bleu. 


Le Wasserblau est un 
colorant plasmatique 
d'une certaine impor- 
tance, n« 201. 


Vert malachite (Vert 
diamant, Solid green, 
Victoria green , New 
green^ Benzol green, 
Benzoyl green, Fast 
green). 


Eau. 


VerU 


NM97. 



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118 



CHAPITRE IX 



SUBSTANCE 



GROUPE DES ANILINES 

LichtgrûnF.S.,Light 
green S ou S. F., Acid 
green S. 0. F., Acid 
green. 



6 

Brun Bismarck ( Vé- 
suvine, Manchester- 
brown, La Phénicienne, 
Phenylenbraun, Brun 
dephénylène.Brun d'a- 
niline. Cannelle, la Phé- 
nicienne). 



SOLUBILITÉ 



Eau et alcool. 



Eau et alcool 



COULEUR 



Vert. 



Echtgelb, Saûregelb 
(jaune solide, jaune 
acide). 

Orange III, Gold- 
orange. 



Acide picrique. 



Dinilroso-resorcine 
(Echtgrun ; Vert solide, 
Vert d'Alsace, Dark- 
green,Resorcin«green). 

8 
Tropeeoline (Chry- 
séoline). 

Tropœoline 000 n* 1 
(Orange 1). 



Tropœoline 000 n»2 
(Orange 2, Betanaphlol 
orange). 



Eau. 



Eau. 



Eau et alcool. 



Eau (peu) et 
alcool. 



Eau 
bouillante. 

Eau. 



Eau. 



Brun. 



OBSERVATIONS 



Jaune. 
Jaune. 
Jaune. 
Vert. 

Rouge-jaune, 
Rouge. 

Rouge-jaune. 



Colorant plasmatique 
important. Sel sodique 
de l'acide diethyldiben- 
zyldi-amidotriphénylcar- 
binoltrisulfonique,et ne 
pas à confondre avec le 
vert malachite, ni avec 
le vert de méthyle. N«' 
174, 196. 

Colorant assez électif 
pour les noyaux; assez 
stable. Très utile suc- 
tout pour les tissus frais. 
Le brun Bismarck est 
le chlorhydrate de tria- 
midoazobenzine ; mais 
toutes les marques du 
commerce sont des mé- 
langes de ce sel avecd'au- 
tres produits, lesquels 
sont pour la plupart in- 
solubles. N» 172, 178. 

N« 194. 



N» 194. 



Une des plus utiles des 
teintures des substances 
intercellulaires, K* 195. 

Colorant plasmatique. 
N» 197. 



Différencie bien les tis- 
sus.. Résiste à l'alcool. 

Colorant très électif 
pour noyaux, pour tis- 
sus frais ou durcis. Ré- 
siste à l'alcool. M» 194. 

Coloration comme la 
précédente, mais ne ré- 
sistant pas à l'alcool. 
Parait devoir être utile 
pour le procédé régres- 
sif. N» 172. 



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DES COULEURS DE LÀ HOUILLE 



119 



SUBSTANCE 



GROUPE DES ANILINES 

Orange G. (Sel de 
sodium de l'acide ani- 
iinazo B.,Naphtol-disui- 
fonique). Fabrication 
de Meister, Lucius et 
Brûning ù Hôchst-u- 
M., et de l'Actienge- 
sellschaft f. Aniline fa- 
brication à Berlin. Se 
trouve chez Grûbler. 



Ecarlale impérial, 
Nouveau rouge (Bie- 
bricher Scharlach). 

Roccelline (« Echt- 
roth, » Kubidine, Or- 
seilline n" 3, Rauva- 
rienne). 

Croséine. 



Xylidinponceau (Pon- 
ceau R.) 



Ponceau RR. (Isomère 
de Tëcarlate impérial). 



Bordeaux R. 



Bordeaux G. 
Rouge Congo. 



Benzopurpurine,Ben- 
zopurpurine B., Delta- 
purpurine. 

Benzoazurnie. 



SOLUBILITÉ 



Eau. 



Eau. 



Eau et alcool. 



Eau. 



Eau. 



Eau. 



Eau. 



Eau chaude. 

Eau. 

Eau. 

Eau. 



COULEUR 



Orange. 



Rouge 
écarlate. 



Rouge 

Ecarlate. 

Rouge. 
Rouge. 

Rouge. 



Rouge. 
Rouge. 
Rouge. 

Bleu. 



OBSERVATIONS 



La solution aqueuse 
possède une réaction 
acide. Couleur impor- 
tante. Colorant de la 
chromatine par régres- 
sion, mais surtout em- 
ployé dans les « colora- 
tions combinées •. Voir 
à ce chapitre, les mé- 
thodes de Plemming et 
de Ehriich-Biondi. 



DifTus. Résiste à 
cool. No 194. 



'al- 



Bon colorant régressif, 
surtout pour tissu os- 
seux. N"" 172. 



Très utile, pour objets 
alcooliques ou chromi- 

3 ues,surtout tissus glan- 
ulaires et conjonctifs. 

Ne colore pas les objets 
chromiques; ne résiste 
pas à l'alcool. 

Plus électif que le pré- 
cédent; résiste à Talcool; 
ne colore pas les objets 
chromiques. N* 194. 

Colorant électif pour 
noyaux, surtout utile 
pour tissus glandulaires 
et conjonctifs, par voie 
progressive. Colore les 
objets chromiques; ré- 
siste à ralcooi. W 194. 

Mêmes réactions que 
le précédent. N» 194. 



Colorant « vital 
nerveux. N» 190. 



et 



Pour ces trois couleurs 
voir n* 191. 



Colorant surtout nu- 
cléaire, progressif ou ré- 
gressif. W 172. 



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420 



CHAPITRE IX 



SUBSTANCE 


SOLUBILITÉ 


COULEUR 


OBSERVATIONS 


GROUPE DES ANILINES 
9 

Les Éosines. 

Eosine soluble à l'eau 
(Primerose soluble). 








Eau et alcool 
dil. 


Rouge. 


Ce sont d'énergiques 
colorants diffus. 

Utiles surtout pour les 
colorations combinées. 


Eosine soluble à Tal- 
cool(Eosinealcoolique), 
Rose Benjçale, Erythro- 
sine, Pyrosine, Phlo- 
xine, Safrosine, etc. 


Alcool. 


Rouge. 


N"^ 193. 


10 








Aurine, Benzaurine, 
Coralline jaune, Coral- 
line rouge, Pœonine. 






Toutes inutiles. 


il 
Bleu de quinoléine 
(Cyanine, Chinolin- 
blau). 


Alcool. 


Bleu. 


Colorant spécifique 
des graisses. Colorant 
des Infusoires intra vi- 
tam. Voyez n« 198. 


GROUPE DES COULEURS DE 
NAPHTALINE 








1 

Rose de naphta- 
line. (Rosa-naphihyla- 
mine, Rouge de naphta- 
line, Magdala). Cette 
couleurpeut également 
être classée près de la 
safranine. 


Eau chaude 
et alcool. 


Rouge. 


L'un des meilleurs des 
colorants des noyaux 
par voie régressive. 
(Flemming). No 172. 



160. Classification cy tologique des couleurs. — On rencontre fré- 
quemment dans la littérature une classification histologique (ou mieux, 
cytologique) des couleurs de la houille, due à Ehrlich ( Verh, d. BerL phys, 
Gesellsch.^ 16 mai 1879 ; — dans Reichert u, du Bois-Reymond's Arch. f. 
Anat, w. Phys,, Phys. Abth., 1879, p. 571). 

D'après Ehrlich, les c couleurs basiques », ou couleurs dans lesquelles la 
substance colorante joue le rôle de base combinée avec un acide incolore, 
possèdent en général une tendance à se localiser d'elles-mêmes et directe- 
ment dans les noyaux ; — tandis que les c couleurs acides », ou couleurs 
dans lesquelles la substance colorante proprement dite joue le rôle d'un 
acide dans la combinaison, colorent d'une manière difTuse, ou -se localisent 
principalement dans le cytoplasma et les substances intercellulaires. (Pour 
un exemple de cette distinction en couleurs basiques et acides, voyez Fuch- 
sine Acide, no 189.) 

'A ces deux groupes principaux on peut ajouter un petit groi%^ de cou- 



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DES COULEURS DE LA HOUILLE 121 

leurs neutres. Bien peu des couleurs du commerce possèdent la constitution 
chimique qui les placerait dans ce dernier groupe ; Ehrlich admet qu'il s'en 
forme lorsqu'on mélange les solutions d'une couleur basique et d'une cou- 
leur acide. Ces corps neutres seraient insolubles dans l'eau pure, et se pré- 
cipitent lorsqu'on fait le mélange, mais se dissolvent si l'on ajoute un excès 
de la couleur acide. Ils auraient des affmités spéciales pour certaines 
enclaves cellulaires, 

Nous aurions donc ainsi trois groupes de couleurs, qui seraient définis 
en même temps par leur constitution chimique et par leurs afflnités cyto- 
logiques : 

Nous aurions les couleurs basiques (dans le sens ci-dessus donné à ce 
mot, ce qui n'implique nullement une réaction alcaline de la solution du 
corps en question), qui seraient des colorants de la chromatine, ou des 
colorants nucléaires ; — les couleurs acides, qui seraient des colorants plas- 
matiques ; puis les couleurs neutres, qui seraient des colorants spécifiques 
pour certains éléments des cellules. Mais il semble que la généralisation 
d'Ehrlich, sans doute fort exacte au point de vue théorique, ne se laisse 
pas appliquer sans beaucoup de restrictions aux réalités de la technique. 
Nous avons à tenir compte dans la pratique non seulement des affinités de 
la couleur pour tel ou tel élément comme elles se révèlent à la teinture 
progressive; il nous faut aussi tenir compte de la résistance de la couleur 
aux liquides de lavage et de déshydratation et éclaircissement, en un mot, 
de sa manière de se comporter à la teinture régressive. Et cela est ici par- 
ticulièrement important parce que, en effet, l'emploi principal des couleurs 
de la houille se trouve dans la coloration par voie régressive de coupes des- 
tinées à être déshydratées par l'alcool et montées au baume. Or les expé- 
riences d'Ehrlich ne tiennent pas compte de ces conditions. Elles ont été 
faites avec des cellules isolées, étalées en couche mince sur des verres à 
couvrir, et sans emploi d'alcool pour la déshydratation. Il en résulte que 
ses catégories, couleurs basiques, couleurs acides, ne correspondent pas 
exactement aux catégories techniques de colorants nucléaires, colorants 
plasmatiques. 

Par exemple, l'Orange est une couleur acide. Mais cela n'empêche pas 
que, employée en teinture régressive, elle ne se montre comme colorant 
nucléaire donnant une coloration très précise de la chromatine et des 
nucléoles plasmatiques. La Fuchsine acide, ou Sâurefuchsine, est une cou- 
leur très acide. Elle se montre en général comme colorant plasmatique très 
franc; mais quelquefois à la teinture régressive (il est vrai que ce n'est 
que rarement et dans des conditions qu'on ne peut pas préciser) elle donne 
de vigoureuses colorations nucléaires. La Safranine est une couleur basique; 
mais par l'emploi dé mordants appropriés on peut en faire un colorant 
plasmatique. Il y a même bien des marques de Safranine qui ne fournissent 
jamais, même sans mordançage, des colorations n'intéressant pas le plasma 
au point de les rendre inutiles comme colorations nucléaires. Le Bleu de 
méthylène est une couleur basique. Mais on sait qu'employé d'après la 
méthode d'Ehrlich pour les soi-disant colorations vitales de nerfs ou 
d'autres tissus, ce qu'il fournit c'est surtout une coloration plasmatique, 
la coloration des noyaux qui s'y présente quelquefois n'étant qu'un épiphé- 
nomène accidentel. La Nigrosine est une couleur acide d'après Ehrlich. 
Employée en teinture régressive elle m'a donné des colorations nucléaires 



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122. CHAPITRE IX 

de toute beauté, le cytoplasme ne retenant pour ainsi dire qu'une trace de 
couleur. D'après Griesbach, le Bordeaux, également une couleur acide, est 
un colorant nucléaire. Il ne serait pas difficile de donner encore plusieurs 
exemples de ce genre. 

Il semble donc que la généralisation d'ËiiRLic H, quelque importante qu'elle 
soit au point de vue de la théorie cytologique, ne suffit pas à fournir une 
classification des couleurs de la houille au point de vue de la technique his- 
toiogique. Nous nous en tiendrons à notre classification usuelle en colorants 
nucléaires et plasmatigues et nous distribuerons nos couleurs dans ces 
cadres d'après des considérations simplement empiriques. 

161. La méthode régnc'essive de coloration ou méthode de 
Flemming*. — Bien peu des couleurs de la houille donnent de 
bonnes colorations nucléaires par voie progressive (n® 98). Il y en a 
deux, le vert de méthyle et le brun Bismarck, qui sont des colorants 
nucléaires directs de première importance. L'une de ces couleurs est 
d'une importance toute spéciale, ce qui fait que nous ne craignons 
pas de nous répéter en la signalant à l'attention du lecteur à plusieurs 
reprises ; c'est le vert de méthyle. C'est un colorant instantané, et le 
réactif le plus précis de la < chromatine » qui soit connu. Les solu- 
tions de cette substance devraient certainement se trouver sur toutes 
les tables de laboratoire. Après le vert de méthyle, nous avons à 
signaler le brun Bismarck ; c'est un bon colorant des noyaux par la 
voie directe, et très stable. Il y en a d'autres qui peuvent fournir 
ùes colorations plus ou moins électives pour les noyaux par la voie 
directe, mais les deux couleurs que nous venons de nommer sont 
sans contredit les plus importantes. 

Nous réservons pour la fin de ce chapitre la considération de ces 
colorants directs, et nous passons tout de suite à l'exposition de Isl 
manière d'employer les couleurs, tout aussi importantes, qui ne se 
laissent utiliser que par la voie régressive (n® 95). C'est cette 
méthode que nous allons maintenant exposer en détail. 

162. Coloration. — Des coupes seulementy ou des portions de tissu 
assez minces pour se comporter comme des coupes, des membranes 
par exemple, peuvent être traitées par cette méthode. 

Les solutions jolorantes 3e font avec l'alcool, l'eau ou une solution 
d'huile d'aniline dans l'eau (voyez plus bas, Safranine et Gentiane), 
selon les diverses solubilités des couleurs employées. Il n'y a pas en 

1 Le principe de cette méthode est due à Uerhann et Boettcuer; mais elle est 
universellement connue sous le nom de Fleuming, à qui revient le mérite d'en 
avoir amélioré et réglé la pratique en des points essentiels.. Pour nous conformer 
à la tradition usuelle nous lui conservons le titre.de « Méthode de Flemming ». 



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DES COULEURS DE LA HOUILLE 123 

général de motif spécial pour employer l'alcool si Teau peut suffire ; 
le point essentiel est d'obtenir une solution très forte. L'alcool à 
50 p. 100 est très souvent employé. Les coupes doivent être très 
fortement colorées dans la teinture. En règle générale on ne saurait 
les y laisser trop longtemps ; car plus elles sont fortement colorées et 
mieux elles résistent à la décoloration, ce qui est un avantage. Avec 
les puissantes teintures obtenues au moyen de l'huile d'aniline, il suffit 
souvent d'un bain de quelques minutes ou une demi-heure, mais il 
est souvent bon d'y laisser les coupes de douze à vingt-quatre heures 
ou plus. Les objets préparés dans le mélange de Flemming ou dans celui 
de Herm ANN sont ceux qui donnent les plus beau^ résultats ; mais le 
matériel au sublimé, etc., peut être employé. Pour les recherches sur 
les noyaux il vaut mieux n'employer les teintures anilinées qu'avec du 
matériel bien fixé dans un liquide chromo-osmique ; car l'huile d'ani- 
line est une base assez énergique pour altérer la chromatine si celle-ci 
n'a pas été parfaitement bien fixée. 

Avant de procéder à la décoloration il est toujours bon de rincer 
les coupes dans l'eau, quelquefois même de les y bien laver, cela 
aide à fixer la couleur. Pour les procédés de mordançage, voyez aux 
n<« 96 bis, 171 bis, 171 ter. 

163. Décoloration. — Les coupes traitées comme ci-dessus se 
trouvent être surcolorées, c'est-à-dire colorées d'une manière à la 
fois excessive et diffuse. Il s'agit maintenant de produire l'élection 
voulue par la différenciation de cette coloration diffuse ; il faut les 
décolorer jusqu'à un certain point. 

La décoloration se fait le plus souvent par le lavage à l'alcool, 
tantôt pur, tantôt acidifié par l'acide chlorhydrique.Si les coupes sont 
isolées (coupes à la celloïdine), on les porte dans un verre de montre 
d'alcool. Si elles sont montées en série sur porte-objets, on met le tout 
dans un tube d'alcool. Il est possible de différencier simplement en 
versant l'alcool sur le porte-objets ; mais il vaut en général mieux 
employer un tube ou autre bain. Les coupes isolées dans le verre de 
montre commencent aussitôt à céder leur couleur à l'alcool, sous 
iforme de nuages qui se produisent d*abord très rapidement mais 
après un temps plus lentement. Les coupes sur porte-objets rendent 
leur couleur sous forme de rivières coulant le long du verre, ce que 
l'on constate plus facilement si de temps à autre on soulève la lame 
pour un instant au-dessus du niveau de l'alcool. Après quelque temps 
on constate que la formation des nuages ou des rivières de couleur 
parait être sur le point de cesser ; les coupes sont maintenant devè- 



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424 ' CHAPITRE IX 

nues pâles et un peu transparentes y et, dans le cas de tissus fixés aux 
liquides chronio-osmiques, ont pris un autre ton de couleur, ce qui 
estdû à ce que le fond général du tissu, teinté par le liquide fixateur, 
reparaît aux endroits d'où la couleur d'aniline a été enlevée. Par 
exemple, des tissus préparés au liquide de Flemming et colorés à la 
safranine passent d'un rouge opaque à un violet délicat. A ce moment 
la difl'érenciation est complète et doit être arrêtée instantanément^ 
ce qui se fait de la manière que nous disons au paragraphe suivant. 

On recommande en général de prendre, pour la décoloration, de 
l'alcool absolu. Il n'y a pas de mal à cela, mais très souvent l'alcool 
à 95 p. 100 suffira. 

Il sera en général bon de n'employer la décoloration par l'alcool 
à l'acide chlorhydrique (1 p. 1000 environ) qu'avec des tissus très 
bien fixés dans un mélange chromo-osmique ou un liquide semblable ; 
car cet acide peut très bien produire des gonfiements dans les tissus 
imparfaitement fixés. Il faut observer aussi que l'acide extrait la 
couleur plus rapidement des noyaux au repos que de ceux qui sont 
en kinèse, ce qui est un avantage ou non selon le but que l'on a en 
vue. En thèse générale, on peut dire que le lavage doit se faire à 
l'alcool pur toutes les fois que l'on désire avoir les noyaux au repos 
colorés en même temps que ceux qui sont en kinèse ; les autres pro- 
cédés de lavage servant surtout à différencier les kinèses. 

Quant à la durée des lavages, elle varie beaucoup selon la nature 
des tissus et les détails du procédé que l'on met en œuvre ; peut-être 
pourrait-on dire qu'elle ne saurait être de moins de 30 secondes, et 
que le plus souvent elle n'est pas plus de deux minutes. 

Un procédé très intéressant est celui de la décoloration par une deuxième 
teinture à couleur d'aniline. Par ce procédé la deuxième couleur se subs- 
titue à la première dans le fond général des tissus, laissant les noyaux 
colorés par la première teinture, ce qui produit une coloration double. 
Ainsi le bleu de méthylène et le violet de gentiane peuvent être enlevés des 
portions plasmatiques par une solution aqueuse de vésuvine ou d'éosine ; la 
fuchsine peut être enlevée des portions plasmatiques par une solution 
aqueuse de bleu de méthylène, tout en laissant les noyaux en possession de 
la première couleur. Flemming a obtenu des résultats importants en diffé- 
renciant des coupes colorées au violet de gentiane dans une solution aqueuse 
d'orange (voyez pour tous ces procédés au chapitre des colorations com- 
binées), Flemming paraît attribuer cette réaction à la nature acide de 
Torange. C'est possible ; Torange est une couleur acide dans le sens chi- 
mique, et sa solution dans Teau a une réaction acide. Je ne puis pas dire 
jusqu'à quel point la nature acide des couleurs dans le sens chimique leur 
peut prêter une action décolorante sur les couleurs basiques ou moins 
acides. Il est certain, en tout cas, que les couleurs basiques peuvent servir 



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DES COULEURS DE LA HOUILLE 125 

de décolorants ; nous en avons donné deux exemples tout à l'heure : — la 
yésuvine et le bleu de méthylène sont tous les deux des couleurs basiques. 

Des procédés comme ceux de Resegotti {colorations combinées) ei de Benda 
(Safranine suivie de Lichtgrûn) n'entrent pas en ligne de compte ici parce 
que dans ces procédés la deuxième couleur est employée en solution alcoo- 
lique^ de sorte que l'action décolorante peut être attribuée, en partie du 
moins, à la menstrue. 

Dans plus d'un des procédés de différenciation qui seront décrits plus 
loin, un traitement par l'acide chromique ou par l'iode intervient. Je pense 
que ces corps agissent en mordançant la chromatine, ce qui lui permettrait 
de retenir avec plus d'énergie la couleur qu'elle aurait absorbée à la tein- 
ture. Nous savons d'un côté que l'acide chromique précipite la safranine de 
ses solutions; de sorte que si nous admettons d'un autre côté que la chro- 
matine ait une affinité spéciale pour cet acide (surtout la chromatine à 
l'état kinétique) l'explication serait complète. Comparez aussi ce que nous 
avons dît au n<^ 162 bis, 

164. Éclaircissement. — La différenciatioii étant complète, la 
décoloration doit être arrêtée immédiatement, comme nous l'avons 
dit. Il suffit pour cela de mettre les coupes dans de Teau ; mais la 
pratique usuelle est d'éclaircir et monter tout de suite. 

On peut éclaircir par l'essence de girofle, qui enlèvera encore de la 
couleur aux tissus. Ou bien on peut employer un éclaircissant qui 
soit sans action sur la couleur (essence de cèdre, de bergamote, xylol, 
loluol, et d'autres, voyez au chapitre Agents éclaircissants). Si Ton a 
décoloré à Talcool pur, il est souvent préférable d'employer l'essence 
de girofle, parce que l'alcool pur n'enlève pas toujours parfaitement 
la couleur aux portions plasmatiques, surtout si la coloration a été 
longue. Mais si elle ne l'a pas été, et surtout si l'on a décoloré à 
l'alcool acidifié, l'essence de girofle ne sera pas nécessaire, et du 
moment qu'elle n'est pas nécessaire il vaut mieux ne pas l'employer, 
car elle diminue quelque peu le brillant de la coloration. Cette 
essence a la propriété particulière de décolorer la chromatine des 
noyaux au repos plus rapidement que celle des noyaux en kinèse, 
ce qui fait qu'elle aide à un degré important à la différenciation des 
mitoses. 

Certaines couleurs sont beaucoup plus sensibles à l'action de l'es- 
sence de girofle que d'autres. Il faut aussi tenir compte de la qualité 
de cette essence si fréquemment falsiQée. L'essence fraîche décolore 
plus rapidement que la vieille. 

Des séries de coupes montées sur porte-objets se laissent éclaircir 
commodément en les inondant de l'agent éclaircissant. 

Lorsque l'éclaircissement a été obtenu, on monte au baume ; ou 
bien si l'on ne désire pas monter tout de suite et que l'on ait employé 



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126 CHAPITRE IX 

Pessence de girofle, il faut arrêter la décoloration en transportant les 
coupes dans un milieu qui n'attaque plus la couleur (xylol, essence 
de cèdre, etc.). 

Pour le montage il faut éviter les solutions faites au chloroforme, 
ce corps attaquant souvent la couleur. 

165. Résultats généraux. — Le résultat final dépend beaucoup 
du traitement préalable des tissus. Si vous leur avez fait subir une 
fixation prolongée dans le mélange fort de Flemming, et si vous avez 
décoloré à Talcool acidiQé et éclairci à Tessence de girofle, il ne 
restera en général de coloré que les nucléoles plasmatiques et la 
ehromatine des noyaux en kinëse, la chromatine des noyaux au repos 
s'étant décolorée. Si vous avez donné une fixation plus légère, soit 
avec le mélange faible de Flemming, soit avec un autre fixateur favo- 
rable à la coloration, et que vous ayez décoloré à Talcool pur, la 
chromatine des noyaux au repos demeurera colorée. Si Ton n'a déco- 
loré que fort légèrement, le protoplasma demeurera coloré. 

166. Choix d'une teinture d'aniline. — Dans les coilleurs 
basiques, c'est la safranine et le violet de gentiane qui sont les cou- 
leurs les plus employées, tant sous le rapport de Ténergie et la pré- 
cision de la coloration que sous celui de sa permanence. J'y ajoute 
volontiers le bleu Victoria qui m'a toujours donné d'excellents résul- 
tats sous tous les rapports. On peut prendre l'une ou l'autre de ces 
couleurs selon qu'on désire avoir une coloration rouge ou bleue. La 
safranine sera souvent à préférer s'il ne s'agit que d'une coloration 
èimple. Elle donne aux forts grossissements de bonnes images tant à 
Téclairage du jour qu'à l'éclairage artificiel. Tandis que j'ai toujours 
remarqué que le violet de gentiane (et la plupart des bleus) donnent à 
la lampe des images dichroïques qui ne sont pas favorables à une 
bonne définition. 

Il est une autre considération qui peut influer sur le choix. Quel- 
ques-unes de ces couleurs donnent une coloration mate; il en est 
ainsi pour le violet de gentiane, à tel point que dans les fortes colo- 
rations les chromosomes et nucléoles plasmatiques paraissent parfai- 
tement opaques. Gela est favorable à la définition des limites de ces 
éléments, mais défavorable à la transparence des préparations ; de 
telles colorations ne sont à préférer que pour des coupes très minces. 
La safranine, le vert d'aniline, l'orange et quelques autres couleurs 
donnent une coloration transparente de ces éléments. C'est certaine- 
ment un avantage pour des coupes tant soit peu épaisses ; mais cette 



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DES COULEURS DE LA HOUILLE 127 

transparence n*est pas favorable à la bonne déQnition d'objets dif- 
ficiles, car elle donne lieu à la formation de lignes de diffraction. La 
coloration de la safranine n'est cependant pas d'une transparence 
excessive, et donne de bons résultats sous ce rapport. 

S'agit- il de faire des colorations doubles, les bleus seront souvent à 
préférer comme colorants nucléaires. Car il y a plusieurs rouges qui 
sont de bons colorants plasmatiques, mais dans les bleus, pour autant 
que j*aie pu le constater, il n'y en a que peu ou point de satisfaisants. 
Après un bleu (ou plutôt avant) vous pouvez employer la fuchsine 
acide, le Congo, l'éosine, etc. Tandis qu'après la safranine je ne con- 
nais guère que le Kernschwarz que je puisse recommander comme 
colorant plasmatique. 



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CHAPITRE X 
SAFRANINE ET AUTRES COLORANTS NUCLÉAIRES 

A. — Colorants régressifs 

167. Saft*aiiine. — Colorant de premier ordre, éneigique, 
brillant, très électif, parfaitement permanent dans le baume. 

La condition première de la réussite dans les teintures à la safra- 
nine est de posséder une bonne marque de safranine. Nous insistons 
ici de nouveau sur ce que nous avons dit au numéro 99 ; — avant de se 
mettre à travailler avec ce réactif il convient de s'adresser à Grûbler 
ou un autre des fournisseurs que nous avons cités et commander une 
provision de la couleur en spécifiant l'emploi pour lequel elle doit 
servir, si c'est pour la coloration nucléaire en général, ou si c'est pour 
des colorations spécifiques de fibres élastiques ou pour autre emploi. 

11 y a dans le commerce au moins une vingtaine de marques de 
safranine, qui diffèrent à un degré important sous les rapports de la 
couleur, du poids, de la solubilité et surtout sous le rapport des colo- 
raticms qu'elles fournissent. Les unes sont facilement solubles dans 
l'eau, mais pas dans l'alcool; pour d'autres c'est le contraire; quel- 
ques-unes sont facilement solubles dans les deux menstrues. Resegotti 
[Zeit, f. wiss. AJik.^ V, 3, 1888, p. 320) en a étudié quatorze marques. 
Celle dont je me sers depuis longtemps et qui donne de bons résul- 
tats est la c Safranine » de Grubler. Il faut se rappeler que, 
comme les procédés de fabrication changent continuellement, les 
résultats ne seront nullement toujours identiques. 

Coloration. 

Bon nombre de safranines ne sont pas suffisamment solubles dans 
l'eau, ce qui oblige à l'emploi d'autres menstrues. 



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SAFRANINE ET AUTRES COLORANTS NUCLÉAIRES 129 

La solution de Phtzner {Morph. Jahrb., VI, p. 478, et VII, p. 291) 
se compose de 1 partie de safranine, 100 d'alcool absolu et 200 d'eau, 
cette dernière n'étant ajoutée qu'au bout de quelques jours. 

La solution de Flkmmuïg {Arch, f. mik. Anal., XIX, 1881, p. 317) 
consiste en une solution concentrée dans l'alcool absolu, allongée de 
moitié d'eau. '^^ 

Les solutions de Babes [op. cit., 1883, p. 356) sont (A) un mélange 
à parties égales d'une solution concentrée dans l'alcool et d'une solu- f| 

tîon concentrée dans Teau (j*ai trouvé cela excellent), puis (B) une 
solution aqueuse sursaturée faite à l'aide de la chaleur. 

La solution anilinée de Babes (Zeit. f, wiss. Mik,, IV, 4, 1887, 
p. 470) consiste en 100 parties d'eau, 2 parties d'huile d'aniline et un 
excès de safranine. Babes chauffe le mélange à 60 ou 80« C. et 
Qltre à travers un filtre humide. Cette solution pourra être conservée 
pendant un mois ou deux. 

La^olution de Zwaardemaeer {op. cit. y IV, 2, 1887, p, 212) est un 
mélange à parties égales de solution alcoolique de safranine et d'eau 
anilinée. L'eau anilinée se fait en agitant un peu d'huile d'aniline 
avec de l'eau qu'on filtre ensuite. Je me trouve très bien de cette 
solution. 

On admet que l'aniline dans ces liquides sert de mordant et permet 
de raccourcir notablement la durée de la teinture. 

On peut employer n'importe laquelle de ces teintures avec n'im- 
porte lequel des procédés de décoloration qui vont suivre. Nous 
rappelons ce qui a été dit au sujet de l'emploi de l'huile d'aniline au 
numéro 162. 

Décoloration et Eclaircissement. 

Pour les règles générales à ce sujet voyez ci-dessus, n^ 163, 164. 

Méthode de Flemming (Première Méthode). Alcool pur (c extraction 
neutre »), suivi d'essence de girofle. Les noyaux au repos sont colorés 
en même temps que les noyaux en kinèse. 

Méthodede Flemming (DeuxièmeMéthode, « Extraction acide ») [Zeit.f, 
wiss. Mik.^ I, 3, 1884, p. 350). Décolorer, jusqu'à ce que les coupes 
ne cèdent presque plus de couleur, dans de l'alcool contenant 
0,5 p. 100 d'acide chlorhydrique, achever la déshydratation dans l'al- 
cool pur, puis traiter par l'essence de girofle. (On peut si on le préfère 
employer l'acide en solution dans l'eau.) La proportion d'acide indi- 
quée paraît plus forte qu'il ne serait nécessaire, et en conséquence j'ai 
presque toujours employé une dose ne dépassant pas 0,2 p. 100; 

ANAT. MICROSC. 9 



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130 CHAPITRE X 

et plus récemment, suivant un travail plus récent de Flemming {Arch. 
f, mik. Anal., XXXVII, 1891, p. 249), j'ai obtenu de bons résultats 
en employant une dose de 1 p. 1000 ou moins. Cette méthode suppose 
un matériel bien fixé dans le mélange fort de Flemming, et coloré 
pendant au moins plusieurs heures. Podwyssozki cependant [Zeit. f. 
toiss. Mik.^ III, 3, 1886, p. 40o) dit avoir réussi avec des colorations 
de seulement une demi-heure de durée. Cette méthode ne laisse de 
coloré que la chromatine en kinèse et les nucléoles plasmatiques. 

La méthode à V orange de Flemming sera décrite dans le chapitre des 
Colorations combinées. 

Une deuxième méthode de Podwyssozki {loc. cit,) consiste à déco- 
lorer (quelques secondes à deux minutes) dans une forte solution 
alcoolique d'acide picrique suivie d'alcool pur. Mêmes résultats, si ce 
n'est qu'on obtient une coloration brunâtre au lieu de rouge. Voyez 
plus bas les observations d'OnLMACUER au sujet de l'emploi de l'acide 
picrique. 

Babes recommande pour les coupes colorées dans sa solution anili- 
née un traitement par l'iode d'après la méthode de Gram que nous 
décrirons au paragraphe du Violet de gentiane (n® 168). Ce procédé a 
aussi été recommandé par Prenant [Int, Monatsschr, f. Anat,^ etc., 
IV, 1887, p. 368) qui fait observer qu'en ce cas le traitement par 
riode doit être un peu plus long que pour les préparations au violet 
de gentiane, et le traitement par l'alcool un peu moins long. Mais 
voyez aussi Ohlmacher, ci-dessous. 

Martinotti et Resegotti {Zett. /*. wiss, MiL, IV, 3, 1887, p. 328) recom- 
mandent de décolorer dans un mélange fraîchement préparé d'une partie 
de solution aqueuse d'acide chromique à 1 p. 1000 avec 9 parties d'alcool 
absolu, avec traitement subséquent par Talcool pur et Tessence de berga- 
motte. D'après mon expérience les résultats que donne cette méthode ne 
sont pas meilleurs, je pense même moins bons, que ceux que donne la déco- 
loration dans Tacide chromique simple suivi d'alcool, d'après Bizzozero 
(voyez au paragraphe suivant). 

Ce procédé de Bizzozero est certainement excellent. Garbini {op, cit,, V, 2, 
1888, p. 170) a conseillé de déshydrater d'abord dans de l'alcool mélhylique 
(esprit de bois), qui ne dissout que fort peu la safranine, puis de décolorer 
dans un mélange de deux parties d'essence de girofle avec une partie 
d'essence de cèdre. Cette méthode ne m'a pas donné de bons résultais. 

Il nous reste à dire deux mots sur la différenciation à l'iode ou à l'acide 
picrique. Il a été démontré par Ohlmacuer (Joum. Amei\ Med. Ass,, XX, 
n^ 5, Feb. 4, 1893, p. 111) que si des tissus colorés à la safranine sont 
traités ensuite par des solutions qui contiennent de l'iode ou de l'acide 
picrique, il s'y forme un précipité d'une substance d'un rouge foncé, de 
nature cristalline mais revêtant des formes lancéolées, semi-lunaires, falci- 
formes ou navicellaires. Ce précipité se forme tant dans les tissus normaux 



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SÂFRANINE ET AUTRES COLORANTS NUCLÉAIRES 131 

que daas les tissus palhologiques, et tant dans les noyaux que dans le 
cytoplasme. Il se forme très facilement dans les tissus carcinomateux ; et 
Ohlmacher a conclu que bien des corps qui ont été décrits comme < Cocci- 
dies, Sporozoaires », ou autres « parasites » des carcinomes ne sont pas 
autre chose que des éléments de ce précipité. Cette critique a trait, entre 
autres, aux travaux de Podwyssozki et de Sawtsciienko. Si les suppositions 
d'OuLMACUER se vérifient, il sera nécessaire d'admettre avec lui que remploi 
de solutions contenant de l'iode ou de Tacide picrique après la safranine 
est fort sujet à cautions (voyez aussi un travail plus récent du même auteur, 
op. cit., June 30, 1894). 

Dans des tissus fixés au liquide de Flemming, la safranine colore, 
outre les noyaux, les fibres élastiques, les corps cellulaires de cer- 
tains épithéliums cornés, et le contenu de certaines cellules glandu- 
laires (la mucine entre autres). 

Les solutions aqueuses acidulées par Tacide acétique donnent des colora- 
lions nucléaires progressives assez bonnes sur des tissus frais. 

168. Violet de Gentiane. — Egalement une des plus importantes 
des couleurs d'aniline. C'est un colorant tout aussi précis que la safra- 
nine et encore plus énergique. On peut colorer dans une solution aqueuse 
simple, ou dans une solution alcoolique concentrée allongée de moitié 
d'eau (Flemming, Zellsubst,, etc., p. 384). On peut décolorer soit à 
l'alcool pur, soit (Flemming, Zeit. f. wiss. Mik.^ I, 1884, p. 350) à 
l'alcool acidifié, comme nous l'avons dit ci-dessus pour la safranine. 
11 y a encore une méthode excellente en ses résultats, et très com- 
mode, due à BizzozERO (Z5i7. f, wiss, Mik., III, 1886, p. 24). — Les 
tissus sont fixés et durcis soit par l'alcool absolu, soit par l'acide 
chromique ou les mélanges chromiques de Flemming suivis d'un 
lavage à l'eau prolongé. Les coupes sont mises pendant cinq à dix 
minutes (ou plus longtemps) dans le liquide d'ËHRLiCH (violet de gen- 
tiane, 1; alcool, 15; aniline, 3; eau, 80), puis lavées rapidement 
dans l'alcool absolu, et portées dans une solution d'acide chromique 
à 1 p. 1000. On les y laisse pendant trente à quarante secondes, puis 
on les met, pendant trente à quarante secondes, dans de l'alcool 
absolu propre, où elles se décolorent en partie. Puis, pour mieux fixer . 
la couleur sur les figures nucléaires, on remet de nouveau les coupes 
pendant trente secondes dans la solution chromique et ensuite dans 
Talcool absolu. Au bout de trente à quarante secondes, on les met 
dans quelques gouttes d'essence de girofle, où elles perdent encore 
de leur couleur ; on enlève l'essence et on la remplace par de l'es- 
sence propre, puis on monte dans la résine damar. 



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132 CHAPITRE X 

Dans certains cas, surtout lorsqu'il s*agit de tissus dont les noyaux 
retiennent mal la couleur, on obtient de meilleurs résultats en com- 
binant ce procédé avec celui qui a été indiqué par Gram pour la colo- 
ration de micro-organismes dans les tissus {Fortschr, d. Medicin,^ II, 
1884, n<» 6 ; BriL Med. Journ,, 6 sept. 4884, p. 486 ; Journ. Roy. Mie. 
Soc.^ N. S., IV, 1884, p. 317), c'est-à-dire, en faisant précéder le 
traitement par la solution chromique par l'action d*une solution 
d'iode. La série des opérations est alors la suivante : 5 à 10 minutes 
dans le liquide d'Ëhrlich; lavage pendant 5 secondes à Talcool 
absolu ; 3 minutes dans la solution d*iode (iode, 1 \\ iodure de potas- 
sium, 2 ; eau, 300) ; 20 secondes dans Talcool absolu ; 30 secondes 
dans la solution chromique ; IS secondes dans Talcool absolu ; 
30 secondes dans la solution chromique pour la deuxième fois; 
30 secondes dans Talcool absolu ; deux lavages successifs dans l'es- 
sence de girofle; résine damar. 

La deuxième méthode s'emploie surtout pour les tissus dont les 
noyaux se décolorent facilement (foie, glandes salivaires, reins, pan- 
créas). Dans les préparations bien réussies, le protoplasma cellulaire 
est incolore ; dans les noyaux au repos, les nucléoles seuls sont 
faiblement colorés; les mitoses sont d'un violet intense, presque 
brun. 

NissEN {Arch. f. mik, Anat.^ 1886, p. 338) a modifié cette méthode 
en supprimant le traitement par Tacide chromique. 

Nous avons déjà fait observer que le violet de gentiane donne des colora- 
tions extrêmement énergiques et d'une nature opaque. Il en résulte qu'il 
convient mieux pour des coupes très minces que pour celles qui ne le sont 
pas. La coloration se conserve bien dans le baume ; mais j'engage à laisser 
les préparations le moins possible à la lumière. 

Les solutions aqueuses acidulées par l'acide acétique (à 1 p. 100 par 
exemple) sont des colorants nucléaires progressifs pour le tissu frais. La 
couleur dissoute dans un liquide < indifférent * est une des plus utiles pour 
les soi-disant c colorations vitales ». Pour l'emploi de cette couleur en 
combinaison avec d'autres, voyez au chapitre des Colorations combinées. 

169. Dahlia (Flembong, Arch. f. mik. Anat., XIX, 1881, p. 317). 
— Colorer dans une solution aqueuse, soit neutre, soit acidifiée par 
l'acide acétique, et décolorer à l'alcool pur. La coloration de la chro- 
matine est bonne, mais moins forte qu'avec la gentiane ou la safra- 
nine. Les granulations cytoplasmiques de certaines cellules sont 
nettement colorées. 

Pour les tissus frais^ on peut selon Ehruch [Arch. f. mik. Anal. y 
XIII, 1876, p. 263) employer le dahlia de deux manières. On peut 



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SAPRANINE ET AUTRES COLORANTS NUCLÉAIRES 133 

colorer dans une solution aqueuse neutre qui donne une coloration 
uniforme de tous les éléments, excepté des noyaux ; en traitant alors 
les préparations par Teau acidulée avec de Tacide acétique, la couleur 
se retire des tissus et se localise dans les noyaux. Ou bien on peut 
obtenir la coloration directe des noyaux en employant une solution 
concentrée de dalhia dans de Teaa acidulée avec 7,8 p. 100 d'acide 
acétique. 

Pour la coloration spécifique des cellules à granulations (Plas- 
mazellen) d'EuRLiCH, voyez à la deuxième partie. 

Le dahlia sert très bien pour les colorations « vitales » comme nous 
l'avons dit ci-dessus pour le violet de gentiane. 

170. Bleu Victoria (Lustgarten Med, Jahrb. k. Ges, d. Aerzte 
zu Wien, 1886, p. 285-91). — Colorer dans une solution concentrée 
dans Teau. Le matériel fortement fixé dans le liquide de Flemming 
demandera plusieurs heures, du matériel légèrement fixé seulement 
quelques minutes. Décolorer à Talcool pur (environ une minute). On 
peut éclaircir à Tessence de girofle, mais il vaut en général mieux 
prendre l'essence de cèdre ou de bergamote, car Tessence de girofle 
extrait la couleur très rapidement. La couleur est peu résistante à 
Talcool. J'ai trouvé que la résistance en est beaucoup augmentée si 
l'on mordance les coupes avant coloration en les traitant pendant un 
quart d'heure par la teinture d'iode. La décoloration à l'acide chlor- 
hydrique est absolument à éviter. 

Le bleu Victoria est un colorant nucléaire brillant et précis, et 
après le mordançage par l'iode très facile à contrôler. Il me semble 
qu'il est souvent à préférer au violet de gentiane comme donnant des 
colorations moins opaques. 

Dans ces préparations la mucine est colorée au même titre que la 
chromatine. 

Cette couleur a une affinité spécifique pour les fibres élastiques. 
Pour les difl^érencier il est nécessaire d'employer du matériel fixé dans 
un liquide chromique ou chromo-osmique, et de colorer très long- 
temps. LusTGARTEN recommande à cet effet une solution alcoolique 
allongée de deux à quatre volumes d'eau. 

171. Méthode au Permanganate (Hh^nneguy, Journ. de VAnat. 
etde la PhysioL, XXVII, 1891, p. 397). — Il a été établi par Henneguy 
que le permanganate de potasse agit comme mordant pour plusieurs 
couleurs d'aniline, et permet de réaliser de bonnes colorations dans 
des cas où les procédés ordinaires échouent. 



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iVt CHAPITBE X 

On emploie da matériel Gxé aa liqaide de Flexuccg fort, qu'on ne 
làh^.e ajdr que quelques heures Tdeux à six heures selon les dimen- 
hions de Tobjel^. Les coupes, collées sur porte-objets par Falbumine 
de Mayer, sont traitées pendant cinq minutes par une solution de 
permanganate de potasse à 1 p. iOO. On lave à Teau et Ton passe 
au bain de teinture dans la safranine, rubine, violet de gentiane, 
vésuvine, etc. 

La couleur qui réussit le mieux est la safranine préparée avec de 
l*eau d*aniline et de Talcool absolu. 

Les coupes doivent séjourner dans la solution colorante un temps 
environ moitié moindre que si elles n'avaient pas été au préalable 
traitées par le permanganate. La préparation se termine à la manière 
ordinaire au moyen de l'alcool absolu et de Tessence de girofle. 

La décoloration est la partie la plus délicate de la méthode, aussi 
est-il nécessaire d'en suivre les progrès sous le microscope. Elle 
marche en général assez lentement, et la coloration sera d'autant 
plus élective que la décoloration aura duré plus longtemps. Celle-ci 
continue quelquefois lorsque les coupes sont montées dans le baume, 
surtout s'il reste sous la lamelle des traces d'essence de girofle. Des 
préparations qui, au moment où elles étaient montées dans le baume, 
étaient trop fortement colorées ont présenté souvent, vingt-quatre et 
quarante-huit heures après, une coloration élective parfaite. 

Le protoplasma présente une teinte gris orangé, qui met en relief 
les structures les plus délicates, entre autres les figures achro- 
matiques de la cytodiérèse ; les chromosomes et la membrane des 
noyaux sont vivement colorés en rouge, les sphères attractives et 
leurs corps centraux sont colorés moins fortement, mais tranchent 
nettement sur le reste du protoplasma. 

Si l'on désire accentuer davaatage le détail des structures protoplas- 
miqucs, on peut, avant le trailcment par le permanganate, colorer pendant 
dix minutes par une solution alcoolique d'hématoxyline (alcool à 90 p. 100, 
100 grammes; hématoxyline, 5 centigrammes), laver à l'eau, et diflférencier 
pendant dix minutes dans une solution de bichromate de potasse à 
2 p. tOO. Mais avec du matériel préparé au liquide de Flemroing ce traite- 
ment peut être supprimé sans trop d'inconvénient. 

La méthode au permanganate donne aussi de bons résultats pour les 
piiVes qui ont été fixées par un autre réactif que le liquide de Flemming, 
tel que le sublimé, les hquidcs de Perenyi et de Kleinenberg, l'alcool, etc. 

L'action mordançante du permanganate est tellement énergique que si 
elle se prolonge un peu trop longtemps avant la coloration par la safranine 
et surtout par la rubine, il devient à peu près impossible de décolorer con- 
vonahlemonl les coupos; on nV arrive qu*en les laissant pendant près d'un 
mois dans Tessence de girofle. 



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SAFRANINE ET AUTRES COLORANTS NUCLEAIRES 



135 



171 bis, Mordançage par la Formaline. — Oulmacrer [Médi- 
cal News ^ Feb. 16, 1895) a trouvé que la formaline est un mordant 
énergique pour les couleurs d'aniline, si énergique qu'employée avec 
la safranine elle en fait un colorant plasmatique semblable à Téosine 
(solution saturée de safranine de Grûbler dans de la formaline a 
4 p. 100). On peut employer la formaline soit combinée à la teinture, 
comme dans cet exemple, soit en traitement séparé précédant la 
teinture. H suffît d'un traitement pendant très peu de temps (une 
minute pour des préparations sur verre à couvrir) par une solution 
de formaline de !2 à 4 p. 100 pour mordancer des cellules isolées, 
avant coloration. Pour la combiner à la teinture, il convient en géné- 
ral de faire la solution de la couleur dans de la formaline à 4 p. 100. 
Ainsi, 1 gramme de bleu de méthylène dissous dans 100 ce. de solu- 
tion aqueuse de formaline à 4 p. 100. Il suffit d'y colorer pendant 
une demi- minute, de laver à Talcool absolu, d'éclaircir au xylol et 
de monter au baume, pour avoir une coloration nucléaire très précise 
sans danger d'une décoloration excessive dans l'alcool • On peut 
employer de la même manière la fuchsine, le violet de gentiane et le 
violet de méthyle. Ces trois couleurs peuvent être ajoutées à la for- 
maline sous forme de solution concentrée dans l'alcool. 

Je pense qu'OuLMACUBR entend parler de la formaline pure. J'ai 
trouvé que combinée à l'acide chromique, au chlorure de platine, etc., 
en guise de liquide fixateur, elle n'a pas cet effet : au contraire, le 
matériel se colore fort lentement. 



171 ter. Mordançage au Tannin et Tartre stibié. — Rawitz 
(Sitzb, Ges, Naturf, Freunde Berlin^ 1894, p. 174; Zeit. /*. toiss. 
Mik,^ XI, 4, 1895, p. 503 ; et Leiifaden f. histiologische U7itersih 
chungen, lena, 1895, p. 76) a pu employer la safranine et la fuchsine 
comme colorants plasmatiqices de la manière suivante. Les coupes c/e 
matériel fixé par le mélange de Flemming ou par uu autre mélange 
chromique sont mises pendant vingt-quatre heures dans une solu- 
tion faite à froidy de tannin à 20 p. iOO dans l'eau, puis lavées et 
mises pour deux à trois heures dans une solution de tartre stibié 
à 1 p. 100, ou 2,5 p. 100, maintenue à une température d*environ 
37° C, ou bien pour vingt-quatre heures à la température nor- 
male, puis lavées soigneusement et colorées pendant vingt-quatre 
heures dans la safranine, la fuchsine, le violet de méthyle, le violet 
de gentiane, ou le vert émeraude, puis décolorées selon la manière 
usuelle dans l'alcool, ou bien décolorées par un traitement de deux 
à vingt-quatre heures dans une solution de tannin à 2,5 p. 100. 



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136 



CHAPITRE X 



Ce procédé produit, d'après Ra.witz, une inversion de la colora- 
tion : au lieu de la coloration nucléaire que donnent normalement 
les anilines en question employées sans mordant, on aurait une colo- 
ration purement plasmatique. D'après Rawitz, les centrosomes et 
sphères attractives sont démontrées avec une netteté que cet auteur 
n'a obtenue par aucune autre méthode. Les fuseaux karyokinétiques 
sont colorés, dit-il, mais pas les chromosomes; ceux-ci ont, selon 
lui, une teinte brune qui est à attribuer au tannin ou à Tacide chro- 
mique. 

Du matériel fixé dans d'autres liquides que ceux que nous avons 
indiqués ne donnerait pas, d'après Rawitz, la réaction en question, 
mais donnerait une coloration diffuse. 

J'ai essayé ce procédé plusieurs fois, avec la safranine, avec du 
matériel fixé au mélange de Flemming, et aussi avec du matériel 
fixé au mélange de Hermann, et en pratiquant la décoloration tantôt 
dans l'alcool pur, tantôt dans la solution de tannin. Je n'ai jamais vu 
la moindre trace de 1' t inversion » de coloration décrite par Rawitz. 
J'ai eu au contraire des colorations nucléaires très énergiques, très 
brillantes et très précises. La seule différence essentielle que montrent 
mes préparations d'avec les préparations ordinaires, c'est que, outre 
la coloration de la chromatine, il y a une coloration plasmatique dans 
un autre ton. La chromatine, soit au repos soit en kinèse, est d'un 
rouge vif (excepté dans les couches superficielles, où l'action de 
l'osmium s'est fait trop sentir ; là, elle est d'un ton plus sombre.) Le 
cytoplasme est brunâtre, son élément plaslinien très bien différencié. 
Les fuseaux sont colorés en général d'un gris brunâtre, quelquefois 
d'un rouge assez vif. Les Nebenkerne et les vestiges fusoriaux sont 
brun foncé, très bien démontrés. Je ne puis m'expliquer la différence 
entre les résultats de Rawitz et les miens qu'en supposant que cet 
auteur a travaillé avec une marque de safranine bien différente de 
la mienne. En tout cas, les résultats sont beaux et le procédé peut 
être recommandé, surtout aux anatomistes qui ont affaire à un 
matériel qui retient mal la couleur. Le mordançage est si éner- 
gique que la couleur résiste à l'alcool pendant des heures. 

172. Autres colorants nucléaires par voie rég^^essive. — 

Dans les paragraphes précédents ont été décrits les procédés les plus 
usités. Il en est cependant d'autres qui donnent de bons résultats. 
Flemming (Arch, f, mik, Anat., XIX, 1881, p. 317 et 742) a expérimenté 
avec les couleurs suivantes : safranine, rose de Magdala, dahlia, 
mauvéine, rouge fluorescent, vert solide, ponceau, orange, éosine, 



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SAFRAMNE ET AUTRES COLORANTS NUCLEAIRES 137 

fuchsine, brun Bismarck. (La plupart de ces couleurs provenaient 
de la fabrique de Bindschedler et Busch, à Bâle.) 

Il a trouvé que Véosine et le ponceau ne doivent pas être employés, 
parce qu'ils ne donnent pas de coloration nucléaire. Vorange colore 
avec précision, mais trop faiblement. Toutes les autres couleurs 
donnent de bons résultats. La mauvéine et le rouge fluorescent 
colorent souvent quelques noyaux beaucoup plus fortement les uns 
que les autres dans une même préparation. Le vert solide donne une 
coloration plus faible que la safranine et le rose de Magdala; il 
exerce une action spécifique sur la charpente nucléaire et les 
nucléodes. La fuchsine donne une coloration plus faible que le rose 
de Magdala, la safranine, le dahlia et la mauvéine; le brun Bis- 
marck ne réussit pas bien avec les préparations à l'acide chromique : 
avec les préparations alcooliques récentes il donne une bonne colo- 
ration nucléaire qui manque cependant de précision. Les meilleurs 
résultats ont été obtenus en général avec la safranine, le 7*ose de 
Magdala et le dahlia (le violet de gentiane n'était pas connu à cette 
date). 

La Fuchsine est le nom de toute une série de sels de rosaniline 
qui se trouvent dans le commerce sous les marques de fuchsine, 
rouge d'aniline, rubine, roséine, Magenta, Solferino, 
coralline, etc., et qui diiTèrent plus ou moins dans leurs réactions. 
Graser {Zeit. f. wiss. Mik,, V, 3, 1888, p. 378) dit avoir obtenu les 
meilleurs résultats avec celte couleur de la manière suivante. Ou bien 
on l'emploie comme nous le dirons plus loin pour le violet de 
méthyle (n** 179). Ou bien, on l'emploie d'après la méthode de 
Baumgarten en coloration double avec le bleu de méthylène, comme 
nous le dirons au chapitre des Colorations combinées. 

La fuchsine carboliq[ue de Ziehl est une teinture qui est sou- 
vent recommandée. Je n'ai pas pu trouver la source originelle de 
publication et je cite d'après Zeit, f, wiss. Mik., VII, 1, 1890, p. 39. 

La solution colorante se compose de : 

Fuchsine 1 gramme. 

Acide phénique cristallisé 5 — 

Alcool iO — 

Eau distillée 100 — 

Ou bien on prend une solution d'acide phénique à 5 p. 100 dans 
l'eau et on la sature de solution alcoolique concentrée de fuchsine. 
(Le point de saturation se manifeste par la formation d'une pellicule 
à reflet métallique à la surface du liquide.) On décolore à l'alcool 
suivi d'essence de girofle. 



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138 



CHAPITRE X 



Le Brun Bismarck donnerait d'après Keiser (Bibl, ZooL, VII, i II] le, 
1891; Zeil. f. wiss, Mik., VIII, 3, 1891, p. 363) de bons résultats comme 
suit. On colore pendant quarante-huit heures à une température de 60<> C. 
dans une solution saturée de la couleur dans de Talcool à 60 p. 100, bouil- 
lant. On décolore dans de Talcool à 60 p. 100 additionné de 2 p. 100 
d'acide chlorhydrique ou 3 p. 100 d'acide acétique. Nous parlons plus loin 
du brun Bismarck comme colorant progressif. 

La Nigrosine soluble à Teau est une des indulines, petit groupe de cou- 
leurs classé par Ehrlich dans les couleurs « acides > sulfoniques, par 
Benedikt dans les couleurs < basiques > (apparemment il se trouve dans le 
commerce les deux sortes de couleurs, des sels basiques, et des acides sul- 
foniques). 

Cette couleur a été recommandée comme réactif colorant des noyaux par 
Errera (Proc.-Verb. Soc. Belge de Mie, 1881, p. 13i). Je Tai essayée en 
teinture par la méthode régressive et j'ai obtenu de très belles colorations 
nucléaires. La couleur s'est montrée très résistante à l'alcool, et je pense 
qu'elle mérite d'être l'objet d'études plus approfondies. 

Pfitzer (Deutsch, Botan. Ges., I, 1883, p. 44 ; Zeit. /*. wiss, Mik., 1, 1884, 
p. 116) dissout la nigrosine dans une solution saturée d'acide picrique dans 
Teau. On peut employer ce liquide pour fixer et colorer en même temps. 
On lave à l'eau ou à l'alcool dilué ; on monte à la glycérine ou au baume. 
Pfitzer dit que la méthode est utile pour fixer et colorer des organismes sur 
le porte-objet. Martinotti (Zci7. /*. wiss. Mik., 1885, p. 479) recommande la 
solution alcoolique de picronigrosine pour l'étude des centres nerveux. 

Freeborn a employé un semblable liquide pour le tissu conjonctif. Pour 
ces deux derniers procédés voyez aussi dans la Deuxième Partie. 

Peuvent être aussi employés en coloration régressive : 

Le Violet de xnéthyle (d'après Martinotti et Resegotti au mieux 
selon leur procédé de décoloration que nous avons donné au n^ 167) ; 

La Trapœollne OOO, n? 2 (Orange II, Chrysauréine, Beta- 
naphtolorange), etc. ; 

La Rocelline (Cchtroth, Orseilline n^ 3, Robidine, Rauva- 
rienne). Ces deux dernières couleurs sont citées d'après Griesbacii (Arch- 
/*. mik. Anal., XXII, p. 132). 

La Benzoazuriae a été préconisée par Martin {Zeil, f. wiss, Mik., VI, 
2, 1889, p. 193). Colorer pendant une heure ou deux dans une solution 
aqueuse diluée, et décolorer dans de l'alcool additionné d'acide chlorhy- 
drique (0,5 à 1 p. 100). Ce colorant a été recommandé pour Tétude de la 
ligne d'ossification par Zscuokke {op. cit., X, 3, 1893, p. 381). 

Le Bleu de Méthylène s'emploie aussi en coloration régressive. On 
emploie une solution aqueuse assez forte, et l'on décolore à l'alcool pur. 
Cette couleur a le défaut d'être très peu résistante à l'alcool. D'après 
Sqdire (Melhods, p. 36) on en augmente sensiblement la résistance en 
lavant bien à l'eau avant de passer à l'alcool. Voyez aussi n^ 162 bis, 

La Thionine, ou Violet de Lauth, homologue du bleu de méthylène, 
a été chaudement recommandée comme colorant de la chromatine par 
M. Heidenhain. C'est aussi un des colorants spécifiques de la mucine. 

Le Bleu de toluidine m'a donné en teinture régressive de superbes 
colorations, extraordinairement énergiques, de la chromatine, mais (jus- 
qu'à présent) malheureusement accompagnées d'une coloration diffuse du 



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SAFRANINE ET AUTRES COLORANTS NUCLÉAIRES 139 

cytoplasme. Mann {Zeit. f, wîss. Mik., XI, 4, 1894, p. 489) dit avoir eu de 
bons résultats en remployant après Téosine, ce qui produit une coloration 
double, réosiue agissant comme colorant plasmatique. 



B. — Colorants progressifs 

173. Introduction. — Nous rappelons que la plupart des couleurs 
tf basiques > donnent une coloration nucléaire plus ou moins précise par 
voie directe si Ton acidifie les solutions par l'acide acétique (0,5 à 1 p. 100). 
Nous ne décrirons ici que les procédés qui fournissent des colorations 
recommandables sous les rapports essentiels de la simplicité des manipula- 
tions et la précision et la permanence de la coloration. 

174. Le Vert de méthyle du commerce est un chlorure double de 
zinc et de violet pentaméthyle. Il est préparé actuellement par 
Inaction du chlorure (ou du nitrate) de méthyle sur la base du violet 
de méthyle, c'est-à-dire sur le violet de rosaniline méthylée 
(Benedikt, Chemisiry of Coal-Tar Colours ; Tassart, les Matières 
Colorantes Artificielles). Le produit commercial est très variable de 
qualité, souvent impur, et souvent falsifié (Bënedirt). 

Cette couleur paraît être aussi connue sous les noms de vert de 
méthylaniline, vei^t lumière^ « Lichtgrun » (ces deux derniers sont 
en réalité les noms d'une tout autre couleur). En 1874, lorsqu'elle fut 
étudiée pour la première fois, parCALBERLA [Morphol, Jahrb., III, 1877, 
p. 625), elle portail le nom de vert en cristaux. C'est aujourd'hui 
le plus répandu des verts dits d'aniline, et on le trouve communé- 
ment dans le commerce passant sous le nom d'autres verts plus 
coûteux, surtout sous celui de vert d'iode. Il importe de ne pas le 
confondre avec ce dernier, ni avec le vert d'aldéhyde {vert d'Eusèbe), 
ou les rosanilines phénylées, le vert de Paris et le vert d'alcali ou 
véridine. (Voy. le tableau, § 189.) 

Calberla, qui fut le premier à recommander ce colorant, en 1877, 
avait été surtout frappé, dit-il, de son action différente sur les tissus 
de diverse nature; il avait trouvé que c les noyaux du tissu conjonctif 
sous-cutané et ceux des vaisseaux et des gaines des nerfs s'y colo- 
raient en i*ose^ tandis que ceux du chorion se coloraient en rougCy et 
ceux de Tépiderme en diverses nuances de vert bleu et de bleu 
pur ». 

Il est certain que Calberla a dit cela. Cette étrange assertion a été 
répétée par Griesbach {Zeit. f. wiss. Mik., III, 3, 1886, p. 36o), qui 
en a fait la base d'une importante déduction théorique. 



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440 ' CHAPITRE X 

II est impossible de comprendre sur quoi esl basée cette assertion 
extraordinaire, car il est certain que jamais le vert de méthyle n'a 
coloré aucun élément histologique normal ni en rose ni en rouge. 
On sait depuis longtemps que le produit commercial colore souvent 
en violet ou en rose la matière amylolde, et en conséquence on l'a 
proposé comme réactif de la dégénérescence amyloïde (Hesghl, 
Wiener med. Wochenschr., 2, 1879; puis Corschmann {Virchow^s 
Arch,, t. LXÏX, 1880, p. 5S6). Il a été suggéré (Fol, Lehrb,, p. 192 ; 
SouiRE, MethodSj etc., p. 37 ; Paul Mater in liti.) que cette réaction 
serait due à ce que la couleur employée contiendrait du violet de 
méthyle comme impureté. Un produit pur ne donne pas cette réac- 
tion (Squire, /. c). Et il est certain que le produit commercial con- 
tient très souvent cette impureté, comme on peut facilement le 
comprendred'aprèsson mode de fabrication (voy. aussi Benedikt, /. c). 
Le vert d'iode du reste est dans le même cas. Il parait donc assez rai- 
sonnable de faire les deux suppositions que Calberla avait travaillé 
avec une couleur qui contenait du violet de méthyle, et qu'il avait 
eu affaire à des tissus en dégénérescence amyloïde. 

Le vert de méthyle fut employé par Balbiani et Hennegut [Ler. sur 
la gén. d. Vertébrés^ 1879), puis par Frommann, en 1880, pour des 
recherches sur des structures cellulaires ; et à partir de la recom- 
mandation de Strasburger en 1885 {Arch. f. mik.Anat., XXI, p. 476) 
on peut le considérer comme établi dans la technique en sa vraie 
qualité de réactif par excellence de la chromatine dans les tissus 
frais. 

Strasburger faisait agir sur des tissus frais une solution d'acide 
acétique à 1 p. 100 contenant en dissolution un peu de vert de 
méthyle. Ce procédé se fonde sur ce que le vert de méthyle, qui est 
par lui-même un agent fixateur suffisant à fixer et à conserver les 
éléments dans leur forme, du moins pendant quelques heures, l'est à 
un plus haut degré quand il est combiné avec l'acide acétique. Il a 
l'avantage de pouvoir être employé sur les tissus frais en combi- 
naison avec d'autres liquides fixateurs ou c indifférents *. Ainsi 
Garnoy {Biologie cellulaire^ p. 147, 144, 211) l'emploie tantôt, 
comme Strasburger, avec l'acide acétique seul, tantôt avec une trace 
d'acide osmique, tantôt ajouté à la solution de Ripart et Petit. On 
peut aussi l'employer selon la manière usuelle pour colorer des 
objets soit fixés sur l'heure et lavés à l'eau, soit fixés et conservés 
selon les méthodes connues. 

Il est bon d'employer, pour les tissus frais, une solution un peu 
forte additionnée de 1 p. 100 d'acide acétique glacial et 0,1 à 



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1 



sâfranine et autres colorants kcgléaires 141 

1 p. 100 d*acîde osmique. La coloration est instantanée^ et, après 
lavage, d'une éleclivité incomparable. 

La conservation des objets traités de cette manière offre quelques 
diflicultés, car on ne peut rendre la coloration un peu permanente 
qu'à force de précautions spéciales. Le mieux est de les montrer dans 
un milieu aqueux (glycérine, glycérine gélatinée, liqueur de Ripart 
et Petit), en ayant soin (ïéviter les soltUions salines, 'd'employer 
toujours un milieu légèrement acide, et d'ajouter sur le bord de la 
préparation, avant de la fermer, une petite goutte de la solution de 
vert de méthyle. On peut aussi réussir à conserver ces préparations 
dans le baume, en employant pour la déshydratation des alcools 
acidulés par l'acide acétique et chargés d'une quantité suffisante de 
vert de méthyle, mais ce procédé est assez aléatoire. 

M. HEmsNHAiN a trouvé qu'en mordançant par la teinture d'iode 
la résistance du vert de méthyle à l'alcool (au moins dans la combi- 
naison Ehrlich-Biondi) est sensiblement augmentée. Squirb déclare 
qu'il en est de même d'un simple lavage à l'eau avant de passer à 
l'alcool. 

Henneguy a trouvé que la couleur se conserve très bien dans le 
liquide de Brun à la glucose. 

On peut aussi employer pour les colorations des solutions alcoo- 
liques de vert de méthyle. Ces solutions doivent être acidulées par 
l'acide acétique. 

Le manque de sûreté dans la conservation des colorations met des 
limites à l'emploi du vert de méthyle ; mais, nous le répétons, ce 
réactif est d'une importance très grande comme étant le plus précis 
et le plus infaillible de tous les colorants de la chromatine à Vétat 
frais; pour les préparations temporaires il est certainement sans 
rival. 

Employé sur des tissus frais ou seulement légèrement fixés, le 
vert de méthyle est le réactif colorant par excellence de la chroma- 
tine. Car au sein du noyau il ne colore absolument rien que les 
chromosomes; il ne colore ni les nucléoles plasmatiques, ni le 
caryoplasme, ni le fuseau. Les recherches minutieuses de contrôle de 
Carnoy ont mis ces faits hors de doute. En dehors du noyau, le vert 
de mélhyle peut colorer diverses substances, telles que les enclaves 
du protoplasma cellulaire, le protoplasma lui-même, certaines mem- 
branes et certaines sécrétions, telles que la soie. 

175. Vert d'iode (Hofmann's Orûn). — Cette substance a été intro- 
duite dans la techuique histologique par Griesbach (Zool. Anzeiger, \, 
1882, p. 406). Griesbach pense que le vert d'iode est plus utile que toutes 



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142 CHAPITRE X 

les autres anilines. Les autres histologistes ne se sont pas rangés à son 
avis, et ce colorant est aujourd'hui entièrement démodé. Du reste le vert 
d'iode ne se fabrique plus pour l'industrie de la teinture. On peut cependant 
s'en procurer chez Grûbler. 

178. Brun Bismarck (Vésuvine, Manchester Bro^wn, la 
Phénicienne). — Ilislologiquement, cette couleur présente bien des 
points de ressemblance avec les deux précédentes. C'est un bon 
colorant électif des noyaux, et pouvant être employé aussi bien pour 
des tissus frais que pour ceux qui ont été conservés par les méthodes 
ordinaires. Les objets traités par l'acide chromique s'y colorent, 
mais moins bien que d*autres. 

Le brun Bismarck ne se dissout pas très facilement dans l'eau. On 
peut le faire bouillir dans Teau, et filtrer après un jour ou deux 
(Wëigert, Arch. f. mik. Anat., XV, 1878, p. 258). On peut addi- 
tionner les solutions aqueuses d'acide acétique et d'acide osmique. 
Mayzel {Arch, f. mik. AnaL, XVIII, 1880, p. 237 et 250) fait dissoudre 
la couleur directement dans l'acide acétique ; en ce cas, les colora- 
tions ne sont pas permanentes. 

Paul Mayër emploie aussi une solution saturée de brun Bismarck 
dans l'alcool à 70 degrés. 

Il y a quelquefois avantage à employer une solution dans de la 
glycérine allongée de 50 à 60 p. 100 d'eau. Les solutions faites à 
Teau demandent à êlre souvent filtrées. On a recommandé d'y 
ajouter de l'acide phénique (Journ. Roy, Mie, Soc, 1886, p. 908). 

C'est un colorant énergique. Des préparations alcooliques ou 
chromiques peuvent se colorer en quelques instants dans les solu- 
tions concentrées, et en quelques minutes dans des solutions étendus. 
On peut laver à l'eau et monter à la glycérine ; ou bien, passer par 
les alcools, l'essence de girofle et le baume. 

Celte couleur a deux qualités qui contribuent à la rendre extrê- 
mement utile en bien des cas : elle produit rarement des colorations 
excessives, et, la couleur ne se laissant pas trop facilement extraire 
par l'alcool, il est très facile de faire des préparations permanentes 
au baume. 

Nous rappelons qu'elle sert pour les t colorations vitales ». 

179. Violet de Méthyle (Violet de Paris). — Le procédé suivant a 
été recommandé par Orth (Journ, Boy, Mie. Soc, 1881, p. 137). On colore 
dans une solution de 1 partie de la couleur dans 300 parties d'acide acé- 
tique, on ne lave pas, mais on égoutte et on monte dans une solution de 
2 parties d'acétate de potasse dans 1 partie d'eau. Les préparations ne se 
conserveront guère au delà d'un an. 



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SÂFRANINE ET AUTRES COLORANTS NUCLÉAIRES 143 

Le procédé suivant parait devoir être plus utile. Grasbr (cité d*après 
ScuiEFFERDECKER, qui le recommande, dans Zeit. f. wiss. Mik.^ V, 3, 1888, 
p. 378) procède comme suit. Des coupes sont colorées pendant douze à vingt- 
quatre heures dans une solution (il n*est pas dit si c'est dans Teau ou dans 
Talcool) si diluée qu'au bout de ce temps elles en ont absorbé toute la 
couleur. Décoloration dans Talcool acidifié suivi d*alcool pur. D'après 
ScHiEFFERDECKERla différenciation des figures karyokinétiques serait encore 
plus belle qu'avec la safranine. 

La matière amyloïde parait rouge dans les préparations colorées au violet 
de méthyle. D'après les intéressantes expériences de Capparelli (Archivio 
per le Soi. mediche, III, 21, p. 1), ce serait là un phénomène d'ordre phy- 
sique (la matière amyloïde aurait la propriété d'arrêter les rayons violets 
tout en laissant passer les rayons rouges). 

Voyez aussi Violet B, au chapitre suivant. 



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CHAPITRE XI 

BLEU DE MÉTHYLÈNE ET AUTRES COLORANTS 
PLASMATIQUES 

A. — - BLEU DE MÉTHYLÈNE 

180. Bl6u de méthylène. Introduction. — Cette couleur est 
sous bien des rapports un réactif d'une grande importance. Nous 
avons déjà dit qu'elle donne de bonnes colorations nucléaires par la 
méthode régressive. Son importance comme colorant des microbes 
dans les tissus est connue de tous les pathologistes. On s'en sert 
comme colorant spécifique des nerfs à myéline du système ner- 
veux central. C'est aussi un réactif spécifique pour certaines cellules 
à granules {Plasmazellen). C'est une des couleurs les mieux tolérées 
par les cellules vivantes , et partant un des meilleurs colorants 
c vitaux ». Enfin il sert à fournir des colorations spéciales de 
tissu nerveux, de ciments intercellulaires, d'espaces lymphatiques et 
autres objets de ce genre qui sont essentiellement identiques à celles 
que fournissent les imprégnations à l'or ou à l'argent les mieux 
réussies ; elles les valent comme résultats, et elles ont l'avantage de se 
laisser produire avec plus de facilité et de sûreté. C'est ce dernier 
emploi du bleu de méthylène qui va surtout nous occuper mainte- 
nant. 

Il est très important de travailler avec une couleur parfaitement 
pure, et pour cela il est urgent de s'adresser à Grûbler ou à l'un des 
fournisseurs cités au numéro 99. Apatuy, dont nous allons décrire 
les procédés d'imprégnation, n'a trouvé qu'une seule marque qui 
donne exactement les résultats qu'il décrit ; c^est la marque « medi- 
cinisches Methylenblau^ chemisch rein und chlorzinkfrei »> de 
E. Merck, à Darmstadt. 



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BLEU DE MÉTHYLÈNE ET AUTRES COLORANTS PLASMATIQUES i45 

181. Coloration « vitale » d'organismes entiers. - De oetits 
orgaa.smes aquatiques facilement perméables peuvent être colorés pendant 
a vie en additionnant Teau dans laquelle ils vivent d^un peu de la couleur 
(assez pour donner à l'eau une teinte bleue perceptible). Après avoir suffi- 
samment attendu, quelques heures ou plusieurs jours, on trouve à l'examen 
que certains tissus des sujets en l'expérience se sont imbibés plus ou 
moins de couleur, tandis que d'autres sont demeurés incolores. Si mainte- 
nant on remet les animaux dans l'eau colorée et qu'on attende encore on 
trouvera après un laps de temps suffisant, que d'autres groupes de tissus se 
sont imbibes à leur tour de la couleur. On pourrait bien s'imaSr en 
conséquence que si l'on attendait encore plus longtemps il arriverait à la 
fin un moment où tous les tissus des animaux se montreraient chargés de la 
couleur. Or il n en est rien. On trouve au contraire qu'un tissu quelconaue 
ne conserve la couleur qui l'a imbibé que pendant fort peu de temps après 
qu il a atteint le degré maximum de coloration dont il est susceptible -une 
fois ce point atteint, il commence à dégorger la couleur encore plus vhe 
quil ne la absorbée. L'animal peut même, comme je l'ai observé, aorès 
s être colore dans la plupart de ses tissus, se décolorer entièrement, touiours 
dans 1 eau chargée de la couleur, et cela sans avoir apparemment souffert 
en aucune façon. Il s'ensuit évidemment que ces « colorations vitales » ne 
sauraient prétendre au titre de teintures véritables, mais que ce sont de 
simples imbibitions des tissus par la couleur. Le lecteur voudra bien revoir 
ICI ce qui a été dit à ce sujet au numéro 97. 

Si dans ces conditions on ne peut guère espérer d'obtenir une coloration 
générale de tous les tissus d'un organisme, on peut cependant obtenir une 
coloration hmitee a certains de ces tissus, et cela de deux manières On v 
arrive par la méthode progressive. Si le tissu qu'on désire observer est de 
ceux qui se colorent de bonne heure, on interrompt l'immersion aussitôt 
que ce tissu a atteint une coloration suffisante et avant que les autres ne 
se soient imprégnés au point de gêner l'observation. Et l'on y arrivé nar la 
méthode régressive. Si le tissu à observer est de ceux qui se colorent tar 
diyement,on attend pour l'examiner jusqu'à ce que les éléments qui se sont 
colores en premier lieu aient dépassé leur point de saturation et se soient 
deja dégorges de leur couleur, pendant que les éléments à observer 
montrent encore une coloration suffisante. La couleur peut être fixée à 
l'une ou rautre de ces étapes par des procédés que nous donnons plus loin 
(Conservation). ^ 

La coloration qu'on obtient par ce procédé d'immersion totale d'un ani 
mal vivant est limitée en général à des granulations cytoplasmiques 
qui se colorent quelquefois très vivement (voyez encore au n^ 97) L'ordre 
dans lequel les tissus se montrent colorés ne peut pas être prévu -il parait 
dépendre des divers degrés de perméabilité des tissus. Les épithéliums 
surtout les épithéliums glandulaires, se colorent en général très vite* puis 
les cellules lymphoïdes, les muscles, etc. Le tissu nerveux se colore 'tard ■ 
je n'ai jamais pu le colorer chez un animal parfaitement intègre. On com- 
prendra sans peine qu*un procédé pareil ne saurait être d'une fort grande 
utilité dans les recherches anatomiques. J'ai surtout tenu à décrire la 
marche de la soi-disant a coloration vitale » chez les animaux entiers parce 
qu'elle permet de mieux comprendre la marche à suivre dans les véritables 
imprégnations ou teintures. 

ANAT. MICROSC. ^a 



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146 CHAPITRE XI 

La proportion de couleur à ajouter à l'eau pources expériences varie natu- 
rellement selon les objets. On pourra souvent se laisser guider par la teinte; 
un bleu assez sensible ne nuira guère, même à des organismes délicats. Zoja 
(Rendic. R. Ist. Lombardo, XXV, 1892; Zeii.f, wiss. 3/t/j.,lX, 2, 1892, p. 208) 
a trouvé qu'une proportion de 1 p. 20000 ou 10000 d'eau est celle qu'il 
laut pour Hydra, Je pense que le plus souvent 1 p. 100000 sera bien assez. 

182. Coloration < vitale » de tissus nerveux. — Le principe 
de ces colorations est dû à EriRUcu {Abh. k, Akad, Wiss. Berlin, 25 
Feb. 1885 ; Nature, 1885, p. 547). — En injectant des animaux 
vivants avec des solutions de bleu de méthylène, Ehrlich avait obtenu 
<les colorations de cylindres de Taxe de nerfs périphériques ; ces élé- 
ments appartenaient toujours à des nerfs sensitifs, les nerfs moteurs 
ne contenant aucun élément qui montrât cette réaction. (On a trouvé 
depuis (Arnstetn) que les nerfs moteurs se colorent bien aussi, mais 
plus tardivement). L'état de vitalité des tissus ainsi colorés est un 
point en litige. 

On a cru pendant longtemps que ces colorations ne pouvaient pas 
se réaliser sur des tissus morts. Cependant Dogiel {Arch, f, mik. Anat., 
XXXV, 1890, p. 305 et seq.) a pu imprégner des nerfs sur des membres 
de Grenouille jusqu'à trois et même huit jours après que ces membres 
avaient été séparés de Tanimal. Il en a conclu, à la vérité, que cette 
expérience montre que les nerfs vivaient encore au moment de la 
coloration. Mais il paraît plus naturel d'en conclure, avec Apatdy 
{Zeit. f. wiss. Mik., IX, 1, 1892, p. 15 et suiv.) que la coloration peut 
se produire après la mort. 

Apatuy a fait une série d'expériences destinées à élucider ce point. 
Voici ses résultats. Il n'est pas nécessaire que le tissu soit vivant, mais 
il faut qu'il soit frais; aucun élément ne doit en avoir été extrait par 
action chimique ; et son état normal ne doit pas avoir été essentiel- 
lement changé par des moyens physiques. Par exemple, le tissu ne 
doit pas avoir été traité parla glycérine, même diluée, ni par l'alcool ; 
un traitement de peu de durée par la solution physiologique de sel 
n'est pas très nuisible ; le tissu ne doit pas avoir été coagulé par la 
chaleur. 

Il est à peine nécessaire de rappeler que, d'après les conclusions du 
numéro 97, la coloration une fois établie doit nécessairement inté- 
resser seulement des éléments qui ne vivent plus. 

On admet généralement que Id. présence de l'oxygène e&i nécessaire 
pour la réalisation de la coloration bleue des éléments nerveux. En 
conséquence, après avoir traité l'organe par le. bleu de méthylène par 
injection ou immersion, on a coutume de le réséquer et le laisser pen- 



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BLEU DE MÉTHYLÈNE ET AUTRES COLORANTS PLASMATIQUES 147 

dant quelque temps exposé à Tair. Et eflectivement il se trouve le plus 
souvent que les tissus ainsi traités ne bleuissent que quelque temps 
après avoir été ainsi exposés à Tair. Apatoy a aussi examiné ce point 
et trouve {L c, p. 25) que cette pratique est souvent bonne, mais que 
la croyance sur laquelle elle repose est erronée. Voici, selon, Apatuy, 
la véritable explication de ce qui se passe. 

La coloration des nerfs est une coloration régressive. Il a été 
expliqué plus haut que presque aussitôt qu'un élément a atteint le 
degré maximum de coloration dont il est susceptible au contact d'une 
solution de bleu de méthylène, il commence à céder de nouveau sa 
couleur au liquide qui le baigne. Or plus est considérale le volume de 
ce liquide et plus sera rapide ce processus de décoloration. Est-il 
d'une rapidité très grande, la couleur sera vite enlevée des éléments 
nerveux que seuls on désire avoir colorés, aussi bien que des éléments 
à coloration plus précoce que Ton désire décolorer pour avoir la 
coloration spécifique des éléments nerveux seulement. Il est donc 
avantageux que cette décoloration obligée se fasse dans un volume 
de liquide aussi petit que possible. Il existe bien une autre considé- 
ration qui justifie la pratique en question. C'est que par l'exposition 
à l'air les préparations s'assimilent des traces d'ammoniaque. Et 
Apàthy a établi par des expériences que ceci est un facteur impor- 
tant dans la précision de la coloration. Il n'admet pas que l'oxygène 
y joue un rôle quelconque. 

183. Coloration par injection et par immersion. — La pra- 
tique ancienne pour la coloration de nerfs était toujours d'introduire 
la solution colorante par injection dans le système vasculairc ou dans 
la cavité du corps d'un animal vivant, d'attendre un temps suffisant 
pour qu'elle puisse agir sur les tissus, puis d'enlever l'organe à étu- 
dier pour la préparation ultérieure. On croyait communément que 
le procédé par injection était essentiel à la production de la colora- 
tion. On sait maintenant que cette condition n'est nullement essen- 
tielle, et que la réaction s'obtient habituellement tout aussi bien sur 
des organes simplement enlevés de l'animal et soumis à un bain de la 
matière colorante de la manière usuelle. Il paraîtrait cependant que 
pour de certains objets le procédé par injection serait préférable sinon 
nécessaire. C'est ce qu'a trouvé Burger pour les Némertiens {Mitth. 
ZooL Stat. Neapel, X, 1891, p. 206). 

184. Les solutions Remployer. — Les solutions pour injection 
se font d'habitude dans de la solution de sel de cuisine dans l'eau à 



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148 



CHAPITRE XI 



0,75. p. 100 OU moins; les solutions pour coloration par immersion 
se font ou bien dans la solution saline ou bien dans un liquide 
€ indifférent», ou enfin dans Teau pure. Les premiers travailleurs 
employaient des solutions plutôt concentrées de la couleur. Ainsi 
Arnstein {Anat. Anz., 1887, p. 125) injectait dans la vena cutanea 
magna des Grenouilles 1 ce. de solution saturée, et enlevait Torgane 
à étudier après une heure. Biedermann [Sitzb. d. k, Akad, Wiss, 
Wien; Math. Nat. Classe, 1888, p. 8) injectait dans le thorax des 
Écrevisses 0,5 à 1 ce. d'une solution presque saturée dans de la solution 
de sel à 0,6 p. 100, et laissait les animaux de deux à quatre heures 
avant de les sacrifier. S. Mayer {Zeit, f, wiss. Mik., VI, 4, 1889, 
p. 423) employait une concentration de 1/300 ou 1/400 dans de la 
solution saline à 0,5 p. 100. Une pareille solution peut être introduite 
dans l'organisme soit par injection au moyen d'une seringue, 
soit par auto-injection au moyen du cœur de l'animal. Les Lapins 
supportent bien cette opération si l'on a soin de pratiquer en même 
temps la respiration artificielle. 

Les solutions de Retzius sont d'une concentration semblable. Mais 
la tendance des travailleurs plus récents est dans la direction de con- 
centrations plus faibles. Apatuy (Zeit. f, wiss. Mik., IX, 1, 1892, 
p. 25, 26, et seq.) trouve qu'il est non seulement inutile, mais même 
désavantageux de prendre des concentrations supérieures à 1/1 000. 

Les solutions à employer pour la coloration par immersion sont ne 
général plus faibles que celles que l'on emploie pour l'injection. Dogiel 
{Arch. f. mik. Anat., XXXV, 1890, p. 305; et d'autres travaux plus 
récents, comme op. cit., XLIV, 1894, p. 18) place des portions de 
tissu dans quelques gouttes d'humeur aqueuse ou vitreuse, ajoute 
2 ou 3 gouttes de solution de la couleur à 1/16® ou 1/15® p. 100 dans 
de la solution physiologique de sel, et laisse la préparation exposée 
à l'air. La coloration commence, dans des portions de tissu mince, 
au bout de cinq à dix minutes, et atteint son maximum dans quinze 
à vingt minutes. Pour des objets plus épais, — rétine par exemple, — 
il faut quelquefois plusieurs heures, et en ce cas il faut tenir la pré- 
paration humide en l'humectant alternativement de temps à autre 
avec une goutte du liquide indifférent et une goutte de la teinture. 
La coloration sera activée par l'emploi (en hiver) d'une étuve chauffée 
à 30'^35'' C. Rouget {Comptes rend., 1893, n** 21, p. 802-4) a trouvé 
qu'une modification utile du procédé de Dogiel consiste à employer 
une concentration de 0,03 p. 100 dans de la solution de sel à 0,6 
p. 100 (muscles de Batraciens). Allen [Quart. Journ. Mie. Soi., 1894, 
p. 461, 483) prend pour des embryons de Homards une solution de 



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BLEU DE 3IÉTIiYLÈNE ET ACTRES COLORANTS PLASMATIQUES 149 

i p. 1000 (dans de la solution saline) qu'il dilue encore de 15 à 20 
volumes d'eau de mer. 

185. Méthodes d'Apëithy. — Gomme exemple de ces opérations 
nous ajoutons une description abrégée de la marche recommandée 
par Apathy {Zett. f, wiss. Mik., IX, 1, 1892, p. 15) pour les Hirudi- 
nées. On met à nu une portion de la chaîne ganglionnaire. Si on le pré- 
fère, on peut la réséquer, mais il vaut mieux ne pas en éloigner le 
sinus ventral et le tissu pigmenté qui Fentoure avant que la colora- 
tion et la fixation niaient été achevées. Cependant, si Ton désire avoir 
une coloration de cellules ganglionnaires en même temps que des 
fibres nerveuses, il faut couper les nerfs latéraux en même temps 
que les cordons connectifs, dans le voisinage d'un ganglion. La pré- 
paration est traitée alors par la solution colorante. Celle-ci se com- 
pose, — pour la démonstration surtout des fibres chez Hirudo et 
Pontobdella — ou bien d'une solution à 1 p. 1000 dans de la solu- 
tion saline de 0, 5 à 0,75 p. 100 qu'on laisse agir pendant dix minutes; 
ou d'une solution à 1/10000, qu'on laisse agir pendant une heure ou 
une heure et demie ; ou d'une solution à 1/100000 qu'on laisse agir 
pendant trois heures. (Ces chiffres doivent être doublés pour Lum- 
bricuSy triples pour i4s^act^5 et UniOj et quadruplés pour les nerfs à 
myéline des Vertébrés. Pour la démonstration des cellules ganglion- 
naires, ils doivent être triplés (les cordons connectifs et les nerfs laté- 
raux ayant été coupés comme nous l'avons dit). 

Après coloration, les préparations faites à la solution de 1/1000 
sont lavées pendant une heure dans de la solution saline; celles faites 
à la solution de 1/10000 pendant un quart d'heure ; celles faites à la 
solution de 1/100000 ne demanderont pas de lavage. 

Après lavage, on les traite par l'un des liquides fixateurs et diffé- 
rentiateurs décrits au numéro suivant. 

Ceci se fait en les inondant du liquide et en les y laissant pendant au 
moins une heure sa7is les remuer dans le liquide, et au mieux à l'obs- 
curité. Le traitement ultérieur est également décrit au numéro suivant. 

Les liquides fixateurs en question contiennent de l'ammoniaque. Le 
but de cette addition est d'aider à la différentiation de la couleur en 
produisant une différenciation régressive artificielle. L'ammoniaque 
agit en décolorant certains éléments plus rapidement que d'autres. 

Dans l'objet que nous étudions ce sont, d'après Apathy, les parties 
protoplasmiques des fibres nerveuses, puis leur « substance interfi- 
brillaire > et c périfibrillaire » qui se décolorent en premier lieu, les 
« fibrilles primitives > retenant encore fortement la couleur. D'après 



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150 CHAPITRE XI 

Apathy, la coloration que Ton obtient ainsi serait une véritable 
teinture de « fibrilles primitives », et non une simple imprégnation. 
Les c fibrilles primitives 3 se montrent nettement teintées d'un bleu 
violet, sans aucun précipité granuleux, la substance « interfibril- 
laire » et c périfibrillaire », et les noyaux, se montrant incolores ou 
à peu près. Les méthodes usuelles au contraire donnent une réaction 
inverse, les « fibrilles primitives » demeurant incolores, pendant que 
la substance « interfibrillaire > et le protoplasme des fibres nerveuses 
sont imprégnés d'un précipité finement granuleux d'un noir verdâtre 
ou violet, et que les noyaux se montrent en général colorés. 

186. Fixation et conservation. — Nous avons déjà expliqué 
que les colorations obtenues par ces procédés ne se conservent pas 
au delà de quelques heures, souvent pas au delà de quelques minutes, 
si Ton ne met en œuvre des précautions spéciales pour les conserver. 
DoGiEL {Arch. f. mik. Anat., XXXIII, 4, 1889, p. 440), suivant 
Arnstein {Anat. Anz.j 1887, p. 581), procède comme suit. Après colo- 
ration, les préparations sont mises, pour fixer la couleur, dans une 
solution saturée de picrate d'ammoniaque. On les y laisse une demi- 
heure ou plus, puis on les lave dans une nouvelle quantité de la 
solution et on les porte pour l'étude dans de la glycérine diluée, ou 
bien on les monte définitivement dans de la glycérine saturée de 
picrate. Plus récemment {Zeit, f, wiss, Mik., YIII, 1, 1891, p. 15) 
cet auteur a trouvé préférable de prolonger le bain de picrate jusqu'à 
dix-huit ou vingt-quatre heures, et de monter dans de la glycérine 
chimiquement pure et libre d'acide, ou bien {Arch. f. mik. Anat., 
44, 1894, p. 16) dans de la glycérine allongée d'un volume de la 
solution de picrate. Ces procédés ont un inconvénient ; c'est'que le 
picrate d'ammoniaque exerce une action macérante très nuisible sur 
certains tissus. On peut éviter cela en ajoutant au bain de fixation 
1 à 2 p. 100 de solution d'acide osmique à 1 p. 100. (Si l'on désire 
durcir les tissus pour en faire des coupes, il convient de quadrupler 
la dose de solution osmique.) 

S. Mayer {Zeit. f, wiss. Mik., VI, 4, 1883, p. 422) préférait l'emploi 
d'un mélange à parties égales de glycérine et de solution saturée de 
picrate d'ammoniaque, mélange qui servait à la fois à fixer la couleur 
et à monter les préparations. C'était là en principe aussi la méthode 
de Retzius {Intern, Monatss. f. Anat. u. Phys,^ VII, 8, 1890). 
DoGiEL, à la suite d'expériences comparatives, se refuse à admettre 
que ce procédé soit un perfectionnement. 

D'autres travailleurs ont employé une solution saturée d'iode dans 



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BLEU DE MÉTHYLÈNE ET AUTRES COLORANTS PLASMATIQUES 151 

riodure de potassium (Arnstein), ou bien le picro-carmin (ainsi Feist, 
Arch. A Anai. u. Entw,, 1890, p. 116). Le picro-carmin aurait l'avan- 
tage de conserver la couleur bleu pur de la teinture, si on ne le laisse 
pas agir trop longtemps, et si Ton monte ensuite dans la glycérine pure. 

Lavdowsky a employé Tacide picrique. Dogiel a étudié ce procédé 
et l'a rejeté. 

Apatuy {ZeiL f. wiss. Mik,^ IX, 1, 1892, p. 30) a trouvé, comme 
nous Tavonsdéjà dit que la présence d*ammoniaque libre est un fac- 
teur important dans la différenciation de la coloration. Il met ses 
préparations (après lavage ou non, selon ce qui a été dit au numéro 
précédent) soit dans une solution saturée de picrate d'ammoniaque 
libre d'acide picrique et additionnée de 5 gouttes d ammoniaque 
concentrée pour 100 ce. ; ou bien, ce qui vaut en général mieux, dans 
une solution à 1 ou 2 p. 100 de carbonate neutre d'ammoniaque, 
fraîchement préparée et saturée de picrate. 11 les laisse dans l'un ou 
l'autre de ces liquides pendant au moins une heure^ et au mieux à 
l'obscurité. 11 les met ensuite dans une petite quantité de solution 
saturée de picrate dans de la glycérine à 50 p. 100 et les y laisse 
jusqu'à ce qu'elles en soient parfaitement pénétrées. Puis il les met 
dans une solution saturée de picrate dans un mélange de glycérine à 
50 p. 100, 2 parties, solution de sucre saturée à froid, 1 partie, et 
solution pareille de gomme arabique, 1 partie. Après pénétration par ce 
mélange il les monte définitivement dans le milieu suivant [L c, p. 37). 

Gomme arabique 50 grammes. 

Sucre de caune 50 — 

Eau distillée 50 — 

(Faire dissoudre au bain-marie et ajouter S centigrammes de thymol.) 
Ce sirop durcit très vite et devient aussi dur que le baume, de sorte 
qu'il n'est pas nécessaire de luter les préparations. On peut aussi se 
servir du médium de Farrant (mais en ce cas sans addition d'acide 
arsénieux). On ne doit en aucun cas ajouter ni picrate d'ammoniaque 
ni bleu de méthylène au milieu conservateur. 

Aucune de ces méthodes n'est parfaitement satisfaisante. La plu- 
part n'en conservent pas la coloration dans son ton naturel de bleu, 
mais la font virer à un gris variant du brunâtre au noir verdâtre. Les 
préparations ne se conservent guère, même en cet état, au delà de 
quelques mois ; et Ton est obligé de renoncer au montage au baume. 
Ces préparations sont particulièrement sensibles à l'action de la 
lumière. La vive lumière concentrée sur les préparations par le con- 
densateur pendant l'observation leur nuit beaucoup. Et Apathy a 



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152 CHAPITRE XI 

remarqué que l'e'clairage artificiel est plus nuisible que la lumière du 
jour, ce qu'il attribue en partie à Tabondance des rayons jaunes, et 
en partie à la chaleur considérable. 

187. Méthodes pour les coupes. — Les procédés décrits jus- 
qu'ici ne donnent pas une fixation de la couleur suffisante pour per- 
mettre remploi des méthodes usuelles d'inclusion. Fëist {Arch, /. 
Anat. u. Entw., 1890, p. 116; Zeit. f. wiss. Mik., VII, 2, 1890, 
p. 321) dit qu'une forte solution de chlorure de platine donne une 
fixation qui supporte Tinclusion soit dans la celloïdine, soit dans la 
paraffine. Mais le précipité de couleur fourni par ce réactif est de 
nature granuleuse, et les préparations ne sont pas très satisfaisantes. 
Le même auteur a aussi trouvé qu'on peut mettre en œuvre l'inclu- 
sion à la gomme de Joliet. 

La Méthode'dfi Parker {ZooL Anz.y 403, 1892, p. 375) est un per- 
fectionnement important. La couleur est fixée (sous forme d'un préci- 
pité violet très finement granuleux) par (1) une solution saturée de 
sublimé dans Teau. On déshydrate alors les objets dans (2) une solu- 
tion de 1 gramme de sublimé dans 5 ce. de mélhylal (le méthylal 
pur décolorerait plus ou moins). 

On éloigne ensuite le méthylal par un mélange (3) de deux parties 
de xylol, une partie de méthylal pur, et une partie du mélange 
numéro 2. Après quelque temps on passe à (4) une quantité considé- 
rable de xylol pur. Les préparations doivent y rester jusqu'à ce que 
tout le méthylal et tout le sublimé en aient été complètement éloi- 
gnés. 11 faut pour cela quatre à cinq jours, car le sublimé est très 
peu soluble dans le xylol. On peut maintenant monter au baume; 
ou, si l'on désire faire des coupes, on passe au bain de paraffine et 
Ton fait l'inclusion de la manière usuelle. 

Les coupes doivent être collées sur porte-objet par le collodion de 
Schàllibaum et non par l'albumine de Mayer, car celle-ci les déco- 
lore. Les préparations se conservent pendant quelques semaines, 
mais au bout d'un mois les détails fins auront soufi'ert. 

La durée des opérations demandée pour un ganglion de la chaîne 
ventrale d'une Écrevisse est comme suit : pour 1 , dix minutes ; 2, 
quinze minutes ; 3, dix minutes ; 4, quatre ou cinq jours. 

-La Méthode de Bethe {Arch, f. mik, Anat., XLIV, 4, 1894, p. 585) 
est comme suit. On fait une solution de 

Molybdate d'ammoniaque 1 gramme. 

Eau distillée 10 — 

Peroxyde d'hydrogène I — 



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■■ A ' ■■ " 



BLEU DE MÉTHYLÈNE ET AUTRES COLORANTS PLASMATIQUES lo3 

(En ajoutant le peroxyde, coloration jaune.) On ajoute 1 goutte 
d'acide chlorhydrique officinal (précipité blanc d'acide molybdique 
soluble après agitation). Après coloration et rinçage avec de la solu- 
tion saline, on met les pièces dans la solution molybdique. Elle doit 
être fraîche, c'est-à-dire n'avoir en tout cas pas plus de huit jours : 
il est bon avant de s'en servir de la refroidir à 0°. On y laisse les 
pièces deux à trois heures si elles sont petites, quatre à cinq heures 
si elles sont grandes (1 centimètre). On lave pendant une demi-heure 
à deux heures dans de l'eau, on déshydrate à l'alcool (au mieux re- 
froidi àO*^), on éclaircit à l'essence de girofle ou (mieux) au xylol. On 
fait l'inclusion à la paraffine ou au collodion de la manière habi- 
tuelle. 

La formule ci-dessus est pour les tissus des Vertébrés. Pour les 
Invertébrés, Bethe conseille 1 gramme de molybdate, 10 ce. d'eau, et 
0,5 ce. de peroxyde. 

188. Méthodes pour imprégnations (épithéliums, espaces 
lymphatiq[ues, etc.). — Voici les procédés de Dogiel [Arch, f. mik, 
Anat., XXXIII, 4, 1889, p. 440). Des portions convenables de tissus 
(des membranes minces, si possible) sont mises à l'état frais dans 
une solution à 4 p. 100 de bleu de méthylène dans de la solution 
physiologique de sel. Après quelques minutes on les met dans une 
solution saturée de picrate d'ammoniaque, on les y laisse pendant 
une demi-heure ou plus, on lave dans une nouvelle quantité de solu- 
tion de picrate, et on les porte pour l'étude dans de la glycérine 
diluée. 

Si l'on désire démontrer les contours de cellules endothéliales seu- 
lement, le bain de teinture doit être abrégé, et ne pas durer plus de 
dix minutes en général. Si au contraire on désiré obtenir en outre l'im- 
prégnation de la substance fondamentale des tissus de manière à avoir 
une image négative des fins canaux lymphatiques ou autres espaces 
intercellulaires, il faut colorer pendant quinze à trente minutes, et 
il sera préférable d'éloigner le revêtement endothélial des tissus 
avant de les mettre dans le bain de teinture. 

Fixation de la couleur, et conservation, comme au numéro 186. 
Les résultats sont pratiquement identiques, sauf la couleur, à ceux 
d'une imprégnation négative au nitrate d'argent. 

Méthodes de S. Mayer {Zeit. f. wiss, Mik., VI, 4, 1889, p. 422). 
Les expériences de Mayer, faites en même temps que celles de Dogiel, 
mais indépendamment de celles-ci, se rapportent à des objets sem- 
blables, et donnent des résultats pareils. Mayer colore pendant 



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154 CHAPITRE XI 

dix minutes dans une solution à 1/300 ou 400 de bleu de méthylène 
dans de la solution de sel à 0,5 p. 100, lave à la solution de sel et 
monte dans la solution glycérinée de picrate d'ammoniaque citée 
numéro 186. 11 trouve que par ce procédé on peut produire tous les 
effets essentiels d'une imprégnation au nitrate d'argent. Les images 
sont ou bien positives ou bien négatives. Dans les épithéliums stratifiés 
et dans les endothéliums (par exemple dans les canaux testiculaires du 
rat, dans le système vasculaire, dans le muscle lisse), les ciments inter- 
cellulaires sont imprégnés. Dans la cornée, la substance fondamen- 
tale est imprégnée, et Ton obtient des images négatives des cellules 
fixes. De même on obtient quelquefois des images négatives des ter- 
minaisons nerveuses intra-sarcolemmaires des muscles striés des Gre- 
nouilles et des rats. Mais on obtient également quelquefois, comme 
cela arrive aussi pour le nitrate d'argent, des images positives des 
éléments de la cornée. Si Ton a procédé par injection de la couleur 
dans le système vasculaire, ce sont les images positives qui sont les 
plus abondantes ; tandis que si Ton a coloré par immersion, ce sont 
les images négatives qui sont les plus fréquentes. Dans les nerfs à 
myéline, on obtient des images frappantes des figures cruciformes 
des étranglements de Ranvier. 

En somme, presque toutes les images qu'on obtient avec le chlo- 
rure d'or ou avec le nitrate d'argent peuvent être obtenues au moyen 
du bleu de méthylène, et cela avec beaucoup plus de facilité et de 
sûreté. 

Pour les autres emplois spéciaux du bleu de méthylène (organes 
des sens, rétine et terminaisons nerveuses sensitives et motrices, sys- 
tème nerveux central), voir aux chapitres spéciaux de la Deuxième 
Partie. 

B. — Autres colorants plasmatiques 

189. Fuchsine acide (Sœurefuchsin, Fuchsin S., Rubin S., 
Sseurezoïbin, Magenta acide, Magenta S. ; la dénomination de 
€ Patentsàure Rubin > attribuée à cette couleur par Kultschitzky 
{Anat, Anz.y VIII, 1893, p. 357) est une erreur ; le nom de la couleur 
dont s'est servi Kultschitzky est « Rubin S., rein pat. », de la Actieii- 
Gesellschatf, f. Aniliiifabrication à Berlin; \oyez Zeit, f, wiss, mik,^ 
X, 2, 1893, et Anat. Ergeb., III, 1893, p. 18-19). 

Cette matière colorante est le sel de sodium de la rosaniline disul- 
foconjuguée, obtenu par le traitement de la rosaniline par l'acide 
sulfurique concentré. C'est donc une couleur « acide », le principe 



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BLEU DE MÉTHYLÈNE ET AUTRES COLORANTS PLASMATIQUES loo 

colorant de ce sel étant représenté par un corps acide. Tandis que 
dans la fuchsine ordinaire ou fuchsine c basique », qui est le chlor- 
hydrate de la rosaniline considérée comme base, c'est cette base elle- 
même qui est le principe colorant, ce qui fait que cette couleur est 
dite « basique ». 

Cette couleur est très importante, étant un des meilleurs colorants 
plasmatiques, sinon tout à fait le meilleur, de toutes les anilines. Sa 
dissolution dans Teau (elle est peu soluble dans l'alcool) colore rapi- 
dement et énergiquement l'élément plastinien du cytoplasme et du 
caryoplasme, tout en respectant la chromatine. Cette électivité, qui 
peut être très précise, ne s'obtient cependant pas toujours sans l'ob- 
servation de certaines précautions ; un certain degré d'acidité de la 
solution est, paraît-il, souvent une condition nécessaire. (Voyez sur ce 
sujet les mémoires de Martin Heidenhain, Ueber Kern und Proto- 
plasma, 1892, et Neue Untersuchungen, etc., dans Arch. f. mik. 
Anal,, 43, 3, 1894). La coloration résiste fortement au lavage par 
l'alcool. 

La fuchsine acide sert surtout comme colorant plasmatique qu'on 
fait agir après un colorant nucléaire. Pour cet emploi, une solution 
à 0,5 p. 100 convient très bien. On la laisse agir seulement quelques 
minutes, tout en surveillant la marche de la coloration. Elle entre 
comme ingrédient dans plusieurs mélanges de couleurs très employés, 
comme le mélange Ehrlich-Biondi-IIeidenhain. Voyez pour ces procé- 
dés aux Colorations combinées. Elle donne aussi des colorations spé- 
cifiques de fibres nerveuses, nous en parlons dans la Deuxième Partie. 

190. Rouge Congo (Gongoroth; ne pas confondre avec d'autres 
CoDgos, comme le jaune Congo, Congo brillant, etc. Introduit dans la 
technique par Griesbacu, Zeit. f, wiss. Mik., III, 3, 1886, p. 379). Couleur 
azoïque, acide. Sa solution aqueuse a une réaction neutre ou alcaline. C'est 
une des couleurs les mieux tolérées par les cellules vivantes, voyez n° 97. La 
solution, de même que la coloration qu'elle donne aux tissus, sont naturelle- 
ment rouges ; mais la couleur dans les deux cas passe à un beau bleu en 
présence de la moindre trace d'acide (réaction servant à démontrer la pré- 
sence d'acides libres dans les tissus, voyez les travaux cités par Griesbach, 
loc. cil,). 

Je m'en suis servi comme colorant plasmatique avant un colorant 
nucléaire bleu, de la même manière que la fuchsine acide, et j'ai eu de très 
belles préparations. Malheureusement la couleur ne s'est pas consei-vée. 

Pour les colorations spécifiques de fibres nerveuses que donne cette cou- 
leur, voir à la Deuxième Partie. 

191 . Benzopurpurine, benzopurpurine B, et deltapurpurine. 

— Ces trois couleurs sont toutes de proches parentes du rouge Congo 



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156 CHAPITRE XI 

et donnent des colorations rouges assez semblables à celle dé cette 
couleur. Pour la benzopurpurine, voir Griesbach (l. c). Cet auteur la 
recommande comme colorant de contraste à employer après Théma- 
toxyline. C'est un colorant très énergique. On ne doit donc prendre 
qu'une solution extrêmement faible et ne la laisser agir qu'environ 
une minute. ZscH0KKE(i6., V, 4, 1888, p. 466) recommande beaucoup 
pour le môme emploi la benzopurpurine B, à employer de la même 
manière. La deltapurp urine, colorant d'un rouge un peu plus violet, 
peut s'employer de même. On prend une solution aqueuse modéré- 
ment concentrée qu'on laisse agir pendant une minute. (11 s'agit 
naturellement de coupes seulement.) Ces couleurs ont l'avantage de 
résister fortement à l'alcool. 

192. Rouge neutre (Neutralrotu ; Eurlich, Allg, med, Cenlralzeitg., 
1894, 2, p. 20 ; ZeiL f. tviss. MiL, XI, 2, 1894, p. 250 ; Galeotti, ibid,, p. 193). 
Couleur récemment découverte, voisine des safranines par sa constitution 
chimique (Benedikt). On peut se la procurer chez Grubler. N'a été employée 
jusqu'ici que pour des colorations c vitales ». Des têtards tenus dans une 
solution à 1 p 10 000 ou 100 000 en absorbent en un ou deux jours une quan- 
tité telle que tous leurs tissus paraissent d'un rouge foncé. La coloration 
est liée à des granulations cytoplasmiqiies (Ehrlich), ou bien en outre au 
contenu des cellules mucipares (Galeotti). 

193. Les éosines (éosine, tétrabromfluorescéine, éosine 
G, éosin A, éosin GG f, éosine soluble, éosin B, éosin A 
extra, rose Bengale, primerose, érythrosine, pyrosine, 
phloxine, safrosine, rose B él Feau, et d'autres marques). ~- Les 
corps indiqués par ces noms sont tous des phthaléines ; ils ne sont 
pas identiques par leur constitution chimique et leurs propriétés his- 
tologiques, quoique assez semblables. 

Ces éosines sont solubles à l'eau ou à l'alcool, selon l'étiquette. 

L'éosine est un colorant très énergique et très pénétrant, mais 
diffus. 11 est absolument impossible de lui faire fournir une colora- 
tion limitée aux noyaux. Sa principale utilité se trouve dans la pro- 
priété qu'elle possède de se combiner assez heureusement avec d'autres 
colorants plus électifs pour fournir des colorations multiples. Comme 
colorant isolé, cette couleur est entièrement démodée. En consé- 
quence nous nous réserverons d'en traiter au chapitre des Colora- 
tions Combinées. Voir cependant au besoin Fischer {Arch. f. mik. 
Anat.j XII, 1875, p. 349). — Lavdowsky (Arch. f. mik. Anat., XIU, 
1876, p. 3o9). — Éloui, Rech. hist. sur le tissu con. de la coimée, 
Paris, 1881 ; Zeit. f. wiss. Mik., 1, 1884, p. 389) ; et (Rose Bengale) 
Griesbach {Zool.Anz., 1883, p. 172). 



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BLEU DE MÉTHYLÈNE ET AUTRES COLORANTS PLASMATIQUES 157 

194. Le Bordeaux B, le ponceau RR, le Biebricher Scharlach, 
(écarlate de Biebrich, écaHalc impériale) la tropœoline 000 n^ 1, le 
jaune xnétanil, le jaune solide, jaune acide (Echtgelb ou Sâuregelb) 
et l'orange III, sont toutes des couleurs azoïques et acides, sont solubles 
à Teau, résistant suffisamment à Talcool, et possédant une électivité assez 
prononcée pour qu'on puisse les utiliser pour des colorations par la voie 
directe. Ces couleurs paraissent être surtout utiles pour les tissus conjonc- 
tifs et glandulaires. Voir, à ce sujet, les expériences détaillées de Griesbach, 
dans Arch. f. mik. AnaL, XXII, p. i32, et Zeù. f. wiss. MiL, IV, 4, 1887, 
p. 448. 

Tous étant des colorants plus ou moins diffus, ils trouveront surtout leur 
emploi pour des colorations combinées. 

195. L'acide picrique ne s'emploie jamais seul pour les colora- 
lions. Mais, colorant rapide et facile à manier, il peut être très utile 
pour les colorations doubles en combinaison avec une couleur élec- 
tive pour les noyaux. Ainsi, on peut facilement et utilement teindre 
en jaune par une solution alcoolique d'acide picrique des préparations 
colorées par le carmin au borax, le carmin aluné, Thématoxyline, 
sans que la première coloration soit altérée par l'action de l'acide. 
S'agit-il de carmin au borax, il faut savoir que l'acide picrique ne doit 
pas élre dissous dans l'alcool acidulé par l'acide chlorhydrique, vu 
que, en cette combinaison, il agit comme un décolorant énergique. 
Il faut d'abord décolorer par l'alcool à l'acide chlorhydrique, puis 
bien laver, et ensuite colorer dans de l'alcool additionné d'acide 
picrique. 

Il faut noter que l'acide picrique est un colorant plasmatique diffus^ 
il colore tout. C'est un réactif très commode, mais qui ne donnera 
jamais de colorations plasmatiques finement différenciées. 

Voyez aussi au chapitre des Colorations ConibinéeSy n" 229 et 
suivants. 

196. Lichtgrûn P. S. (à traduire vraisemblablement par Vert 
brillant, se le procurer chez GimBLER). — Colorant plasmatique 
important, employé d'après la méthode de Bëxda, q. v., n° 243. 

197. Le vert malachite a été employé par van Beneoen pour la 
coloration de la c sphère attractive >, dans des préparations glycériques. 
Je l'ai essayé pour des préparations à monter au baume, mais sans résultat, 
la couleur ne résistant pas du tout à Talcool. 

Vert d'iode, voyez n* 175, et aussi aux Colorations Combinées. 

La Dinitrosoresorcine (EciiTGRiiN, Vert solide, Vert d'Alsace, 
Resorcin Green), voyez la méthode de Platner pour les gaines de myé- 
line. 

Vert thiophène, voyez Krause, Inlern. Monatsschr. f. Aiiai., etc., IV, 
1887, H. 2. 



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158 guâpitre XI 

Le Vert d'aniline aurait une électivité spécifique pour les cellules mu- 
cipares. Nous y reviendrons dans le chapitre des Coloraltons Combinées, et 
dans la Deuxième Partie. 

198. Bleu de quinoléine (Ghinolinblau ; Cyanine) (Ranvier; 
Traité Technique^ p. 102). — La meilleure manière d'employer cette subs- 
tance est de la faire dissoudre dans Talcool à d6<^ B. ; on étend la solution 
d'une partie d'eau. Il faut se garder d'ajouter Teau tout de suite, car le 
bleu ne s'y dissoudrait pas. Ce bleu a une grande puissance colorante, et il 
faut l'employer en solutions très faibles. 

Après coloration, on lave à l'eau et l'on monte dans la glycérine. Au 
début, on voit les noyaux colorés en violet, les autres éléments des tissus 
en divers tons de bleu ou bleu gris. Mais, vingt-quatre heures après, on 
remarque que les noyaux sont décolorés ; le protoplasma reste bleu, et 
dans son intérieur apparaissent des granulations d*un bleu intense. Ces 
granulations sont formées par des matières grasses du protoplasma décom- 
posées par l'action lente de la glycérine. Cette coloration intense par le 
bleu de quinoléine appartient en elTet spécialement à la graisse. Elle se 
montre non seulement sur la graisse qui est contenue dans les cellules adi- 
peuses, les cellules du foie, etc., mais encore sur celle qui apparaît au mo- 
ment de la digestion dans les cellules épithéliales de l'intestin. 

Si l'on soumet les préparations colorées k l'action de la potasse à 40 p. 100, 
l'élection de la matière colorante est immédiate. 

La solution aqueuse de quinoléine sert à colorer les Infusoires, soit morts, 
soit vivants. Nous parlons de ces réactions dans le paragraphe consacré à 
la méthode de Certes, au chapitre des Protozoaires, 

199. Violet B (S. Mayer; 5t7j6. d. L Akad. d. Wiss., III Ablh., 1882, 
Feb.). — Ce violet est un violet de méthyle, préparé par Bindschedler et 
Busch à Bàle, et par l'Actien-fabrik fur Anilinfarben à Berlin (Ilallesches 
Thor). — Mayer fait une solution avec 1 gramme de violet et 300 grammes 
de solution de chlorure de sodium à 0,5 p. 100. Il emploie des tissus abso- 
lument frais, n'ayant été traités par aucun réactif. Ils se colorent en quelques 
secondes. La coloration est élective pour tous les éléments constitutifs du sys- 
tème vasculaire, à tel point que des préparations d'objets|favorables (mem- 
branes séreuses) présentent l'apparence de pièces injectées et sont même 
supérieures à celles-ci sous bien des rapports pour des études angiologiques. 
11 est très difficile de conserver les préparations ; l'acétate de potasse donne 
les résultais les moins mauvais. 

200. Bleu d'anillQe. — C'est le bleu de rosaniline, dont les diverses 
nuances (mélanges des divers produits de fabrication plus ou moins purs) 
sont connues sous les marques Bleu alcool, Bleu gentiane 6B, Spirit- 
blue 0, Bleu opal. Bleu de nuit, Bleu lumière. Bleu de Parme 

(Benedikt), Bleu de Lyon (Gierke). Couleurs basiques. Ce sont en somme 
des colorants diffus. Le bleu de Parme (Frey) et le bleu d'aniline (IIeiden- 
hain) ont été emplo3'és dans le temps pour donner des colorations générali- 
sées, et le bleu lumière a été employé comme colorant plasmalique. Le 
Bleu de Lyon passe pour réserver les noyaux. 
D'après Mercier {Les coupes du système nerveux^ p. 180), celle couleur 



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BLEU DE MÉTHYLÈNE ET AUTRES COLORANTS PLASMATIQUES 159 

serait le chlorure de triphénylrosaniliae, et ne se fabriquerait plus, ayaat 
été remplacé dans Tindustrie par le bleu de toluidine, ou bleu de Parme. 

201. Bleu de méthyle. — Sous ce titre sont compris des dérivés 
phénylés trisulfoconjugués de rosaniline, couleurs en conséquence 
acides. Elles portent les marques : bleu de méthyle, bleu coton, 
TVasserblau (^water-blue, méthyl ^water-blue), bleu de Chine, 
Ghina-blau, China blue), bleu soluble, etc. 

Parmi ces marques le TVasserblau paraît posséder des propriétés 
assez importantes. D'après Mitrophanow, qui l'a introduite dans la 
technique {Ob organach scheslago schustwa uamfibij, Warscuawa, 
1888 ; cité d'après Zeit. f. wiss. Mik,^ V, 4, 1888, p. 813), cette couleur 
aurait les propriétés suivantes. — La solution concentrée dans Teau 
donne de très bons résultats en coloration double avec la safranine. 
La couleur est fort peu extraite par Talcool. Le cytoplasme est coloré 
d'une façon énergique et élective. Mann {ibid.^ XI, 4, 1094, p. 490) 
Ta employée en combinaison avec l'éosine pour la coloration de 
cellules ganglionnaires. Pour les détails un peu compliqués du pro- 
cédé, voyez le travail cité. 

Le Bleu de Chine a été employé par Galli pour des recherches sur la 
structure des gaines de myéline, voyez à la Deuxième Partie. 

202. Les Indulines. — Couleurs basiques, étant des dérivés de la base 
violaniline. Elles comprennent les marques Induline, Nigrosine, Indi- 
gène, Bleu de Coupler, Bleu noir, Fast blue, Blackley blue, 
Bengaline, Guemsey blue. Indigo artificiel, Indigo Substitute. 

L*induline est une marque bleuâtre, la nigrosine une marque plus noire 
(Beiirens). 

D'après Calberla {Morph, Jahrb,, 111, 1877, p. 627), Vindulvie peut se 
dissoudre dans l'eau chaude ou dans l'alcool dilué. Pour colorer, on étend 
la solution aqueuse concentrée de six volumes d'eau. Les coupes s'y 
colorent en cinq à vingt minutes ; on les traite par l'eau suivie de glycérine, 
ou par l'alcool suivi d'essence de girofle. 

Cette teinture, de même que la, quinoléine, a la particularité de ne jamais 
colorer les noyaux ; les autres élièmenls des tissus se colorent en un beau 
bleu. 

La Nigrosine a été considérée plus haut, n^ 172. Nous aurons encore à 
en parler au chapitre des Colorations Combinées. 

203. La couleur dite a Aniline Blue-Black » a été préconisée par 
Bevan Lewis et d'autres pour des colorations du système nerveux central. 
Malheureusement ces auteurs n'ayant pas précisé de quelle couleur il s'agit 
nous ne pouvons dire si c'est le Blue-Black de la série des couleurs 
azoïques, couleur très voisine du noir naphtol, ou si c'est le noir d'aniline 
de Lightfoot, connu aussi sous les noms de noir de Colin, nigraniline 
(Gierke). Pour l'emploi, voyez Centres neigeux. 



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CHAPITRE XI 



204. Le Bleu carmin (breveté Meister, Lucius et BriîDig, à Hochst 
a. M.) serait aussi si j'ai bien compris une couleur azoïque. Janssens [La 
Cellule. IX, I, 1893, p. 9) a démontré qu'il a une éleclivité spéciale pour les 
parties du protoplasma qui subissent la différenciation cuticulaire. Janssens 
remploie le plus souvent en solution alcoolique additionnée de 2 à 3 gouttes 
d'un acide (e. ^., HCl) par 100 ce. On peut monter au baume. 

204 bis. La francéine (Léon, Zoo^ Anz,^ 1895, p. 160). — D'après 
ce qu'en dit Léon, ce nouveau corps colorant serait parfaitement 
superflu. 



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CHAPITRE XII 

DES IMPRÉGNATIONS 



205. Les imprégnations sont des colorations produites, non 
comme dans les teintures par l'assimilation par les tissus d'une 
matière colorante et elle-même colorée, qui préexiste telle quelle 
dans le liquide colorant, mais bien par la formation au sein des 
éléments des tissus de dépôts d'un métal ou autre corps à l'état de 
division très Une, dépôts formés sur place par les énergies chimiques 
des tissus aidées par Taction d'agents réducteurs, qui ensemble réus- 
sissent à séparer ces corps de la combinaison soluble — généralement 
un sel — sous forme de laquelle ils ont été apportés au sein des 
tissus. 

Ces dépôts sont, pour la plupart, des métaux réduits de leurs sels 
solubles ; nous aurons à étudier : l'or, Targent, Tosmium, le palla- 
dium, le fer, et quelques autres corps moins importants. Nous signa- 
lons de suite l'argent et Tor comme étant de beaucoup les plus 
importants de ces corps. Les imprégnations à Targent donnent des 
colorations d'une électivité remarquable, car elles n'exercent en 
général leur eflet que sur les substances inter cellulaires, les cellules 
étant totalement réservées; c'est le contre-pied absolu des teintures. 
L*or montre une électivité très prononcée pour les éléments nerveux, 
et devient par cela d'une importance capitale. Mais les autres agonis 
d'imprégnation donnent plutôt des colorations plus ou moins généra- 
lisées, de sorte qu'au point de vue de leurs effets ils se rapprochent 
plutôt des teintures que de l'argent et de l'or. 

206. Imprégnations négatives et positives. — On obtient, 
selon la manière dont on fait agir l'agent d'imprégnation, deux sortes 
de colorations. Ce sont: les imprégnations négatives, dans lesquelles 

AXAT. UlCROSC. 11 



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162 CHAPITRE XU 

les substances intercellulaires seules sont colorées, les cellules étant 
ménagées en clair ou incolores; et les imprégnations positives, dans 
lesquelles les espaces intercellulaires se montrent incolores, et les 
cellules sont teintées par un précipité granuleux. L'imprégnation 
négative est celle qu'on cherche à réaliser en général, dans le but de 
démontrer des contours de cellules, de limiter des espaces intercellu- 
laires, de faire ressortir des espaces lacunaires, de fîns canaux lym- 
phatiques, etc. L'imprégnation négative est primaire, c'est-à-dire 
qu'elle a lieu parla réduction immédiate de l'argent dans les espaces 
intercellulaires qu'il colore; l'imprégnation positive est secondaire^ 
car elle a lieu & la suite de la dissolution dans les liquides des tissus 
du dépôt métallique qui forme l'imprégnation négative, et de l'imbi- 
bition conséquente des cellules par la nouvelle solution de sel métal- 
lique ainsi formée. Les imprégnations secondaires se forment quand 
la réduction du métal, lors de l'imprégnation primaire, n'est pas 
suffisamment énergique. (His, Schweizer Zeitsch. f. Heilk. II, Hft I, 
p. 1 ; GiERKE, Zeit. /*. wiss, Mik., I, p. 393 ; Ranvier, Traité technique^ 
p. 107.) 

207. Natare du dépôt métallique. — 11 règne encore une assez 
grande obscurité sur la nature du dépôt brun ou noir qui se forme dans 
les espaces intercellulaires lors de Timprégnation primaire. V. Recklinghau- 
SEN pensait, pour le cas du nitrate d'argent, que le sel argentique formait 
avec un ciment interceliulaire hypothétique (Kitlsubstanz) un composé qui 
noircit par Faction de la lumière. D'autres auteurs se sont refusés à. croire 
au ciment intercellulaire, et pensent, les uns, que ce sont les membranes 
cellulaires qui se colorent, les autres, que le nitrate entre en combinaison 
avec les liquides albumineux et salins qui baignent les cellules, et se préci- 
pite dans de simples rigoles intercellulaires. Schwalbe {Arch. f, mik, Anat,, 
Yi, 1870, p. 5) pense qu'il y a lieu de distinguer deux processus : les lignes 
noires résultant de l'action, pendant un temps très court, de solutions très 
faibles de nitrate d'argent, seraient dues à un précipité véritable formé par 
réduction du métal dans le liquide intercellulaire; tandis que les lignes 
brunes qu'on obtient en exposant les tissus, pendant un temps plus consi- 
dérable, à l'action de solutions plus concentrées résulteraient de la forma- 
tion d'une combinaison de l'argent et du ciment intercellulaire, combinai- 
son qui brunit à la lumière. (Voyez, pour tout l'historique des imprégnations, 
GiERKE : Fœrbei'ei zu mikroskopiscken Zwecken.) Selon Joseph {Sitzb, d. L 
preuss» Akad, d. wiss. Berlin, 1888; cité d'après Zeit. f, wiss. Mik., XI, I, 
1894, p. 43 et seq.) le précipité ne saurait en aucun cas être de l'argent 
métallique (car il se dissout dans Thyposulfite de soude), mais il pourrait 
être un albumino-nitrate, ou un oxyde d'argent. 

208. Conservation des solutions métalliques. — On a cou* 
tume de conserver soigneusement à l'abri de la lumière les solutions 



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DES IMPRÉGNATIONS 163 

de sels mélalliques employées pour les imprégnations. Cette pratique 
repose sur la croyance que l'action de la lumière sufQt pour réduire les 
sels dissous et précipiter les solutions. Nous avons déjà expliqué que 
quant à l'acide osmique en tout cas (n** 35) cette croyance est erronée, 
et que la réduction en ce cas provient non de la lumière, mais de la 
poussière. Il y a des motifs pour croire qu'il en est ainsi des solutions 
de la plupart des sels des métaux lourds. Mon savant ami le 
D^'LiNDSAY Johnson, autorisé au double titre d'histologiste et de photo- 
graphe, a fait de nombreuses expériences à ce sujet. Il me dit : c On 
peut énoncer comme règle, sans exception, que les solutions des 
chlorures et des nitrates de tous les métaux lourds se conservent 
indéfiniment dans des flacons de verre blanc bouchés à l'émeri et 
exposés à la lumière directe du soleil. Pour ce qui regarde les sels 
d'osmium, d'uranium, d'or et d'argent, leurs solutions bénéficient par 
l'insolation, laquelle les mûrit. C'est là du reste un fait bien connu 
des photographes. » Surtout pour le chlorure d'or serait-il très impor- 
tant, selon L. Johnson, de n'employer que des solutions bien mûries 
par insolation. 

208 his, État des tissus. — Contrairement à ce qui a lieu dans 
les teintures, les tissus /ra/^, c'est-à-dire vivants ou du moins n'ayant 
été traités par axACun réactifs sont ceux qui se laissent imprégner par 
les métaux avec le plus de facilité et le plus de précision. La plupart 
des imprégnations ne pewoent réussir ({xi'dky te des tissus parfaitement 
frais dans le sens que nous avons dit. 

A. Argent 

209. Méthode générale de Ranvier au nitrate d'argent. — 

Nous empruntons au Traité technique de Ranmer (p. 105) les géné- 
ralités suivantes sur l'emploi du nitrate d'argent. 

Le nitrate d'argent peut être employé en solution ou à l'état solide. 
Ce dernier procédé, qui est le moins usité, est cependant d'une appli- 
cation simple, et fournit de bonnes préparations. On s'en sert avec 
avantage pour la cornée et le tissu fibreux ; il ne convient pas pour 
les épithéliums. 

Pour la cornée par exemple, voici comment on procède : l'œil étant 
enlevé, un morceau de nitrate d'argent est passé rapidement sur la 
surface antérieure de la membrane restée en place. La cornée est 
détachée et placée dans l'eau distillée ; l'épithélium est chassé avec 
le pinceau. Le nitrate d'argent, dissous par le liquide qui baigne la 



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^164 CHAPITRE XII 

cornée, a Iraversé la couche épithe'liale et est venu se réduire sur le 
tissu fibreux, qu'il colore après l'action de la lumière. Les cellules, 
au contraire, sont ménagées par Targent et restent incolores. 

Le nitrate d'argent est plus fréquemment employé en solution. On 
fait généralement usage de la solution à 1 centième, à laquelle cepen- 
dant on ajoute 2, 3 ou 4 parties d'eau, selon les cas. Pour se servir 
de ces solutions, il y a plusieurs méthodes; il faut les suivre exacte- 
ment et employer toutes les précautions indiquées, si l'on veut éviter 
les erreurs. 

Ainsi pour une membrane telle que l'épiploon, il faut la tendre, 
comme la peau d'un tambour, sur un baquet de porcelaine (ou, ce 
qui est mieux, sur les < anneaux histôlogiques > des Hoggan*), et 
l'arroser avec une pipette remplie d'eau distillée pour la nettoyer des 
albuminates et des globules blancs qui peuvent être à sa surface ; puis 
on l'arrose avec une solution de nitrate d'argent. Pour obtenir des 
imprégnations vives, il est nécessaire que cette opération se fasse au 
soleil ou du moins à une lumière éclatante. Dès que le tissu blanchit 
et qu'il commence à passer au gris noirâtre, la membrane est déta- 
chée et portée dans l'eau distillée ; après avoir été lavée, elle est 
placée immédiatement sur la lame de verre et peut être examinée ou 
Innontée en préparation définitive selon les méthodes connues. 

Si on la laissait séjourner dans l'eau distillée, les cellules se déta- 
cheraient et on ne les verrait plus. 

Si la membrane n'était pas bien tendue, l'argent se déposerait non 
seulement dans les espaces intereellulaires, mais partout où il y aurait 
le plus léger pli, et l'on ne pourrait plus se rendre compte de la 
forme des cellules. 

Enfin, si la membrane n'était pas arrosée avec de l'eau distillée 
avant de l'imprégner, partout où il y aurait eu un fragment d'albu- 
minate, il se formerait un dépôt d'argent, et l'on croirait voir quelque 
disposition normale du tissu. C'est ainsi bien souvent que des sto- 
mates ont été décrits, tandis que ce n'étaient que des impuretés de 
la préparation. 



* Les anneaux ou tambours histôlogiques imaginés par les IIoggan sont des 
anneaux de caoutchouc légèrement coniques qui entrent à frottement Tun dans 
l'autre et permettent facilement de pincer et maintenir tendue une portion de 
membrane pendant toutes les manipulations. On trouvera une description de ce 
petit appareil très utile dans le Journal de VAnatomie de Robin, 1879, p. 54. 
L'appareil est fourni par Burge and Warrex, 42, Kirby street, Hatlon Garden, 
London, E. C, à raison de 10 shillings les douze paires. On en trouvera égale- 
ment, construits d'après les indications d'ETERNon (Zeit. f, wiss. Mik., IV, 1, 1887, 
p. 39) chez Demaurex, bandagiste, Fusterie, Genève* 



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DES IMPRÉGNATIONS 165 

On peut modifier la marche à suivre pour les imprégnations, à 
condition d'observer les précautions nécessaires pour éviter les causes 
d'erreurs que nous avons indiquées. Ainsi, au lieu de tendre un tissu 
et de Tarroser, on peut l'imprégner par immersion, en ayant soin de 
Yagiter continuellement dans la solution et en faisant bien attention 
qu'il ne se forme pas de plis dans la préparation. 

Ces imprégnations ne réussissent qu'avec des tissics frais, c'est-à- 
dire qui n'ont été traités par aucun réactif. 

210. Solutions àr employer. — Les solutions de nitrate d'ar- 
gent doivent être d'une certaine concentration, qui peut varier selon 
les cas, mais qu'il est important de connaître. < Si la solution est trop 
faible, par exemple à 1 p. 800 ou 1 p. 1000, ou si la lumière n'est 
pas vive, il se produit une coloration plus ou moins forte de l'ensemble 
des tissus, et tout autrement répartie que l'imprégnation. Ce sont les 
noyaux des cellules qui sont le plus colorés, puis le protoplasma, 
tandis que la substance intercellulaire ne contient que très peu d'ar- 
gent. » (Ranvier.) 

Les solutions employées par Ranviër varient entre 1 p. 300 et 
1 p. 500. La concentration de 1 p. 300 sert pour l'épiploon, Tendothé- 
lium pulmonaire, le cartilage et les tendons, tandis que la solution 
à i p. 800 s'emploie pour le centre phrénique et pour Tépithélium 
intestinal. Pour l'imprégnation de l'endothélium des vaisseaux san- 
guins par voie d'injection, Ranvieu prend des solutions de 1 p. 800 
ou 1 p. 800. 

Y. Reorlinguausen prenait, pour la cornée, une concentration variant 
«ntre 1 p. 400et-4 p. ^00 (I>ie Lymphgefœsse, etc., Rerlin, 18(52, p. 8). 

RoBïNSKi {Arch, de Physiol., 1869, p. 481) se sert de solutions variant 
entre 0,1 et 0,2 p. 100, qu'il laisse agir pendant trente secondes. 

Reicu {Siizher, d. Wien. Acad,, 1873,111 Abth, Aprilheft: Gïerrk, 
ZeiLf, Wiss, Mik., I, p. 397) emploie, pour l'étude de Fendothélium 
des vaisseaux par injection, des solutions de 1 p. 600 à 1 p. 400. 

Rouget {Arch. de PhysioL, 1873, p. 603) employait des solutions 
diluées jusqu'à 1 p. 780 ou 1 p. 1000, qu*il faisait agir à plusieurs 
reprises pendant trois à cinq secondes, en lavant par l'eau après 
chaque immersion. 

Les Hertwig prennent, pour les animaux marins, une solution à 
4 p. 100 {Jen. Zeitsch. f. NaL, XVI, p. 313 et 324: Gierke, loc. cit.). 

Les Hoggan [Jowm. of Anal, and Physiol., XV, 1881, p. 477) 
prennent, pour les lymphatiques, une concentration de 1 p. 100. 

TouRNEuxet HERMANN(yott^7iaZrf<?i'.lna/omee,1876, p. 200) se sont 



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166 CHAPITRE XII 

servis, dans leurs belles recherches sur les épithéliums des Invertébrés, 
de solutions à 3 millièmes ; quelquefois de solutions plus faibles. Ils 
laissaient les tissus dans les solutions pendant une heure, puis les 
lavaient avec de Talcool à 36 degrés B. 

DuvAL {Précis, p. 229) recommande, pour l'emploi général, des 
solutions de 1 centième, de 2 centièmes et quelquefois 3 centièmes. 

HoYER {Arch. f. Mik. AnaL, 1876, p. 649) recommande de prendre 
une solution de nitrate d'argent d'une concentration connue, et 
d'ajouter de Tammoniaque jusqu'à ce que le précipité s'y redissolve à 
peine, puis d'allonger la solution jusqu'à ce qu'elle contienne 0,78 à 
0,5 p. 100 de nitrate. 

Cette solution sert principalement pour les imprégnations de l'en- 
dothélium des vaisseaux par injection, mais elle peut aussi servir pour 
l'imprégnation des membranes par arrosage. Elle a l'avantage de 
n imprégner absolument que Fendothélium ou épithélium; le tissu 
conjonctif y demeure incolore. Elle donne, d'une manière générale, 
des localisations plus nettes que les solutions ordinaires. 

Dekhoysen {A7iat. Anz., IV, 1889, p. 789; ZeiL /*. wiss, Mik,, VII, 
3, 1890, p. 381) a trouvé utile d'appliquer aux animaux terrestres la 
méthode imaginée par Harmer (N^ 213J pour les. animaux marins. On 
lave une portion de mésentère de grenouille dans une solution de 
nitrate de potasse à 1. 3 p. 100, puis on la met pour 3 à 6 minutes 
dans une solution de nitrate d'argent à 0.28 p. 100 additionnée de 
3 p. 100 d'acide nitrique. On la met ensuite pour quelques minutes 
dans de l'acide nitrique pur à 3 p. 100, puis on passe par l'alcool 
à 96 p. 100 à l'essence de girofle, dans laquelle la réduction s'efl*ectue 
en quelques minutes à la lumière diffuse. 

211. La réduction peut s'elTectuer dans bien des liquides autres 
que l'eau distillée. 

Reckunghausen lavait ses préparations dans une solution de chlo- 
rure de sodium avant de les exposer à la lumière dans l'eau distillée 
{Arch. f. paih. Anal,, XIX, p. 481). On se sert encore aujourd'hui 
très communément de la solution physiologique de sel (0,78 p. 100) 
pour ces. lavages. 

MûLLER {Arch, f.path. Anal., XXXI, p. 110), après avoir imprégné 
par immersion pendant deux ou trois minutes dans une solution de 
nitrate d'argent à 1 centième, dans l'obscurité, ajoute à la solution 
une petite quantité de solution à p. 100 d'iodure d'argent (dissous à 
l'aide de l'addition d'une faible proportion d'iodure de potassium). 
Après agitation dans ce mélange, la préparation est lavée à l'eau dis- 



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DES IMPRÉGNATIONS 167 

tillée et exposée à la lumière pendant deux jours dans une solution 
à 0,1 p. 100 de nitrate d'argent. (Nous citons d'après Gierke, dans 
ZeiL f.wiss. Mik., I, p. 396.) 

Legros {Joum. de VAnatomie, 1868, p. î275) lave ses préparations 
dans une solution d'hyposulfîte de soude, ce qui a pour effet de les 
empêcher de noircir par la suite. Selon Duval, on doit faire le lavage 
pendant quelques secondes seulementdans une solution à 2 centièmes, 
après quoi on lave à Teau distillée. 

Rouget {Arch. de PhysioL, 1873, p. 603) fait la réduction dans le 
glycérine. 

Sattler {Arch, f, mik, Anat,, XXI, p. 672) expose à la lumière 
pendant quelques minutes dans de Teau acidulée par Tacide acé- 
tique ou formique. Thanhoffer recommande cette méthode. Il em- 
ploie une solution d*acide acétique à 2 centièmes {Das Afikroskop, 
1880). 

Krausb porte ses préparations, après lavage, dans une solution de 
permanganate de potasse, qui doit-être d'un rouge clair. La réduction 
s'y fait très rapidement, même dans Tobscurité. On peut aussi mélan- 
ger les deux solutions. La méthode ne réussit pas toujours. (Gierke, 
ZeiL f. wiss. Mik,, I, 1884, p. 400.) 

Oppitz lave ses préparations pendant deux à trois minutes dans une 
solution à C,25 ou à 0,5 p. 100 de chlorure d'étain. La réduction s'y 
fait très vite. (Gierke, loc. cit,). 

Jakimovitcu {Joum. de VAnat,, XXIII, 1888, p. 142) met ses objets 
(préparations nerveuses) aussitôt qu'ils sont devenus bruns, dans un 
mélange de 1 partie d'acide formique, 1 partie d'alcool amylique, et 
100 parties d'eau. Les objets étant exposés à la lumière dans ce mé- 
lange pendant deux ou trois jours prennent d'abord un ton plus clair 
ensuite de la dissolution d'une partie de l'argent réduit. 11 faut donc 
renouveler le mélange de temps à autre. Lorsque tout l'argent est 
redissous, les tissus prennent définitivement un ton plus foncé. Il faut 
pour cela de cinq à sept jours. 

212. Autres sels d'argent. — Le nitrate n'est pas le seul sel d'argent 
utilisable pour les imprégnations. 

Alferow {Arch, de PhysioL, 1874; Lab, d'Hist, du Collège de France, 1874, 
p. 258 ; Duval, Précis, p. 230) recommande les sels solubles des acides 
organiques, tels que le picrate, le laclale, Tacélate et le citrate d'argent, 
comme donnant de meilleurs résultats que le nitrate. Il se sert de solutions 
à 1/800, auxquelles il ajoute une faible proportion de l'acide du sel, 40 à 
15 gouttes de solution concentrée de l'acide pour 800 ce. de la solution du 
sel. Le but de l'addition de l'acide libre est de décomposer les précipités for- 
més par Taclion du sel d'argent sur les chlorures, carbonates et autres 



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168 



CHAPItRE Xll 



combinaisons existant dans les tissus^ en respectant Talbuminate, qui est 
un composé plus résistant. 

Nous avons déjà parlé de Tiodure d'argent de MiiLLER au paragraphe 
précédent. 

213. Imprégnation des animaux marins par Targent. — A 

cause de la quantité considérable de chlorures qui baignent les tissus 
des animaux marins, on ne peut pas les traiter directement par le 
nitrate d'argent. 

Hertwig {Jen, Zeitsch.^ XIV, 1880, p. 324) recommande de les fixer 
d'abord par Tacide osmique en solution faible, puis de laver à Teau 
distillée jusqu'à ce que l'eau de lavage ne donne plus qu'un précipité 
insignifiant avec la solution de nitrate d'argent, enfin de les traiter 
pendant six minutes avec une solution de nitrate d'argent à 1 p. 100. 

Ransom a proposé l'emploi, au lieu d'eau distillée, d'une solution 
d'un sel neutre qui ne se précipite pas par le nitrate d'argent, et qui 
soit de la même densité que l'eau de mer. 

Harmer {Afitth. Zool. Slat. Neapel, V, 1884, p. 44-56) a mis à pro- 
fit ce conseil pour l'élude du Loxosoma et de la Pedicellina. Ces ani- 
maux peuvent vivre pendant une demi-heure dans une solution de 
5 p. 100 de nitrate de potasse dans l'eau distillée. Par ce moyen, il 
est facile de les débarrasser de la majeure partie de leurs chlorures, 
et il ne reste qu'à les transporter directement dans une solution de 
nitrate d'argent. Cette méthode donne de bons résultats avec l'épiderme 
des Méduses, des Hydraires, de la Sagitla^ et des Appendiculaires. 
VosMAER a pu par ce moyen mettre en évidence répithélium de la 
Chondrosia et de la Thenea, épithélium que Sollas n'avait pas pu 
apercevoir ; et Meyer a obtenu de bons résultats avec des Annélides 
et des œufs de Téléostéens. Peu d'animaux résistent aussi bien que 
les Loxosoma et Pedicellina à l'action du nitrate de potasse, mais ils 
y meurent au bout de quelques minutes. Cependant leurs tissus y 
éprouvent peu de changement, et fournissent en général de bonnes 
imprégnations. Harmer pense que pources animaux on pourrait subs- 
tituer d'autres sels au nitrate de potasse ; il conseille une solution à 
4,5 p. 100 de sulfate de soude. 

214. Coloration double des tissus imprégnés, par teinture ou 
imprégnation. — Des tissus convenablement imprégnés par l'argent 
peuvent être utilement traités par la suite par Tun ou par Tautre des colo- 
rants des noyaux. On peut employer à cet eflet le carmin ou l'hématoxyline 
ou n^importe quelle teinture, à condition d'éviter les solutions contenant 
de l'ammoniaque libre, qui redissoudrait le dépôt d'argent. Et il faut obser- 
ver que la coloration des noyaux ne peut avoir lieu que pour lesimprégna- 



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DES IMPRÉGNATIONS i69 

lions négatives bien réussies, c'est-à-dire celles qui ont ménagé les noyaux ; 
les noyaux qui ont été imprégnés par un métal ne se colorant plus dans les 
teintures. 

On peut aussi faire suivre l'imprégnation à Targent par Timprégnation à 
For. En ce cas, Tor parait en général se substituer à l'argent dans les tissus ; 
les résultats sont très précis, mais ne produisent pas TefTet d'une coloratioD 
double. 

215. Imprégnation de tissus nerveux durcis. — Les importantes 
méthodes de Golgi et autres pour les imprégnations au chromate d'argent, 
etc., seront exposées dans la Deuxième Partie. 

v, B. Or 

216. Caractères des Imprégnations par l'Or. — Le chlo- 
rure d'or est un réactif qui diffère du nitrate d'argent en ce qu'il ne 
fournit guère que des imprégnations positives. Il ne produit, à ce 
que nous croyons, des images négatives que quand on le fait agir 
sur des tissus ayant déjà reçu l'imprégnation négative par l'argent 
auquel il se substitue. Pour obtenir ces imprégnations, on imprègne 
à l'argent, très légèrement, on réduit, on traite les préparations pen- 
dant quelques minutes avec une solution de chlorure d'or à 0,8 p. 400, 
et on fait la réduction dans l'eau distillée acidulée. 

L'emploi du chlorure d*or est indispensable dans maintes recherches 
sur les organes nerveux, sur les tissus conjonctifs et sur la cornée. Il 
faut reconnaître que pour tous ces objets il est capable de donner des 
préparations qui ne peuvent pas être surpassées pour la clarté et la 
beauté. Mais les résultats qu'il donne sont toujours sujets à beaucoup 
d'incertitude ; la même méthode, ponctuellement suivie, avec le même 
objet, donne souvent des résultats différents. L'imbibilion des tissus, 
les effets chimiques qui s'ensuivent, la réduction du métal, sont tous 
autant de processus au sujet desquels il règne une grande obscurité, 
et qui sont éminemment variables. De sorte que les préparations qui 
paraissent le mieux réussies ne méritent pas même une confiance 
absolue, et il est urgent de contrôler par des préparations, faites par 
d'autres méthodes, les images souvent trop séduisantes et trop belles 
qu'elles fournissent. 

C'est surtout pour le tissu nerveux que le chlorure d'or déploie une 
électivilé remarquable, qui en fait un réactif précieux pour l'étude 
de la structure et de la distribution des nerfs et de leurs organes ter- 
minaux. 

Les procédés très nombreux qui sont employés pour l'imprégnation 
par l'or peuvent se (Jiviser en deux groupes : l'un, s'appliquant à 



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170 CHAPITRE XII 

l'étude des nerfs périphériques et de leurs organes terminaux, est 
caractérisé par remploi de tissus frais ou ayant subi un traitement 
spécial par des acides organiques ; — et Tautre, s'appliquant à l'étude 
du système nerveux central, est caractérisé par remploi de tissus 
durcis selon les méthodes usuelles. L'exposition de ce dernier groupe 
de procédés trouvera sa place indiquée dans la Deuxième Partie. Le 
détail en grande partie des procédés du premier groupe y trouvera 
également sa place naturelle : et ici nous ne ferons qu'exposer d'une 
façon un peu généralisée les principes de Tart d'imprégnation des 
tissus frais. 

217. Solutions & employer. — L'imprégnation se fait en général 
au moyen de solutions de culorure d'or simple, aux titres que nous 
indiquons dans les paragraphes spéciaux. Selon quelques auteurs, il y 
aurait utilité à employer, au lieu du chlorure d'or simple, les sels 
doubles : chlorure d'or et de potassium, de sodium ou de cadmium. 
L'avantage de ces sels consisterait en ce qu'ils sont plus neutres, que 
leurs solutions sont plus stables, et que le commerce en fournit plus 
facilement des échantillons de composition définie. On les emploie 
aux mêmes doses et de la même manière que le sel simple. Voici une 
indication se rapportant à celte question que nous avons trouvée dans 
un auteur des plus compétents à l'égard de la chimie des réactifs his- 
tologiques (Squire, Methods and formulœ, etc., p. 43) : 

€ Le chlorure d'or du commerce n'est pas le chlorure pur. Au Cl'^ 
mais le chlorure double cristallisé d'or et de sodium, contenant 
50 p. 100 d'or métallique. » 

€ Le chlorure double d'or et de sodium du commerce est le chlo- 
rure double sus-dit mêlé à un poids égal de chlorure de sodium, et 
contient 25 p. 100 d'or métallique. » 

Conservation des solutions. — Nous rappelons ce qui a été dit à ce 
sujet au n® 208. L. Johnson écrit en outre qu'il est bon de prendre 
aussi les précautions suivantes : — Les tissus doivent être bien lavés 
à l'eau distillée ; la solution, après insolation, doit être soigneusement 
acidifiée par addition d'un acétate ou formiate neutre, ou d'acide 
acétique ou formique ; et après imprégnation, les tissus doivent être 
lavés jusqu'à ce qu'ils ne donnent plus de réaction au papier de tour- 
nesol. 

218. État des tissus & imprégner — La règle classique est 
que, surtout pour des recherches sur des terminaisons nerveuses, les 
tissus doivent être aussi frais que possible. Cependant^ Drascu (cité 



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DES IMPRÉGNATIONS 171 

d'après Zeit. f. wiss. Mik.^ IV, 4, 1887, p. 492) trouve qu'on obtient 
de meilleurs résultats avec des tissus qui ont été gardés, en un endroit 
frais, pendant douze, vingt-quatre, ou même quarante-huit heures 
après la mort. Il soupçonne même qu'une principale fonction de l'acide 
organique des procédés qui s'inspirent de la méthode de Lowit est 
d'amener arlîQciellement les tissus à un certain état dans lequel ils 
se trouvent naturellement à un moment donné des processus post 
mortem, état dans lequel les nerfs auraient acquis une susceptibilité 
spéciale à s'imprégner de l'or. 

219. Méthode de Gohnheim — L'archétype des procédés qui 
consistent à faire agir une solution de chlorure d'or directement sur 
des tissus frais se trouve dans la méthode classique de CouNifiiu 
{Virchow's Archiv,, XXXVIII, 1866, p. 346-349; Strickers Handb., 
p. 1100). Des fragments de tissu frais sont mis pendant quelques 
minutes, c'est-à-dire jusqu'à ce qu'ils deviennent franchement jaunes — 
dans une solution à 0,5 p. 100 de chlorure d'or, puis ils sont exposés 
à la lumière dans de l'eau acidulée par l'acide acétique, jusqu'à réduc- 
tion de l'or, ce qui arrive plus ou moins vite, au plus tard au bout de 
quelques jours. Cette méthode donne des imprégnations positives des 
cellules de divers tissus qui sont souvent extrêmement belles, mais 
d'une électivité peu prononcée, et les résultats sont très variables. 

220. Méthode de Lôwit. — Le besoin s'étant fait sentir, surtout 
dans les recherches sur les terminaisons nerveuses, de faciliter la 
pénétration et la réduction de l'or, Lôwit imagina la méthode de 
traitement par les acides qui est connue sous son nom, et qui est l'ar- 
chétype des méthodes employées pour l'aurification des terminaisons 
nerveuses. Elle consiste en des manipulations dont le procédé suivant 
peut servir de type. Des fragments frais sont traités par l'acide for- 
mique (1 volume de l'acide, d'une densité de 1.12, avec 1 vol. d'eau) 
jusqu'à ce que, en se gonflant, ils soient devenus transparents. Gela 
arrive en quelques secondes ou en quelques minutes, selon la gros- 
seur des objets, qui doivent être toujours aussi petits que possible. 
Par ce traitement, la pénétration de l'or est rendue plus facile, et les 
tissus sont devenus plus propres à le réduire. On les met alors pen- 
dant une quinzaine de minutes dans une solution de chlorure d'or à 
1 ou 1,S p. 100, qui doit être tenue à Tobscurité. Puis on les met 
pendant vingt-quatre heures dans de l'acide formique dilué (1 partie 
d'acide pour 1 à 3 parties d'eau), puis pendant vingt-quatre heures 
encore dans de l'acide formique concentré, ces deux traitements se 



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172 CHAPITRE XII 

faisant également dans Tobscurité. On fait des coupés, s'il y a lieu, 
et Ton monte dans le damar ou la glycérine. {Wien. Sitzber., LXXI 
Bd., III Abth., 1875, p. 1 ; Arch. f. mik. AnaL, XII, 1875, p. 366.) 
Les préparations ainsi faites doivent, si elles sont bien réussies, 
montrer les nerfs seuls imprégnés, au sein des tissus demeurés inco- 
lores. Mais, malgré toutes les précautions, on ne peut nullement être 
certain d'obtenir constamment ce résultat. 

1221. Méthode de Viallanes. — Des modiOcations ont été apportées de 
part et d'autre aux détails du procédé de Lœwit. On a diminué la concen- 
tration de la solution d'or. Tandis que Lœwit employait une solution à 
1 p. 100, concentration qui est encore généralement employée, quelques na- 
turalistes ont recours, ce nous semble avec raison, à des solutions beaucoup 
plus diluées. Ainsi Viallanes {Histologie et dév, des Insectes^ 4883, p. 42) s'est 
servi, pour des tissus d'insectes, du procédé suivant. Les tissus sont fixés 
par l'acide osmique à 1 p. 100, qu'on laisse agir jusqu'à ce qu'ils commen- 
cent à brunir. Puis ils sont mis pendant dix minutes dans un mélange de 
1 partie d'acide formique et 3 parties d'eau. On les met alors pendant vingt- 
quatre heures dans une solution de chlorure d'or à 1 p. 5000 ou même 
beaucoup plus étendue, qu'on a soin de tenir à l'obscurité. On réduit à la 
lumière dans de l'acide formique au quart. Nous voyons dans ce procédé 
que nous avons employé et qui nous a donné de très bons résultats, une 
modification du procédé classique qui nous parait excellente pour certains 
objets qui ne demandent pas à être spécialement gonflés par un acide pour 
faciliter la pénétration du sel d'or. 

222. Méthodes de Ranvier. — Ranvier (Quart, Jouim, mie. Se, 
1880, p. 456) fait l'imprégnation dans un mélange de 4 parties de 
solution de chlorure d'or à 1 p. 100 et 1 partie d'acide formique, 
qu'on a fait bouillir ensemble. 11 paraît que le chlorure acquiert, par 
l'ébuUition avec l'acide formique, une plus grande tendance à se 
réduire dans les tissus et une électivité plus marquée vis-à-vis des 
tissus nerveux. Notons ici, en passant, que, pour l'étude des termi- 
naisons nerveuses, Ranvier a substitué le jus de citron frais à l'acide 
formique employé par Lôvit pour gonfler les tissus; il est moins 
nuisible aux terminaisons nerveuses que ne l'est Tacide formique. 
Nous donnons les détails de ces deux méthodes dans la Deuxième 
Partie. — Nkrfs intra-épidkrmiques et Gornéb. 

223. Méthodes pour faciliter la réduction. — Une autre 
sorte de modiflcation qui a été apportée aux procédés de Gohnheim 
et de Lôvvit consiste dans la mise en œuvre de manipulations propres 
à faciliter la réduction de l'or et à la rendre aussi complète que pos* 
sible. 



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DES IMPRÉGN ATIOr<(S 173 

Ainsi Bastian a modifié le procédé de Cohnheim en employant une 
solution de chlorure d'or à 1 p. 2000 acidulée par THCl (1 goutte 
par 75 ce), et en faisant la réduction dans un mélange à parties 
égales d'acide formique et d'eau, maintenu au chaud. Tous ces 
détails sont de nature à favoriser la réduction. 

Hénocque {Àrch. de VAnat, et de la PhysioL,, 1870, p. 111) 
imprègne dans une solution de chlorure d'or à 0,5 p. 100, puis lave à 
l'eau pendant douze à vingt-quatre heures, et réduit à chaud dans 
une solution presque saturée d'acide tartrique. (La solution d'acide 
tartrique doit être contenue dans un flacon bien bouché. La meilleure 
température pour la réduction est de 40 à 50 degrés. La réduction se 
fait rapidement, souvent en un quart d'heure.) 

HoYER {Arch. f. mik. Anal. y IX, 1873, p. î222) ajoute à de l'eau dis- 
tillée une à deux gouttes par once d'un révélateur photographique 
au pyrogallol. Ou bien il emploie l'acide tartrique et l'éluve. 

Nestekoffsey traite les préparations imprégnées par une goutte de 
sulfhydrate d'ammoniaque, et achève la réduction dans la glycérine 
{voyez GiERKE. Faerb&rei zu mik. Zwecken). 

Flechsig {Die Leitungsbahnen im Gehim, etc., 1876 ; Arch. f. Anat. 
u. Phys., 1884, p. 453) emploie pour la réduction une solution de 
soude caustique à 10 p. 100. 

BoEHM préfère réduire dans la solution de Pritcqard, qui se com- 
pose de 1 partie d'alcool amylique, 1 partie d'acide formique et 
98 parties d'eau ; il faut pour cela dix-huit heures dans l'obscurité. 
(Voyez Carrière, Arch. f. mik. Anat.y XXI, 1882, p. 146.) 

Manfredi {Archimo per le Scienze mediche, V, n® 15) met les tissus 
après imprégnation (par une solution d'or à 1 p. 100) dans une solu- 
tion d'acide oxalique à 0,5 p. 100, et les y chaufi*e à 36** sur un bain- 
marie, puis laisse refroidir et monte à la glycérine. (Gela se fait à la 
lumière, et il est nécessaire d'opérer par un temps clair.) 

Manfredi emploie également pour la réduction, qui doit se faire au 
soleil, une solution d'acide arsénique à 1 p. 100, qu'il renouvelle à 
mesure qu'elle brunit. 

BoccARDi {Journ. Roy. Mie. Soc, 1888, p. 155) prend de l'acide 
oxalique de 0.1 à 0.25 ou 0.3 p. 100, ou bien un mélange de 5 ce. 
d'acide formique, 1 ce. d'acide oxalique à 1 p. 100, et 25 ce. d'eau, et 
il y réduit à l'obscurité pendant pas plus de deux à quatre heures. 

KoLossow {Zeit. f. wiss. Mik., V, 1, 1888, p. 52) réduit pendant deux 
ou trois jours à l'obscurité dans une solution d'acide chromique à 
0,01 ou 0,02 p. 100. 

Geberg {Intem. Monatsschr., X, 1893, p. 205) prétend que le traite- 



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174 CHAPITRE XII 

ment préalable des tissus frais pendant vingUquatre heures par l'eau 
de chaux (méthode d'ARNSTEiN, n^ 620) facilite beaucoup la réduction. 
Bernheim {Arch. f. Anat. u. Phys., Phys. Abth 1892, Supp.^ p. 29 ; 
ZeiL f. wiss. 3fik., X, 4, 1893, p. 484) ajoute à Tacide formique 
allongé de Lôwit un morceau de sulfite de soude (il doit être frais et 
sentir fortement Tacide sulfureux). 

224. Traitement ultérieur des préparations imprégnées 
par For. — Il n'arrive que trop souvent que les préparations noir- 
cissent à la suite d'une imprégnation excessive. On peut les décolorer 
par le cyanure ou le ferrocyanure de potassium. Redding emploie une 
solution faible de ferrocyanure ; Gybulskv, une solution de cyanure 
de potassium à 0,5 p. 100. 

On peut empêcher, du moins en une certaine mesure, le noircisse- 
ment des préparations, en les mettant pendant quelques jours dans 
Talcool, qui a la propriété d'arrêter la réduction de l'or (Ranvier). 

Les tissus imprégnés peuvent être colorés après coup par les tein- 
tures usuelles, mais il est à remarquer qu'on n'obtiendra la coloration 
des noyaux par le carmin qu'à condition d'employer une imprégna- 
tion négative, les éléments qui ont été imprégnés par le métal ne se 
colorant plus par le carmin. Les anilines peuvent rendre ici des ser- 
vices (safranine, vert de mélhyle, vert d'iode). 

Les préparations peuvent être montées dans la glycérine acidulée 
avec 1 p. 100 d'acide formique, ou dans le baume de Canada. Théori- 
quement, elles devraient être permanentes si la réduction de l'or a 
été effectuée d'une manière complète ; dans la pratique, on constate 
que leur durée n'excède guère quelques mois. 

225. Imprégnation d'animauzniarins. — Pourun motif qu'on n*a 
pas pu expliquer, les tissus des animaux marins ne prennent pas bien 
l'imprégnalion à Ter dans Tétat frais. Fol dit que l'on peut réussir mieux 
avec du matériel alcoolique. 

C. Acide osmique 

226. Acide osmique et pyrogallol (Lee, La Cellule, IV, 1, 
p. 110;puis,la/'*ii^rf. dece/rût7é, 1887,p. 140).— -J'ai appelé l'atten- 
tion, dans les endroits cités, sur le fait que la réaction, bien connue 
des chimistes, du pyrogallol sur l'acide osmique se réalise au sein des 
tissus. J!avais en effet trouvé c que les tissus traités par l'acide 
osmique prennent instantanément une coloration noir d'encre si on 
les traite par une solution même faible d'acide pyrogallique >. Ce 



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DES IMPRÉGNATIONS 175 

procédé donne des résultats qui peuvent être occasionnellement 
utiles. Mais, comme je l'ai expliqué plus tard {Zett. f.wiss. Mik,^ 
IX, 2, 1892, p. 185) la réaction est en général beaucoup trop éner- 
gique et donne des colorations excessives qui manquent d'électivité. 

Je n'avais essayé la réaction que sur des tissus traités par Tacide 
osmique pur. Plus tard, Hermann (Arch, f.mik. i4wa^, XXXVII, 4,1891, 
p. 570) Ta essayée avec des tissus fixés par son mélange platino-acéto- 
osmique. Avec cetle modification on obtient des résultats incompara- 
blement meilleurs, comme je puis en témoigner. Je ne pense cependant 
pas que le procédé particulier de Hermann soit le meilleur possible. 
Hermann fixe pendant un à deux jours dans le mélange, lave beaucoup 
à Teau et durcit ensuite dans des alcools successivement plus forts ; 
après quoi, pour obtenir la réaction noire, il met les pièces pour douze 
à dix-huit heures dans de Tacide pyroligneux brut. (Cet acide doit être 
brut, brun foncé et malodore (Hermann, dans Anat. Ergeh.^ II, 1893, 
p. 28). 

J'ai trouvé que Ton peut employer indifféremment le mélange de 
Hërmamn ou le mélange de Flemming. On peut fixer pendant douze à 
vingt-quatre heures si cela est indiqué dans Tintérét de la fixation ; 
mais dans l'intérêt seul de la coloration une demi-heure suffit et est 
même préférable. Il est inutile ou même nuisible de traiter par l'al- 
cool. Au point de vue de la coloration, on peut employer pour produire 
la réaction colorée (il n'y a pas de motif pour admettre que ce soit 
une c production >) soit l'acide pyroligneux de Hermann, soit une 
faible solution de pyrogallol. Il me semble que celui-ci vaut mieux; 
la différentiation est peut-être plus fine ,et la conservation des pièces 
me paraît meilleure. Je crois en effet avoir bien remarqué que la 
conservation des pièces traitées par l'acide pyroligneux laisse à 
désirer. On peut traiter par l'un ou l'autre de ces liquides pendant 
vingt-quatre heures, mais une seule heure ou moins pour de petites 
pièces doit suffire. On pçut employer une solution alcoolique de 
pyrogallol, ce qui peut être utile dans certains cas. 

On obtient une réaction semblable avec une solution de tanin. 

La méthode ainsi modifiée est importante. On obtient une colora- 
tion noire qui différencie suffisamment les éléments des noyaux pour 
qu'on puisse à la rigueur se dispenser de recourir à une coloration 
séparée de la chromatine, et qui en même temps différencie assez 
bien les éléments plasmatiques. C'est une des meilleures méthodes 
que je connaisse pour mettre en évidence les Nebenkern des cellules 
spermatiques. Elle donne parfois chez des Invertébrés de jolies diffé- 
rentiations du système nerveux. C'est une méthode très commode^ 



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1.76 



CHAPITRE XII 



et, si Ton fait usage de pyrogallol, très sûre (avec l'acide pyroligneux, 
moins sûre). Mais ce n'est pas une méthode absolument sans défauts, 
la coloration plasmatique qu'elle donne n*étant pas sans laisser à 
désirer. En effet, elle colore, souvent assez fortement, Tenchylème 
protoplasmatique en même temps que le reticulum plastinien, ce qui 
nuit à la netteté des images. Et il y a des éléments de la cellule pour 
lesquels elle napas d'affinité bien marquée, le fuseau entre autres, 
comme je Tai déjà fait observer [La Cellule, XI, 1, 1895, p. 31). 

Quoiqu'à la rigueur cette méthode dispense de l'emploi d'une 
deuxième coloration pour mettre les noyaux mieux en évidence, on 
peut cependant y recourir. J'ai trouvé fort avantageux de colorer les 
coupes ensuite par la safranine (colorer très fortement, vingt-quatre 
heures au moins). 

La méthode a été attribuée à voq Mahrenthal. Les communications de 
KOLOSSOVV [Zeit. f. wiss, Mik,, IX, I, 1892, p. 38, et IX, 3, 1893, p. 316) me 
paraissent être à côté de la question. 

D'après Azoulay [Anat, Anz., X, I, 1894, p. 25) on peut par une modifica- 
tion de celle méthode obtenir une coloration spécifique de nerfs à myéUne. 

227. Osmium et aoide oxalique (Broesicke, Centralbl. f, d, med. 
Wiss. y 1878, n® 46, p. 833 ; nous citons d'après Gierke dans Zeil. /". wiss. 
Mik.j I, p. 408). — On traite des tissus frais pendant une heure avec une 
solution d'acide osmique à 1 p. 100. On les lave soigneusement et on les 
met pendant vingt-quatre heures dans une solution de 1 partie d'acide 
oxalique pour 15 parties d'eau. Par ce procédé, on obtient de bonnes diffé- 
renciations de tissus ; la plupart des tissus se colorent en un rouge transpa- 
rent assez beau^ chaque tissu en une nuance particulière; les noyaux, étant 
plus foncés que le reste, sont bien mis en évidence. 

II faut avoir soin d'arrêter l'action de l'acide osmique avant qu'il ait pu 
noircir les tissus, car, en ce cas, l'acide oxalique n'a plus le pouvoir de les 
rougir. Cette méthode m'a donné pour certains sujets d'assez bons résultats, 
mais elle ne vaut pas le procédé au pyrogallol. 

d. Autres méthodes^ 

228. Perohlorure de fer (Polaillon, Journ. de VAnaL et PhysioL, III, 
1866, p. 43). — Le perchlorure de fer produit par imprégnation des colora- 
tions fort utilisables. La méthode consiste à imbiber les objets par une solu- 
tion de perchlorure de fer, et à les mettre ensuite dans une solution faible 
d'acide tannique, gallique ou pyrogallique, jusqu'à ce qu'ils soient suffi- 
samment noircis. 

Les IIOGGAN (Journ. Quekett Club, 1876; Journ. Roy. Mie. Soc., II, 1879, 
p. 358) fixent d'abord par le nitrate d'argent à 0,5 p. 100, qu'ils laissent un 
peu réduire, puis ils déshydratent les tissus par l'alcool et les traitent pen- 
dant quelques minutes avec une solution de perchlorure de fer dans l'alcool. 
Ensuite ils les traitent pendant quelques minutes (s'il s'agit de membranes 



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DES IMPRÉGNATIONS 177 

minces) avec une solution à 2 p. 100 d'acide pyrogallique dans l'aloool. Ce 
procédé, très facile, est excellent pour les membranes minces. 

Bleu de Prusse (Leber, Arch. /*. Ophlalm., XIV, p. 300; Ranvier, 
Traité, p. 108). — Sulfate de cuivre. Leber (loc, cit,), — Gliromate de 
plomb, Leber (loc. cit.)- — Sulfures (Landois, Centralbl. /*. d. med. 
Wiss,, 1865, no 55 ; Gierke, ZeiL wiss, MiL, 1, 1884, p. 497). — Molybdate 
d'ammonium (Merkel, Krause), voyez Gierke, Zeit, /*. wiss. Mik., I, 
p. 96.) — Oxyohlorure de ruthénium (Nicolle et Cantazucene, Ann, 
InsL Pasteur, VII, 1893, p. 331). 



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ANAT. UICROSC. 12 



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CHAPITRE XIII 
COLORATIONS COMBINÉES 



229. — On peut distinguer deux groupes de colorations combinées : 

Dans Tun, on combine des colorants ayant des affinités différentes 
pour les diverses sortes de tissus qui existent dans la préparation à 
colorer, sans se préoccuper de Télectivité de ces colorants vis-à-vis 
des éléments des tissus, c'est-à-dire vis-à-vis des noyaux, du cyto- 
plasma ou de la substance différenciée des éléments. C'est ainsi qu'on 
a recommandé une combinaison d'acide picrique et de carmin d'in- 
digo, deux colorants qui manquent absolument l'un et l'autre de 
toute électivité vis-à-vis des noyaux, mais qui, employés en combi- 
naison, montrent une électivité assez marquée vis-à-vis des tissus, le 
bleu de Tindigo se portant sur les épithéliums, et le jaune de l'acide 
picrique se localisant de préférence dans le tissu conjonctif. 

Dans l'autre groupe de colorations combinées, on ajoute à une 
coloration élective pour les noyaux d'une préparation, une ou plusieurs 
autres agissant sur les éléments extra-nucléaires, éléments qu'il est 
quelquefois fort important de colorer d'une couleur faisant contraste 
avec celle des noyaux. Comme exemple typique de ce genre de colo- 
ration, nous citerons la double coloration par le carmin boracique et 
le carmin d'indigo ou le bleu d'aniline. 

Avant de donner les formules, nous désirons dire un mot de l'em- 
ploi, d'une manière générale, de l'Acide picrique dans les colora- 
tions combinées. Flemming a fait observer avec raison que l'acide 
picrique peut être employé utilement et très facilement pour obtenir 
de doubles colorations avec le carmin ou l'hématoxyline. La tech- 
nique est des plus simples ; elle consiste tout simplement à ajouter de 
l'acide picrique aux alcools employés pour la déshydratation des 
objets déjà colorés par le carmin ou l'hématoxyline. On peut employer 



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COLORATIONS COMBINÉES 179 

toutes les teintures ordinaires de carmin ou d'iiématoxyline, sans 
crainte de voir s'altérer la coloration des noyaux, car même la colora- 
tion délicate que donne le carmin à Talun n*est pas altérée par le 
traitement par Tacide picrique (Flemming, Zeit. f. wiss. Mik,^ 1, 1884, 
p. 360). Mais voyez n« 195. 



COMBINAISONS AYANT POUR BASE LE CARMIN 

230. Picro-carmin. — Nous ne citons cette combinaison que 
pour rappeler que le picro-carmin est un colorant double, à condition 
de ne pas pousser les lavages au point où Tacide picrique disparait 
des préparations. On peut toujours prévenir cet effet en faisant les 
lavages avec des liquides chargés d'une quantité sufûsante d*acide 
picrique. 

231. Carmin boracique et picro-carmin. — On ajoute un peu 
de la solution normale de picro-carmin au carmin boracique de Gre- 
nacher, au moment des*en servir. Le mélange précipite en général au 
bout de quelques heures, mais cela n'empêche pas les colorations de 
se faire. 

232. Carmin et acide picrique. — Voyez les n~ 195 et 229. 

Pour le carmin picro-lithiqae de Orth, voyez Berlin, klin, Wochensch. 
28, 1883, p. 421. — Pour le carmin aluné à Tacide picrique de Légal, 
voyez n® 109. 

233. Carmin et carmin d'indigo. — Seiler {Am. Quart, Mie, Journ., 
1879, p. 220 ; Journ. Roy. Mie, Soe,, 1879, p. 613) colore dans le carmin 
boracique de Woodward (n<» 117), décolore par THCl, éloigne soigneuse- 
ment Tacide par le lavage et met les préparations pendant six à dix-huit 
heures dans une teinture composée de deux gouttes de solution saturée de 
carmin d'indigo dans Teau et 30 ce. d*alcool à 95 degrés (il faut iiitrer 
cette teinture avant de remployer). 

H. GiBBES emploie le carmin boracique (n® 117). 

Il est évident qu'on peut également employer les carmins au borax de 
Grenacher, et que la formule alcoolique n» 118 peut répondre à presque 
tous les besoins. 

J'ai essayé cette méthode. Elle réussit avec les coupes, mais elle est 
très capricieuse. Avec les objets entiers il est à peu près impossible de 
régler la coloration par Tindigo. 

234. Mélange de carmin boracique et carmin d'indigo (Merkel, 



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180 



CHAPITRE XllI 



Unters. a. d. Anat. Aîist. Rostock, 1874; Month. Mie, Journ,, 1877, 
p. 242 et 317). — On fait une solution de la manière suivante : 

Carmin 2 grammes. 

Borax 8 — 

Eau 128 centimètres cubes. 

(On triture ces ingrédients ensemble dans un mortier, on laisse reposer, 
on décante, on filtre, et Ton conserve le liquide dans un flacon bouché.) 

Et une autre solution de la manière suivante : 

Carmin d'indigo 8 grammes. 

Borax 8 — 

Eau 128 centimètres cubes. 

(Il faut les mélanger, décanter, filtrer et conserver le liquide, comme 
pour la première solution.) 

Au moment de s'en servir, on mêle les deux solutions à volumes 
égaux. On laisse les objets, qui doivent être petits, pendant quinze à vingt 
minutes dans la teinture. (Max Flesch préfère les laisser plusieurs heures. 
Voyez ZeiL /*. tviss. Mik., 1885, p. 350.) On les décolore en les lavant 
pendant le même temps dans une solution saturée d'acide oxalique dans 
Teau. Puis on lave à Teau et Ton monte dans un des milieux conservateurs, 
usuels. 

L'acide oxalique a la fonction de fixer dans les tissus le carmin d'indigo 
qui, étant très soluble dans l'eau, serait enlevé au lavage sans cette 
précaution; malheureusement il arrive souvent que cet acide précipite le 
caripin ou le fait passer au jaune, de sorte que la réussite est assez 
aléatoire. Les auteurs (Merkel, loc. cit.; NoRRis et Shakespeare, Amer. 
Journ, Med. Se, Jan. 1877; Merkel, Month. Mie. Joum., 1877, p. 242; 
Marsh, Section Cutting, p. 85; Bayerl, Arch. /*. mik. Anat., XXIII 1885, 
p. 36-7) ; Macallum, Trans. Canad. Inst., 11, 1092, p. 222; Journ. Roy. Mie. 
Soc. 1892, p. 698) sont d'accord pour trouver que les préparations réussies 
montrent des différencialions d'une grande richesse et très nettes. 
D'après Bayerl, la coloration est spécifique pour les corpuscules du sang, 
qui se colorent d'un vert pomme. Bayerl recommande d'éviter l'essence 
de girofle pour l'éclaircissement des coupes, vu qu'elle oxyde la couleur 
et l'altère ; il emploie la benzine. Mais de toute façon la couleur n'est 
jamais parfaitement stable. Ce colorant a été préconisé pour les centres 
nerveux. C'est une méthode beaucoup plus spéciale que générale. 

235. Carmin et bleu d'aniline (Duval, Précis, etc., p. 225). — 
Après avoir coloré par le carmin, Duval recommande de déshydrater par 
l'alcool et de colorer pendant quelques minutes dans une teinture composée 
de 10 gouttes de solution saturée de bleu d'aniline soluble à l'alcool et de 
10 grammes d'alcool absolu, puis de pénétrer par l'essence de térében- 
thine, et de monter au baume de Canada. 

Ce procédé peut s'appliquer à toute sorte de préparations, mais il est 
particulièrement indiqué pour les coupes décentres nerveux. 

D'autres auteurs recommandent le bleu de lumière, qui ne colore pas 



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COLORATIONS COMBINÉES ■ 181 

sensiblement les noyaux (Bedot), et le bleu de Lyon (Maurice et Sciiulgin), 
ce dernier étant dissous dans Talcool à 10^ acidulé par Tacide acétique. 
Il faut que les solutions soient très faibles. 

Baumgarten {Arch, /*. mik. Anat., XL, 1892, p. 512) colore les coupes 
(faites sur du matériel coloré au carmin boracique) pendant douze heures 
dans une solution à 0,2 p. 100 de bleu de Lyon dans lalcool absolu, et 
lave pour environ la moitié de ce temps avant de monter au baume. 
Recommandé pour le cartilage et pour les centres nerveux. 

236. Autres coxoibinaisons au oarmin. — Picro-carmin et 
hématoxyline (H. Gibbes, Journ, Boy. Mie, Soc,, III, 1880, p. 390). — 
Picrocannin avec la roséine et le bleu d'aniline ; ou avec le violet 
d'aniline et le bleu d'aniline ; ou avec le violet d'aniline et le vert 
d'iode; ou avec la roséine et le vert d'iode (IL Gibbes, loc. cit., p. 392). 
— Pioro-carmin et vert d'iode (Stirling, Journ. ofAnat. and PhysioL, 
1881, p. 349). — Picro-carmin avec vert d'iode et vert malachite 
(RiCHARDSON, Journ. Roy. Mie. Soc, 1881, p. 868). — Picro-carmin 
et vert de méthyle (Max Flesch, ZooL Anzeig., 1882, p. 554). — 
Picro-carmin et éosine (Lang, Zool. Anzeig.^ II, p. 45 ; Mitth. ZooL 
Stat. Neapelj II, p. 1 et suiv.). 



COMBINAISONS AYANT POUR BASE l'uÉMATOXYLINE 

237. Hématoxyline et acide picrique. — Nous avons déjà 
parlé de cette combinaison (n** 229). 

238. Ëoaine hématoxylique. — La coloration successive par Thé- 
matoxyliae et Téosine est une pratique très ancienne. Elle donne de 
bons résultats, mais n'est pas d'un emploi commode, car elle exige des 
lavages très soignés, Véosine précipitant facilement V hématoxyline^ si Ton 
ne prend pas des précautions spéciales. Nous donnons d'après Fol (Lehrb., 
p. 196) la méthode à laquelle s'est arrêté Renaut après une étude minu- 
tieuse de ces teintures. 

On prend : 

Solution concentrée d*éosine à la potasse dans l'eau. 30 cent, cubes. 
Solution jsaturée d'hématoxyline dans l'alcool (elle 

doit avoirété gardée quelque temps et avoir déposé). 40 — 
Solution saturée d'alun, de potasse dans la glycérine 

(densité de la glycérine, environ 1,26) 130 — 

On mélange ces solutions et on laisse reposer le mélange cinq à six 
semaines dans un récipient couvert d'une feuille de papier percée de 
Irons jusqu'à ce que l'alcool soit évaporé, puis on filtre. Pour la colora- 
tion, on se sert soit de la solution telle quelle, soit de solutions diluées. 
La coloration se fait très lentement, et au début la couleur n'est pas fixée 
dans les tissus, mais se laisse enlever au lavage. Mais après quelques 
jours ou quelques semaines elle se localise dans les tissus et s'y fixe. On 
peut alors monter au baume, en ayant soin d'employer pour la déshydra- 



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182 CHAPITRE XIII 

talion des alcools chargés d*une proportion suffisante d*éosine. Il est plus 
commode et souvent préférable de monter les pièces dans la teinture 
elle-même allongée de 1 à 2 volumes de glycérine pure. Après quelque 
temps, ce liquide d^inclusion devient parfaitement incolore par suite de la 
localisation de toute la matière |colorantc dans les tissus. Ces préparations 
se sont montrées permanentes jusqu'à présent. 

D'autres méthodes pour l'emploi de Téosine hématoxylique ont été 
indiquées à plusieurs reprises par Renaut, mais nous pensons que, dans 
la pensée de ce savant, celle-ci doit les remplacer toutes. Voyez, au demeu- 
rant, Comptes rendus Acad, Se, LXXXVIII, 1879, p. 1039 ; et Arck. de 
PhysioL. 1881, p. 640. 

Les solutions d'éosine hématoxylique sont remarquables par leur action 
élective pour les éléments des glandes salivaires et gastriques. Comme 
exemple de cette action élective, nous mentionnerons le fait que dans 
les glandes salivaires de Vllelix pomalia elle démontre l'existence de cel- 
lules glandulaires de deux sortes, les unes se colorant en rose brillant 
et les autres (celliiles mucipares) d'un bleu intense. Ces cellules ne pré- 
sentent pas de difTérence entre elles dans les préparations qui ne sont pas 
colorées. 

EvERARD, Demoor et Massart {Ann. Inst. Pasteur, VII, 1893, p. 16G) 
préparent un mélange semblable comme suit. On fait (A) une solution 
de 1 gr. d'éosine, 25 gr. d'alcool, "35 gr. d'eau et 50 gr. de glycérine. Puis 
on fait dissoudre à l'aide de la chaleur 20 gr. d'alun dans 200 gr. d'eau, 
on filtre, et après vingt-quatre heures on ajoute une solution de 1 gramme 
d'hématoxyline dans 10 grammes d'alcool. On filtre de nouveau après 
huit jours, et pour faire le bain de teinture on combine la solution avec 
un volume égal du liquide A. 

239. Hématoxyline et éosine. — List {Zeit, /*. wiss. Mik., II, p. 148) 
colore d'abord à l'hématoxyline, puis pendant quelques minutes dans une 
teinture composée de trois parties d'alcool absolu et une partie de solution 
aqueuse d'éosine à 0,5 p. 100. Celte méthode donne de belles colorations 
des noyaux, qui se colorent en violel, le reste de la préparation étant rose. 

Voyez aussi Buscii (VerA. d. BerL Phys, Ges,, 18*77; Gierre, Zeit. f. 
wiss. Mik,, I, p. oOo). 

Martinotti {Gazz, d. Clin. Torino, 1883, n« 51; Zeit. f.wiss. Mik., I, 
p. 582). 

Stœhr iVirchow's Archiv., XCVII, p. 211; Zeit. f. xinss. Mik., 1, 
p. 583) ; et, plus récemment, Hickson {Quart. Joum. Med. Se, 1893, 
p. 129 (colorer des coupes sur porte-objets pendant une heure dans une 
forte solution d'éosine dans de l'alcool à «0 p. 100, laver à l'alcool, et colo- 
rer pendant vingt minutes dans une faible teinture d'hématoxyline). 

Nous faisons observer que la coloration double d'hématoxyline et 
d'éosine est très à recommander pour des objets embryologiques. 
L'éosine se porte avec énergie sur le vitellus, qu'il différencie ainsi 
des feuillets embryonnaires, dans lesquels prédomine le bleu de l'hé- 
matoxyline . 



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COLORATIONS COMBINÉES 183 

240. Hématoxyline et benzopurpurine ou deltapurpurine. 

— Combinaison recommandée. Voyez n** 191 *. 

241. Hématoxyline, fuchsine acide et orange. — Cette 
combinaison, qui parait assez indiquée, est cependant peu mentionnée 
par les auteurs. La méthode de Cavazzani {Riforma Med., Napoli, 
1893, p. 604; Zeit. f. loiss. Mik., XI, 3, 1894, p. 344) est par trop 
compliquée. 

S142. Bématozyline et vert diode (Stirling, Journ, of Anal, and 
Physiol.^ 1881, p. 353). — Colorer légèrement à Thématoxyline, puis au 
vert d*iode. (Coupes de la langue; glandes mucipares vertes, glandes 
séreuses bleues.) 

243. Hématoxyline et nitrata de rosaniline (List, Zeii. f. wiss. 
Mik,^ II, p. 149). — Colorer d'abord à Thématoxyline, puis pendant dix 
minutes dans une solution de nitrate de rosaniline, laver, déshydrater et 
monter au baume. Recommandé pour les glandes mucipares, les épithéliums 
et le cartilage. 



COMBINAISONS AYANT POUR BASE LA SAFRANINE 

{Coupes seulement,) 

244. Saft*anine et Kernsch'warz. — Je recommande entre 
toutes cette combinaison, qui pour bon nombre d'objets m'adonne de 
meilleurs résultats que tout autre procédé. J'ai décrit au numéro 115 
le procédé que j'emploie. 

246. Safranine et LichtgrOn ou Sseureviolett (Benda, Verh. 
d. Phys. Ges. zu Berlin, 1891, 4 et 5 ; aussi dans VArch. f. Phys. de du 
Bois-Reymond, 1891). — Colorer des coupes pendant vingt-quatre 
heures dans de la safranine anilinée ; puis colorer pendant environ 
une demi-minute dans une solution de 5 grammes de Lichtgriin ou 
Sàureviolett (à prendre chez Grûbler) dans 200 ce. d'alcool, déshy- 
drater, et passer par l'essence de bergamote et le toluol au baume de 
Canada. Je reproche à cette méthode, qui m'a donné de très bons 
résultats, d'exiger l'emploi de coupes exceptionnellement minces. Il 
faut faire très attention à ne pas prolonger la coloration par le Licht- 
griin, qui exerce une action décolorante considérable sur la safra- 
nine. 

1 B. N. — A partir d'ici, les combinaisons citées ne peuvent guère être utilisées que 
pour la coloration de coupes, et non d'objets entiers. 



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184 CHAPITRE XIII 

246. Safranine, grentiane et orange (Flemhing, Arch, f. mik. 
Anal., XXXVII, 1891, p. 249 et p. 688). - Méthode célèbre. Colorer, 
au mieux pendant deux ou trois jours ou même semaines [Anat. 
Ergeb,^ in,p. 68) dans de la safranine anilinée, rincer à Teau, décolorer 
dans de Talcool acidulé au maximum par 0,1 p. 100 d'acide chlorhy- 
drique jusqu'à ce qu'il ne s'extraie presque plus de couleur. Colorer 
ensuite pendant une à trois heures dans du violet de gentiane (solu- 
tion aqueuse simple, ou bien le procédé de Gram, n® 168), laver à 
Teau, et traiter par une solution aqueuse concentrée d'orange, laquelle 
en vertu de ses propriétés acides extrait plus ou moins du violet de 
gentiane. Après quelques minutes au maximum, et pendant que les 
coupes cèdent encore de pâles nuages violets si on les agite, on les 
met dans Talcool absolu, on les y laisse jusqu'à ce qu'elles n'y per- 
dent presque plus de couleur, on éclaircit à l'essence de girofle ou de 
bergamote, et avant que les derniers pâles nuages de couleur aient 
cessé de se montrer on monte au baume. 

L'orange à employer est Torange G de Grûbler (fabrique de Meis- 
ter, Lucius et Brûning à Hôchst, ou de l'Actiengesellschaft fur Ani- 
linfabrication à Berlin). 

Ce procédé n'est pas censé donner une coloration triple^ mais une 
coloration mixte. Nous en parlons encore au chapitre des Méthodes 
Cytologiques. 

Je n'ai pas assez d'expérience de celte méthode pour avoir qualité 
de porter un jugement déûnitif à son égard. Je puis cependant dire 
qu'elle est d'une exécution très délicate — il suffit du moindre manque 
de jugement dans les opérations de décoloration pour tout compro- 
mettre — et en conséquence les résultats sont plus ou moins aléa- 
toires. 

J'ai bien obtenu par ce procédé des résultats qui paraissent être 
ceux que, d'après la description de Flemming, ce procédé doit produire. 
Ce sont des images fort belles, mais je préfère en général celles de la 
méthode du Kernschwarz et safranine, qui a en tout cas l'avantage 
d'être parfaitement sûre. 

Voici maintenant une modification du procédé de Flemming, pré- 
r»onisée par Reinke [Arch. f. mik, Anat,^ XLIV, 2, 1894, p. 262). Des 
coupes (de matériel fixé au liquide de Heréiann) sont mises pour 
vingt-quatre heures dans une solution concentrée de sulfite de potas- 
sium. On rince à l'eau et on colore pendant une ou deux heures dans la 
safranine. On lave bien à l'eau et l'on colore pendant vingt-quatre 
heures dans un mélange « neutre > de violet de gentiane et d'orange, 
qu'on prépare comme suit. On ajoute à une solution aqueuse concen- 



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■ J " wi,,^ w ; i ;yi 



COLORATIONS COMBINÉES 185 

trée de violet de gentiane quelques gouttes de solution aqueuse con- 
centrée d'orange. 

La solution se précipite en partie par suite de la formation d'une 
couleur neutre imparfaitement soluble, mais redevient presque claire 
si l'on ajoute un excès d'eau. 

Une goutte du mélange déposée sur du papier buvard doit faire une 
tache d'un violet pur ou brun au centre avec un étroit liséré d'orange 
pâle. 

On met les coupes « dans cette solution > sans avoir ûltré (je tra* 
duis littéralement; il est impossible de comprendre si l'auteur veut 
dire le mélange concentré ou le mélange étendu d'eau). Après vingt- 
quatre heures on déshydrate rapidement dans l'alcool absolu, et 
on éclaircit à l'essence de girofle. 

On peut conserver la solution de gentiane neutre en y ajoutant un 
tiers d'alcool. 

Le lecteur aura bien remarqué que les instructions de Reinke ne 
sont rien moins que précises. Elles sufQront, je pense, le plus souvent 
pour mener au but. Un essai fait avec le mélange, mais sans mordan- 
cage préalable par le sulfite de potassium, m'a donné des résultats 
sensiblement identiques à ceux du procédé de Flemming. Il me semble 
qu'avec le procédé de Reinke on doit avoir moins souvent des insuc- 
cès qu'avec celui de Flemming. 

247. Safranine et hématozyline (Rabl, Morph, Jahrb., X, 1884, 
p. 215). — Colorer très légèrement à l'hématoxyline (vingt-quatre heures dans 
une solution extrêmement allongée d'hématoxyline de Delafield), laver à 
ralcool acidifié par THCl, colorer fortement à la safranine. Ici la safranine 
est le colorant nucléaire et Thématoxyline le colorant plasmatique. Cette 
méthode m*a donné de forts bons résultats, il y a quelques années ; mais je 
la considère comme démodée. 

Pour la coloration de préparations de sançy FoÀ fait un mélange des deux 
couleurs. (Voir à la Deuxième Partie.) 

248. Bleu d'aniline et safranine (Garbini, ZooL Anzeig., 1886, 
p. 26; eiZeit, f, wiss. Mik., V, 2, 1888, p. 170). — Excessivement compliqué. 

249. Nigrosine ou carmin d'indigo et safranine (Kossinski, Zet7 . 
/". unss. Mik.f VI, 1, 1889, p. 61). -—J'ai essayé la combinaison avec la nigro- 
sine et n'ai pas réussi. 

COMBINAISONS A LA FUCHSINE ACIDE 

{Coupes seulement,) 

260. Bleu Victoria et fuchsine acide, — J'ai eu de bons 
résultats avec cette combinaison. Les coupes sont traitées pendant dix 



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186 CHAPITRE XllI 

minutes par la teinture d'iode ; puis, bleu Victoria, dix-huit heures; 
fuchsine acide (Sàurefuchsine), solution aqueuse à 0,5 p. 100, dix 
minutes; alcool ; essence de girofle ; colophane. 

Il ne faut pas employer la fuchsine acide en premier lieu, car le 
Victoria la décolorerait par substitution. 

Je pense que le violet de gentiane donnerait également de bons 
résultats en cette combinaison. 

Le rouge Congo ne donne pas de préparations stables. Voyez 
numéro 190. 

251. Mélange Ehrlich-Biondi (ou Ehrlich-Biondi-Heiden- 
hain) (Pfluger's, A7xh. f. d. ges. Phys,, XLIII, 1888, Supp., p. 40; 
Zeit. f. wiss. Mik., V. 4, 1888, p. 519). — Ce célèbre mélange a été 
depuis quelques années très employé en Allemagne et en Angleterre, 
il a été Tobjet d'un véritable engouement. La préparation en est 
assez délicate ; heureusement on peut se le procurer tout fait chez 
Grubler (n° 92). 

Ce liquide fut imaginé en premier lieu par EuRLicn, puis modifié 
par R. Heidenuain et Biondi. Nous citons d'après R. Heidenuain. 

A 100 ce. de solution saturée d'orange dans l'eau on ajoute, en agi- 
tant constamment, 20 ce. de solution saturée de fuchsine acide (Sàu- 
refuchsine) dans l'eau, et 50 ce. d'une solution pareille de vert de 
méthyle. 

On allonge le mélange de 60 à 100 volumes d'eau. Le mélange 
allongé doit virer au rouge d'une manière évidente par addition 
d'acide acétique. Si l'on en pose une goutte sur du papier buvard, 
elle doit former une tache d'un vert bleuâtre au centre et orange vere 
les bords. Si la zone orangée est entourée d'une zone rouge plus 
large, c'est que le mélange contient trop de fuchsine. 

Ces réactions ne suffisent pas pour assurer une bonne solution. Une 
solution ainsi préparée ne donne pas infailliblement l'électivité vou- 
lue de la coloration de la fuchsine acide ; et les préparations ont une 
tendance à se faner en peu de temps. En acidifiant la solution on 
obtient une teinture plus élective et donnant des préparations qui ne 
se fanent pas. Mais il faut user de grandes précautions en acidifiant ; 
car si l'on ajoute trop d'acide on nuira à l'électivité de la teinture en 
provoquant une coloration de la substance interfilaire eu même 
temps que l'élément plastinien. Voici, d'après M. ^^u^E^nsm [Ueber 
Kern u, Protoplasmay Engelmann, 1892, p. 116), comment il faut 
procéder : 

On prend une quantité voulue de la solution originelle et on Tal- 



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COLORATIONS COMBINÉES 187 

longe d'eau dans la proportion de 6 volumes de la solution pour 400 
d'eau distillée. On prend deux verres pareils, on les remplit d*eau 
distillée et l'on ajoute à chacun quelques gouttes de la solution allon- 
gée, de manière à avoir dans chacun un liquide de la même teinte. 

Ce liquide doit accuser en même temps un ton rouge provenant de 
la fuchsine acide, un tonjaune provenant de l'orange, et un ton gri- 
sâtre provenant du vert de méthyle. On ajoute maintenant à l'un des 
verres, goutte à goutte et en agitant continuellement, de l'acide acé- 
tique fortement dilué (1 p. 500 d'eau) jusqu'à ce que le liquide vire 
fortement au rouge cramoisi (le ton jaune primitif disparaissant en 
même temps et le ton gris devenant moins évident). On met ces deux 
verres de côté pour servir de témoins. On reprend maintenant la solu- 
tion allongée qu'on avait préparée en premier lieu, et on l'acidifie 
avec l'acide acétique dilué, tout en agitant fortement. On en prend 
de temps à autre quelques gouttes que Ton ajoute à un troisième 
verre contenant de l'eau distillée; et l'on procède ainsi jusqu'à ce 
que dans ce troisième verre on ait réalisé le ton beau rouge cramoisi 
du verre témoin quia été acidifié. Aussitôt que ce point a été atteint, 
le bain de teinture est prêt. Mais si les préparations ne réussissent pas 
d'une manière tout à fait satisfaisante, on peut ajouter encore de très 
faibles quantités d'acide. 

Ce n'est pas encore tout. Il est si important d'atteindre et de con- 
server exactement le degré voulu d'acidité de la solution, qu'il faut 
encore une précaution ou deux {Arch. f. mik. Anat., XLIII, 3, 1894, 
p. 430). 

La teinture ne doit pas être filtrée, car la filtralion peut la rendre 
moins acide. Et si on l'a conservée pendant quelque temps, il faut 
l'additionner d'un peu d'acide, parce qu'elle aura dissous des traces 
de verre, qui est un corps alcalin. Hkidenhain va jusqu'à conseiller 
de conserver la solution dans des récipients de gutta-percha. 

Il est absolument nécessaire que l'orange soit l'orange G, que la 
fuchsine acide soit la Rubin S (on sait que « rubine » est synonyme 
de « fuchsine > ), et que le vert de mélhyle soit le Methylgrun 00, 
toutes de la fabrication de la Aktienfabrik fur Anilinfabrikation à 
Berlin (on peut se les procurer chez Grûbler). 

Nous donnerons dans le numéro suivant deux modifications de 
ce mélange, qui ont du moins le mérite d'être des simplifications. 

Il est bon d'observer que les solutions originelles des trois ingré- 
dients doivent être absolument concentrées, ce qui ne s'obtient qu'après 
plusieurs jours de solution. Elles ont une tendance à précipiter au 
mélange. En conséquence Sq^re {M ethods, etc., p. 37) recommande 



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^88 CHAPITRE XIII 

de les allonger de la proportion d'eau voulue pour la dilution défini- 
tive avant de les mélanger. 

Pour assurer la permanence de la coloration il est bon (M. Heidkn- 
haïn) de traiter les coupes pendant deux heures par l'acide acétique 
dilué àO, 1 p. 100, deles mettre ensuite pendant un quart d'heure dans 
de la teinture d'iode, et rincer ensuite à l'alcool, avant de les mettre 
dans le bain de teinture. Le traitement par l'acide a pour but d'assu- 
rer que les préparations aient une réaction acide lorsqu'on les monte 
au baume. Le traitement par l'iode a pour effet de rendre plus éner- 
gique la coloration de la chromatine par le vert de méthyle et de 
rendre plus élective la coloration des éléments protoplasmiques. (Les 
instructions de M. HEroENUAiN ont trait à du matériel fixé par le 
sublimé. J'ai trouvé que la coloration de matériel fixé par le mélange 
de Flemming est encore plus précise.) 

On colore pendant six à dix-huit heures. On rince à l'eau, on déshy- 
drate aussi rapidement que possible dans l'alcool, on éclaircit au xylol, 
et on monte au baume. On déshydrate aussi rapidement que possible 
pour deux motifs : l'un, c'est que la méthode est censée être une 
teinture progressive ne demandant pas de différenciation après 
coup ; l'autre, c'est que le vert de méthyle est très peu résistant à 
l'alcool, et s'en irait à coup sûr à un lavage prolongé. 

Les résultats varient beaucoup selon la nature des tissus. On peut 
dire en somme que la chromatine se colore en bleu à l'état de repos, 
en vert à l'état kinétique, et que les éléments plasmatiques prennent 
divers tons de rouge, rarement orange. L'électivité est très pré- 
cise, ce qui ne veut cependant pas dire que la fuchsine et l'orange 
colorent infailliblement tous les éléments plasmatiques qu'on vou- 
drait avoir mis en évidence. 

Dans les préparations réussies l'effet est de toute beauté. Mais il est 
incontestable que, malgré les plus grandes précautions, elles ne réus- 
sissent pas toujours. 

Il est absolument nécessaire de n'employer que des coupes exces- 
sivement minces, car il faut que la déshydratation puisse être faite en 
une trentaine de secondes, sans cela les noyaux perdent infaillible- 
ment leur couleur. Et le moindre défaut ou excès d'acidité de la solu- 
tion peut rendre la coloration par la fuchsine acide diffuse au lieu 
d'être nettement localisée dans l'élément plastinien. Les préparations 
ne se conservent que moyennant toutes les précautions que nous 
avons indiquées. En somme donc je pense qu'il faut admettre que 
cette méthode a sa raison d'être pour les objets très spéciaux qu'a- 
vaient en vue les auteurs qui l'ont imaginée, pour les recherches sur 



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" ' •■ F' . 't j. ' q: 



COLORATIONS COMBINÉES 189 

les granulations cyloplasmiques d'EnRLicn,ou pourles recherches sur 
le réticulum cytoplasmatique de Martin Heidenhaïn, et d'autres objets 
semblables. Mais vouloir, comme paraissent le prétendre certains 
observateurs, en faire une méthode à appliquer à toute sorte d'objets, 
c'est tomber dans l'exagération, et certainement on en reviendra. 

252. Mélange triacided'Ehrlich. — Suivant l'exemple d'Ehrlich, 
on appelle Mélange triacide (Triacidlôsung) un mélange des mêmes 
trois couleurs que celles du réactif ËURLicn-BiONDi du numéro précé- 
dent, mais dans des proportions telles que les couleurs « acides » y 
prédominent. L'expression est impropre au point de vue chimique, 
car le mélange ne contient que deux couleurs « acides », l'orange et 
la fuchsine acide, le vert de méthyle étant une couleur fortement 
« basique >. 

La suivante est une formule récente d'EHRLicn pour ce mélange, 
communiquée àREiNBAcn {Zeit. f. wiss, Mik., XI, 2, 1894, p. 259). 

Orange G., solution saturée aqueuse. . . 120 grammes. 
Fuchsine acide. — ... 80 — 

Vert de méthyle. — . . iOO — 

Eau distillée 300 — 

Alcool absolu 180 -— 

Glycérine 50 — 

Il faut veiller à ce que les solutions soient absolument concentrées, 
et il ne faut jamais agiter le mélange, mais en puiser chaque fois ce 
qu'il faut avec une pipette plongée dans la couche superficielle. Avec 
ces précautions le mélange se conservera pendant des années. 

Voici maintenant, d'après Warburg (cité d'après Zeit. f. iciss. 
Mik., XI, 3, 1894, p. 382) une manière de composer cette solution au 
moyen du Mélange Ehrlich-Biondi, due à M. Heidenhaïn :— c 2 ce. 
de mélange Biondi (1 : 30) -h 40 ce. d'eau distillée -i- 3 ce. de solution de 
fuchsine acide à 0. 5 p. 100 -h 0. 2 ce. d'acide acétique à 1 : 500. > 

Ces formules ont évidemment plus de précision que celle du mélange 
Edrucu-Biondi du numéro précédent, et en constituent une simplifica- 
tion. Mais elles présentent le même inconvénientque celle-ci, à savoir la 
difficulté qu'il yak conserver le vert de méthyle dans les noyaux 
lors de la déshydratation des préparations. Pour ce motif je pense 
qu'elles sont, tout autant que le mélange Eurlicu-Biondi, impropres 
à la coloration des coupes, et ne doivent servir que pour la coloration 
de préparations de sang séché sur porte-objet et autres préparations 
analogues. 



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190 CUAPITBE XIII 

On trouvera dans Rawitz, Leitfaden f. hist. Untersuchnngen, 1895, 
p. 71, une autre formule donnée sous le titre de Mélange Triacide 
d'EuRLicn. Celle formule donne le ver/ d'éthyle (Aethylgrûn) au lieu 
de vert de méthyle, Rawitz ne citant pas de source, je ne puis dire s*il 
n'y a pas là une faute d'impression pour vert de méthyle. 

AUTRES COMBINAISONS 

{Coupes seulement.) 

253. Vert de méthyle et éosine (Calberla, Mo7*ph. Jahrb., lll, 
1877, p. 625). — On prend une partie d*éosine et 60 parties de 
vert de méthyle et Ton fait une solution avec de l'alcool à 30 p. 100 
chaud. Des coupes se colorent dans cette solution en cinq à dix 
minutes ; on les lave rapidement dans des alcools successifs, et Ton 
monte dans le baume ou dans la glycérine. 

254. List {Zeit. f. loiss. Mik., II, p. 147) colore pendant quelques 
minutes dans une teinture composée de 3 parties d'alcool absolu avec 
1 partie de solution d'éosine dans Teau, à 0,5 p. 100, puis, après lavage, 
il colore pendant cinq minutes dans une solution aqueuse de vert de 
méthyle, à 0,5 p. 100. On lave et Ton passe par l'alcool et un agent 
éclaircissant pour monter dans le baume. Les préparations ne se 
conservent pas bien dans la glycérine. 

On peut également employer une solution alcoolique de vert de 
méthyle (3 parties d'alcool absolu avec une partie de la solution de 
vert de méthyle dans l'eau). 

En général, il faut retirer les préparations de l'alcool absolu aussi- 
tôt que la couleur de l'éosine commence à reparaître. 

On peut aussi employer {loc. cit,, p. 150) une teinture faite en 
allongeant la solution aqueuse de vert de méthyle de 50 volumes 
d'eau, et y colorer pendant vingt quatre heures. 

Pour le mélange de Huumbler et ses résultats étonnants voyez Zool. 
Anz,, 1893, p. 47, 57-6i. 

255. Brun Bismarck et vert de méthyle (List, Zeit. f. wiss. 
Mik., II, 1885, p. 145). — Colorer pendant quelques minutes dans 
une solution de brun Bismarck, formule de Weigert (n** 113 6is), 
laver, et colorer au vert de méthyle (sol. aq. à 0,5 p. 100). 

Ou bien, colorer pendant quelques minutes dans une teinture 
composée de trois parties d'alcool absolu et une partie de la solution 
de brun Bismarck selon Weigert, laver à Talcool fort, et colorer 



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COLORATIONS COMBINÉES 191 

pendant quelques minutes dans une teinture composée de trois parties 
d'alcool absolu et une partie de la même solution de vert de mélhyle. 

Ou bien, colorer pendant vingt-quatre heures dans une teinture 
faite en allongeant le brun Bismarck de Weigert de 50 volumes 
d'eau, puis colorer pendant vingt-quatre heures dans une teinture faite 
en allongeant la solution précitée de vert de méthyle de 60 volumes 
d'eau. 

Éclaircir par l'essence de bergamote ou le xylol, et monter au 
baume. 

256. Fuchsine et bleu de méthylène. — Méthode de Baum- 
GARTEN {Zeit. f. wiss. Mik.y I, 1884, p. 415). — Les coupes de tissus 
durcis par l'acide chromique sont placées pendant vingt-quatre heures 
dans une solution alcoolique concentrée de fuchsine étendue d'eau 
(8 à 10 gouttes dans un verre de montre rempli d'eau), puis 
lavées rapidement dans l'alcool absolu. On les traite ensuite par^une 
solution aqueuse concentrée de bleu de méthylène pendant quatre à 
cinq minutes, puis par l'alcool absolu pendant cinq à dix minutes et 
finalement par l'essence de girofle. Le bleu de méthylène enlève la 
coloration rouge de la substance fondamentale des tissus et laisse les 
noyaux colorés en rouge. 

257. Bleu de méthylène et éosine (Ghenzinsky , cité d'après Zeit, 
/*. wiss. Mik.y XI, 2, 1894, p. 260). — Ne se conserve que pendant une hui- 
taine de jours. (Voyez numéro 747.) 

Bleu de mélhylène, solution saturée aqueuse. . . 40 grammes. 
Éosine, 0,5 p. 100 dans de l'alcool à 70 p. 100 . . 20 — 
Eau distillée (ou glycérine) 40 — 

Le mélange de Piankse [Riforma med,, 1893, p. 828; Zeit, f. iviss. MîL, 
XI, 3, 1894, p. 345) contient les mêmes ingrédients dans les mêmes propor- 
lions, avec une forte addition de carbonate de lilhine. 

258. Autres combinaisons. — Nous laissons de côté bon nombre de 
mélanges qui nous paraissent inutiles ou superQus, mais voyez au besoin 

les suivants : 

Eosine et vert d'aniline (Scuiefferdecker, ^IrcA. /*. mik. Anat,, 1878, 
p. 30). — Eosine et dahlia (Schiefferdecker, Arch, /". mik. Anat., 
1878 p. 30). — Eosine et violet de méthyle (Schiefferdecker, loc. 
cil ).'— Rose Bengale et vert d*iode (Gribsbach, ZooL Anzeig., 1883, 
p. 172). — Hématoxyline et nitrate de roaaniline (List, Zeit, f. wiss. 
Mik., II, p. 149). — Brun Bismarck et vert d'aniline (List, loc. cit.). 
— Vert de méthyle et nitrate de rosaniline (List, loc. cit.). — Bleu 
de Prusse et safranine (Brun, Arch. Se: Phys. et Nat., XIII, 1885, 
p. 257). 



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192 



CHAPITRE XIII 



Hesegotti {Zeit. f. wtss. Mik.y V, 3, 1888, p. 320) a obtenu des tein- 
tures doubles en colorant d'abord dans la fuchsine, le dahlia, le violet de 
mêMiylô, le violet de gentiane, la rubine, le bleu Victoria ou le magenta, 
et ensuite dans une solution alcoolique (si j'ai bien compris) de rouge 
GonjLio, vert de méthyle, vert d'iode, nigrosine, bleu de méthylène, orange, 
ponceau, fuchsine acide, aurantia, cyanine, éosine, éosine méthylique, 
roug<" Magdala, Bordeaux, ou vésuvinc. Il a eu les meilleurs résultats en 
colorant d'abord par le violet de méthyle, puis par une solution alcoolique 
très fUluée d'éosine alcoolique ou de fuchsine acide, avec déshydratation 
par l'alcool pur. 



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CHAPITRE XIV 

MÉTHODES D'INCLUSION 



259. Les méthodes d'inclusion ou d'enrobage sont des pro- 
cédés ayant pour but d'englober les objets petits ou délicats dans des 
substances plastiques qui les soutiennent de tous côtés de manière à 
permettre de les diviser en tranches minces sans les comprimer et 
sans déranger les rapports de leurs parties. Au début de cette branche 
de la technique, on ne visait qu'à entourer les objets par une subs- 
tance de nature à leur prêter un support suffisant à l'extérieur, sans 
se préoccuper de faire pénétrer cette substance à l'intérieur pour 
prêter le même support aux éléments anatomiques; c'est là l'inclusion 
ou l'enrobage simple, méthode qui rend encore aujourd'hui des ser- 
vices pour les coupes d'objets dont l'intérieur ne se laisse pénétrer 
par aucune des masses d'inclusion connues, comme, par exemple, 
l'encéphale humain entier. Mais la technique moderne n'en est pas 
restée là. Mettant en œuvre des procédés d'infiltration, on réussit 
aujourd'hui à remplir avec la masse d'inclusion toutes les cavités qui 
peuvent exister dans un organisme, à entourer chaque organe et 
chaque élément, à en pénétrer même la substance des cellules. Par 
ce moyen, on communique aux tissus une consistance qui permet de 
les débiter en tranches très minces dans lesquelles les rapports natu- 
rels de tous les organes et de tous les éléments se trouvent exacte- 
ment conservés. 

On arrive à l'une ou l'autre de ces fins par l'emploi de masses d* in- 
clusion appropriées au but qu'on se propose. A ce point de vue, on 
peut distinguer deux groupes de masses d'inclusion : les masses 
aqueuses^ telles que la gomme arabique, la gélatine, le savon, qui se 
laissent mêler à l'eau, et servent à enrober et à infiltrer des tissus 
sans les déshydrater ; et les masses anhydres, telles que la paraffine, 
la cire, le collodion, qui peuvent bien elTectuer le simple enrobage 

ANAT. MICROSC. 13 



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194 CHAPITRE XIV 

d'objets humides, maïs qui ne sauraient les inQltrer qu'à condition 
d'une déshydratation préalable. L*emploi de masses humides est sou- 
vent nécessaire dans les recherches cytologiques, et souvent très 
commode, quelquefois même nécessaire, en physiologie et en patho- 
logie; les masses anhydres, au contraire, se prêtant mieux à la pré- . 
paration des séries de coupes, sont les plus employées en embryologie 
et en anatomie normale. Aujourd'hui c'est surtout la paraffine qui 
sert à ce genre de travaux. . 

260. MIorotoxnes. — Le cadre de cet ouvrage exclut en principe toute 
description d'iustrumenls. Nous pensons qu'il sera cependant utile de dire 
deux mots sur les microtomes avant de passer à Texposé des manipulations 
spéciales des inclusions. Nous venons de dire que la méthode de la paraffine 
est la méthode normale de Tanalomie et de l'embryologie. Il s'ensuit que 
le micro tome de Fembryologiste ou du zootomiste doit être fait en vue de 
remploi général de cette méthode. 

Mais il doit aussi pouvoir servir au besoin pour la confection de coupes 
de matériel non déshydraté, ou enrobé dans une substance moins dure que 
ne Test la parafHne, dans le collodion par exemple. La paraffme est une 
masse très dure, le collodion est une masse beaucoup moins dure, et plus 
ou moins élastique. Des masses aussi dissemblables ne se laissent pas couper 
avec la même facilité et la même perfection au moyen de dispositifs 
mécaniques identiques. Il en résulte que tel micro tome qui donne avec la 
paraffine les coupes les plus parfaites qu'il soit possible de réaliser est très 
impropre à couper le collodion ou autre masse ^enrfre et élastique. En con- 
séquence, à moins que l'anatomiste ne puisse disposer de deux microtomes, 
l'un pour la paraffine, l'autre pour le collodion, les tissus frais ou conge- 
lés, etc. (ce qui sera bien), il fera mieux de choisir un modèle n'ayant peut- 
être pas les qualités spéciales que seul peut avoir un instrument imaginé 
en vue d'un genre de travail très spécial, mais qui donne des résultats suffi- 
samment bons en même temps avec la paraffine et avec les masses molles. 

Parmi les microtomes les plus connus qui remplissent ces conditions, 
nous citerons celui de Zeiss, celui de Reiciiërt, à Vienne, celui de Sciianze, 
à Leipzig (excellent, d'un emploi très facile, et aussi très bon marché, car il 
ne coûte, si nous ne faisons erreur, que 80 marks, soit 100 francs). Mais à 
notre sens, le microtome qui répond le mieux aux besoins de l'anatomiste 
général, est celui de Tiioma, construit par Jung, de Heidelberg. Nous ne 
saurions mieux conseiller le lecteur qu'en l'engageant à se commander chez 
Jung [adresse R. Jung, Mechaniker, in Heidelberg) un microtome Thoma 
modèle moyen, soit n<* 2' ou 4, avec toutes les améliorations les plus récentes, 
y compris la vis raicromélrique à tambour enregistrant, perfectionnement 
que nous pouvons assurer, d'après notre expérience, n'être nullement une 
superfluité. On trouvera une description détaillée de ce bel instrument 
dans le Journal de Mici'ographie de novembre et décembre 1883. Ou bien 
celui de Aug. Becker à Gottingen, dont on trouvera une description dans 
Zeit, f. wiss. Mik., II, 1885, p. 453, ou Joui'n. lioy. Mie, Soc, 1886, p. 334. 
Ce modèle est en principe le même que celui de Thoma, mais possède 
quelques changements de détail qui sont des perfectionnements. L'un et 



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METHODES D INCLUSION 195 

Fautre de ces instruments coupent les masses tendres comme le coUodiou 
tout aussi bien que la paraffine ; ce sont même à peu près les meilleurs 
instruments qui existent pour cette fln. Avec la parai'flne, ils fournissent un 
travail assez bon, mais qui ne saurait être comparé pour la finesse et la 
régularité à celui des microtomes de Cambridge, de Minot ou de Reinhold- 
Giltay. Dans celui de Thoma ou de Becker, le couteau est mobile, il n'est 
maintenu qu'à l'une de ses extrémités, et il n'est pas assujetti sur le fond de 
la rainure dans laquelle il glisse. Ce dispositif lui permet de céder, d'une 
quantité minime il est vrai^ mais c'est toujours trop, à l'instant où son tran- 
chant rencontre l'objet à couper. Il ne le fait pas toujours à un degré per- 
ceptible, mais il le fait souvent, surtout si l'objet est un peu dur ; d'où une 
irrégularité quelquefois fort désagréable dans l'épaisseur des coupes. Dans 
les instruments que nous allons maintenant mentionner, cet inconvénient 
n'existe pas ou existe à un degré moindre ; car, dans ces modèles, le couteau 
est immobile et solidement assujetti à ses deux extrémités. 

Dans ces modèles, nous recommandons en premier lieu pour la plupart 
des recherches qui demandent la préparation de séries de coupes à la paraf- 
fine, le nouveau microtome à bascule vendu par la « Cambridge Scientific 
instrument Company >, sous le nom de Rocking Microtome, (Ce microtome 
est aussi construit en France par Dumaige, 2i-, rue Saint-Merri.) Ce micro- 
tome fournit avec une grande facilité des séries de coupes d'une admirable 
régularité, et se prête mieux que le microtome Thoma à la production 
rapide de coupes enchaînées ou de rubans de coupes collées ensemble, 
sujet sur lequel nous reviendrons tout à l'heure, mais il n'offre pas de dis- 
positions aussi heureuses pour l'orientation exacte d'objets très petits. Cet 
inconvénient se trouve en partie écarté parles perfectionnements apportés à 
la construction du porte-objet par Henneguv et Vignal (Comptes rendus de 
la Soc, de Biologie, 1885, p. 647). Ce raicrotome ne s'applique du reste 
guère qu'à la confection de séries de coupes par la méthode de la paraf- 
fine, et n'est pas à recommander pour les coupes qui doivent se faire par 
la voie humide avec un rasoir mouillé, comme pour le procédé au coUodion. 

Ensuite les beaux instruments de Minot et de Reinhold-Giltay. Dans 
ceux-ci comme dans le Cambridge Rocker, le couteau est fixe et le porte- 
objet mobile, mais celui-ci a un mouvement vertical produit par un méca- 
nisme semblable à celui d'une machine à coudre. L'un et l'autre sont des 
instruments dune grande beauté, et très pratiques. Le Minot est fabrique 
par E. Zimmermann, 10, Albert-Strasse, Leipzig, au prix de 175 m. 
{220 francs). On en trouvera une description dans le Joum. Roy, Mie, Soc, 
1889, p. 143. Le Reinhold-Giltay ressemble essentiellement au Minot, mais 
possède des perfectionnements dans le détail mécanique qui le rendent plus 
précis et moins délicat. Je n'ai pas eu l'occasion de travailler moi-même 
avec cet instrument, mais je l'ai vu à l'œuvre, et je puis affirmer que je lui 
ai vu débiter un bloc de paraffine de plus d'un centimètre de côté en un 
ruban de coupes à un micron d'épaisseur, et cela avec un rasoir ordinaire. 
Les coupes étaient toutes parfaites si ce n'est que quelques-unes étaient un 
peu tassées. C'est de bien loin ce que j'ai vu de plus beau en fait de micro - 
tomes. Il y a aussi un dispositif pour permettre de couper les masses au collo- 
dion, etc. Cet instrument est fabriqué par J. W. Giliay à Delft, et coûte, je 
crois, environ 500 francs. On en trouvera une description dans Zeit, f. wiss, 
Mik., IX, 4, 1893, p. 415, et dans Joum, Roy, Mie. Soc, 1893, p. 700. 



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m 



CHAPITRE XIV 



261. Les manipulations de Finclusion. — Avant de décrire en 
détail les plus importantes des méthodes d'inclusion, nous dirons 
quelques mots des procédés opératoires généraux de l'inclusion, c'est- 
à-dire des manipulations employées pour introduire l'objet dans la 
masse liquide d'inclusion de telle sorte que la masse devenue solide 
se présente sous la forme d'un bloc commode à couper et emprison- 
nant l'objet dans l'orientation voulue. 

a. On peut faire l'inclusion dans une capsule ou dans un verre de 
montre, quitte à découper ensuite dans la masse solide un bloc con- 
tenant l'objet et ayant les dimensions voulues. Si l'on s'est servi d'une 
masse liquide à chaud, solide à froid, telle que la paraffine, on peut 
le plus généralement la retirer en totalité en chauffant légèrement le 
fond de la capsule ou du verre de montre de manière à fondre la 
ijouche inférieure de la masse, ce qui permet de détacher en bloc le 
reste de la masse. 

Si l'on désire procéder de cette manière, il est bon, selon certains 
anatomistes, d'enduire le récipient, d'avance, avec de la glycérine. 
On y verse une goutte de glycérine, qu'on étale et qu'on essuie ensuite 
avec un linge jusqu'à ce qu'il n'en reste que des traces à peine per- 
ceptibles. J'ai toujours trouvé que pour la paraffine cette précaution 
n'est nullement nécessaire ; il est même rarement nécessaire de 
chauffer le fond du récipient, la paraffine se détache d'habitude par- 
faitement bien sans cela. 

b. Les petils objets se laissent parfaitement bien enrober et 
orienter dans les masses telles que la paraffine sans aucun appareil. 
On pratique dans un bloc de paraffine une cavité assez grande pour 
recevoir l'objet, et on l'y place dans la position désirée. Il n'y a plus 
qu'à promener une aiguille chauffée le long des marges de la cavité 
pour que la paraffine fondue vienne entourer l'objet et achever l'in- 
clusion sans déranger l'orientation de l'objet. Nous engageons vive- 
ment le lecteur à ne pas mépriser cette méthode si simple, car il est 
des cas où elle rend des services que ne rend aucune autre méthode. 
Lorsqu'on a affaire à des objets si petits qu'on ne peut distinguer leur 
position qu'à Taide d'une forte loupe, il est essentiel de savoir manier 
l'aiguille chauffée sous le microscope à dissection et même sur le 
porte-objet du microtome ^ 

c. D'après une méthode qui est très répandue, et qui est excel- 

t Dans The Microlomisl's Vade Mecum^ 1885, p. 172, nous avons appelé celle 
méthode du nom de Kisgsley. Nous pensons maintenant qu'il convient de l'al- 
'rjbner à Born. Voyez Die PlatlenmodeUinnelhode^ dans Arch, f. mik. Anat,^ 1883, 



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3IÉTH0DES d'inclusion 



197 



lente, l'inclusion se fait dans de petites boîtes de papier, de carton ou 
de papier de plomb. On construit facilement ces boîtes de la manière 
suivante : on prend un morceau de papier ou de carton ayant approxi- 



d 



C 



a» b' 

Fig. i. 



d* 



.D' 





Fig. 



Fig. 3. 



mativement la forme du dessin ci-contre (fig. 1.) ; les vieilles cartes 
correspondance peuvent bien servir. On le plie selon les lignes aa' 
et bb', puis selon ce' et dd', toujours vers le même côté. Puis on fait 
les plis AA', BB', CC, et DD' qui sont également des plis faits vers le 
même côté ; on les obtient en appliquant Ac contre Aa et en pinçant 
le long de la ligne AA', et ainsi de suite pour les autres angles. Gela 



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198 CHAPITRE XIV 

donne une botte incomplète avec des oreillettes aux angles ; pour la 
compléter, on retourne les oreillettes en dehors, et on les applique 
contre les petits côtés de la boite ; pour les assujettir dans cette posi- 
tion et achever la boite, il n'y a plus qu'à rabattre en dehors, et 
pincer, contre les petits côtés, les bouts débordants, c'est-à-dire, tout 
ce qui est en dehors des lignes A' B' et G' D'. 

Les boîtes ainsi construites se laissent facilement défaire sans 
se briser, pour mettre à nu le bloc de masse d'enrobage solidifié, et 
peuvent servir à plusieurs inclusions; celles qui ont servi sont sou- 
vent meilleures que les neuves. 

d. Une autre sorte de boîte très commode se fait en entourant un 
bouchon d'une collerette de papier tenue en place par une épingle. 
La collerette se fait d'une bande de papier dont on fait passer plusieurs 
tours autour du bouchon, qu'elle déborde de la hauteur voulue 
(Og. 2). 

Pour faire l'inclusion dans ces boîtes, on peut ou bien y placer 
d'abord l'objet et le maintenir dans une position voulue au moyen 
d'épingles, après quoi on verse la masse liquide qu'on laisse solidifier 
avant de retirer les épingles ; ou bien, on verse dans la boite un peu 
de masse qu'on laisse devenir assez solide pour que l'objet ne s'y 
enfonce pas trop, on pose l'objet sur cette couche, et l'on verse le 
reste de la masse. 

e. Leuckart, de son côté, fait usage de boites métalliques à parois 
mobiles. Elles sont composées de deux pièces métalliques (le mieux 
en laiton, et creuses pour ne pas absorber trop de chaleur) ayant 
la forme qu'on leur voit sur la figure 3. Pour faire une boîte avec 
ces formes, on les enduit de glycérine et on les pose sur une plaque 
de verre également enduite de glycérine, en les rapprochant de 
manière à former un rectangle de la superficie voulue. Il est évident 
qu'on peut varier à volonté la longueur de la boîte avec la même 
paire de formes, mais, pour varier la hauteur de la boîte, il faut 
employer d'autres formes. Pour faire l'inclusion dans ces boîtes, on 
chauffe tout l'appareil, verre et pièces métalliques, on place l'objet, 
on verse la masse fondue, puis, avec une aiguille chauffée, on donne 
à l'objet la position voulue, on laisse refroidir, et, après refroidisse- 
ment, on n'a plus qu'à écarter les parois de la boîte pour obtenir un 
moule englobant l'objet et prêt à être coupé. 

Cette méthode est surtout utile parce qu'elle donne un moyen assez 
commode A'orienter de petits objets, même sous le microscope à dis- 
section, la masse à inclusion étant facilement maintenue à l'état 
liquide par le chauffage ; on peut chauffer l'appareil de temps à autre 



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MÉTHODES d'inclusion 199 

avec la flamme d*une lampe à alcool, ou bien employer uq dispositif 
permettant de le chauffer par la circulation d'un courant d'eau 
chaude, comme dans les formes connues de platines chauffantes. 

/*. Selenka a décrit et figuré un appareil très simple visant au 
même but. C'est un tube de verre à travers lequel on fait passer un 
courant d'eau chaude, une dépression centrale servant à recevoir la 
paraffine (voyez description et figures dans le Zool. Anzeig,^ 1885, 
p. 419). Une modification de cette méthode a été décrite par Andrews 
dans Amei\ NaturaL, 1887, p. 101 (Cf. ZeiL f. tciss. Mik., IV, 3, 1887, 
p. 375). 

Nous décrirons plus loin des procédés d'orientation s'appliquant 
spécialement à la méthode de la paraffine et à la méthode du collo- 
dion respectivement. 

262. Choix d'une méthode. — Nous avons déjà fait entendre 
plus d'une fois que parmi les nombreuses méthodes d'inclusion qui 
ont été imaginées il y en a deux qui sont d'une importance capitale, 
la méthode de la paraffine, et celle du collodion. Les avis sont 
encore partagés sur la valeur respective de ces deux méthodes. 

Il nous parait évident que chacune de ces méthodes a ses qualités, 
et les défauts de ses qualités. Le collodion ne fournit pas avec de 
petits objets des coupes aussi minces, et cela de bien loin, que celles 
qu'on peut obtenir avec la paraffine. 11 est difficile avec le collodion 
d'obtenir des coupes de moins de 7 microns d'épaisseur; tandis 
qu'avec la paraffine on en fait de 1 micron. Il est donc obligatoire de 
prendre la paraffine pour tout travail qui demande des coupes très 
minces. Et Ton peut dire que de nos jours c'est un cas qui se présente 
très souvent. D'un autre côté, la paraffine ne fournit des coupes 
très minces qu'avec de petits objets ; avec de gros objets, ceux de 
plus de 15 millimètres de côté, il est difficile d'obtenir des coupes 
plus fines qu'avec le collodion ; les coupes faites dans de grands blocs 
de paraffine ayant une tendance à se fendre ou à se tasser. Pour de 
grands objets donc le collodion donne de meilleurs résultats. 

Quelques auteurs croient que le collodion est plus inoffensif envers 
les tissus que la paraffine. Après bien des comparaisons je n'ai pas 
pu établir une différence sensible à cet égard. 

Nous pensons donc qu'il faut admettre que la méthode de la paraf- 
fine est la méthode générale, et que le collodion doit être réservé 
pour les gros objets et pour certains cas spéciaux. On n'emploiera 
les masses aqueuses, telles que la gomme ou la gélatine, que pour 
des cas tout à fait spéciaux. 



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CHAPITRE XV 

INCLUSION A LA PARAFFINE ET MASSES SEMBLABLES 
(savon, gélatine) 



263. Pénétration des objets. — Le premier stade du procédé 
de la paraffine consiste dans la pénétration des objets par un dissol- 
vant de la paraffine. C'est une partie très importante de la manipu- 
lation et qui demande à être faite avec beaucoup de soin. On fait en 
sorte que la pénétration soit graduelle, ou bien en mettant le liquide 
de pénétration sous Talcool qui contient les objets, de la manière que 
nous avons expliquée au numéro 6, ou bien en passant les objets par 
des mélanges successifs d'alcool et de liquide de pénétration renfer- 
mant des proportions de plus en plus fortes de ce dernier. Il va sans 
dire qu'on ne doit opérer qu'avec des objets très scrupuleusement 
déshydratés. . 

Le choix d'un liquide de pénétration convenable est chose très 
importante. On emploie l'essence de térébenthine, l'essence de girofle, 
la créosote, la benzine, le xylol, le toluol (ou toluène), le naphte, 
l'essence de bois de cèdre, le chloroforme et d'autres. Ces liquides 
ont tous des propriétés qui les rendent plus ou moins propres à la 
pénétration, selon la nature des objets avec lesquels on les emploie. 

La térébenthine pénètre bien et se mêle facilement à la paraffine, 
deux qualités importantes. De plus, elle ne rend pas les objets cas- 
sants, ce qui est une qualité précieuse. Mais ce réactif a le défaut, 
qui nous paraît très grand, d'altérer, peut-être à un plus haut degré 
qu'aucun autre, la structure des éléments délicats. Nous pensons 
qu'il doit être évité toutes les fois qu'on désire bien conserver la 
structure des cellules. 

L'essence de girofle pénètre très énergiquement, et conserve bien 
la structure des cellules ; mais elle a deux défauts : elle a une grande 



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INCLUSION A LA PARAFFINE ET MASSES SEMBLABLES 201 

tendance à rendre les tissus cassants, et elle se mêle très lentement à 
la paraffine, ce qui nécessite des bains de paraffine très prolongés. 
Pour éviter cet inconvénient, Fol a recommandé de pénétrer d'abord 
par Tessence de girofle et ensuite par la térébenthine ; par ce moyen 
on arrive sans doute à pénétrer rapidement leé objets et par l'essence 
et par la paraffine, mais il ne nous semble pas qu'on écarte Faction 
nuisible de la térébenthine que nous avons reprochée à ce réactif. 

Nous n'avons pas d'expériences personnelles sur la créosote, la 
benzine et le xylol. La benzine a été récemment recommandée par 
Brass (Zeit. f, wiss. Mik,, II, 1885, p. 301). D'après M. Heidenhain 
(Kern und Proioplasma^ p. 114), le xylol serait très nuisible aux cel- 
lules ; il emploie l'essence de bergamote. 

Le toluène a été préconisé par Holl {ZooL Anzeig., 1885, p. 223). 
HoLL trouve que ce liquide est très pénétrant. Selon Holl, il n y aurait 
pas nécessité de rendre la pénétration graduelle en mettant le toluène 
sous Talcool, ou en passant par des mélanges de toluène et d'alcool ; 
et il n'y aurait pas nécessité non plus de rendre graduelle la péné- 
tration par la paraffine; il met les objets pénétrés directement dans 
un bain de paraffine pure. 

Le naphte a été recommandé par Webster {Joum. of Anal, and 
Phys,, XXV, 1891, p. 278). Pour les objets volumineux ce corps a 
l'avantage d'être très peu coûteux. L'auteur nous écrit que le naphte 
ordinaire du commerce suffit en général, mais que pour des travaux 
délicats la marque Persian naphtha (naphte de Perse) serait à pré- 
férer. FiELD et Martin (Zeit. /". wiss. Mik,, XI, I, 1894, p. 10) recom- 
mandent un pétrole volatil, Petroleum-aether. 

Le chloroforme possède de bonnes qualités ; il se mêle assez facile- 
ment à la paraffine, et après évaporation graduelle par la chaleur du 
bain de paraffine, il laisse après lui une paraffine très homogène et 
ayant très peu de tendance à cristalliser. Il a deux défauts qui de- 
viennent très sérieux pour le cas de certains objets : il est si peu 
pénétrant que des objets volumineux ou peu perméables ne se laissent 
pénétrer qu'après un temps considérable, quelquefois même pas du 
tout; puis il est nécessaire de l'éloigner ensuite très scrupuleusement 
des objets, soit par la chaleur, soit en changeant la paraffine, car la 
présence d'une trace même de chloroforme dans la paraffine suffit 
pour rendre la masse molle et impropre à fournir de bonnes coupes. 
Et cela demande beaucoup de temps : pour des objets volumineux 
jusqu'à deux jours ou plus. Le chloroforme doit donc être réservé 
pour les objets petits et perméables, pour lesquels on le trouvera en 
maintes occasions très commode. 



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202 



CHAPITRE XV 



On a aussi recommandé Thuile d'aniline (voyez au chapitre des 
Agents éclaircissants). 

L'Essence de bois de cèdre (À. Bolles Lëe, ZooL Anz., 1885, 
p. 563) réunit à un haut degré les bonnes qualités de tous ces éclair- 
cissants. Elle pénètre avec non moins d'énergie que Tessence de 
girofle ; elle conserve admirablement les caractères les plus délicats 
des cellules ; elle se mêle facilement à la parafflne ; et elle ne rend pas 
les tissus cassants, même après un séjour prolongé. Depuis que nous 
avons appris à connaître les propriétés de cette essence, nous l'em- 
ployons à litre de liquide normal de pénétration pour les inclusions, 
et nous la recommandons particulièrement pour cet usage. Les cas 
pour lesquels on doit lui préférer le chloroforme sont rares. C'est tou- 
jours l'essence épaissie que j'emploie. 

264. Bain de parafflne. — Les objets ayant été dûment pénétrés 
par un dissolvant de la paraffine, il s'agit maintenant de remplacer 
graduellement ce dissolvant par la paraffine fondue. Ce remplace- 
ment graduel peut se faire de deux manières, selon qu'il s'agit d'un 
dissolvant volatil comme le chloroforme, ou d'un dissolvant qui ne 
l'est pas, comme l'essence de cèdre. 

Dans l'emploi de l'essence de cèdre ou de térébenthine ou d'un 
autre liquide non volatil, voici comment on procède d'habitude. Les 
objets sont mis dans un mélange de paraffine et d'essence fondant à 
une température peu élevée, par exemple 38** G., et on les laisse dans 
ce mélange, maintenu à la température voulue à l'aide d'un bain- 
marie ou d'une étuve à température constante, jusqu'à ce qu'ils en 
soient pénétrés. On peut déjà porter la température de ce bain pré- 
liminaire à celle du point de fusion de la paraffine choisie pour la 
masse d'inclusion définitive, mais on fera bien de ne pas dépasser 
cette limite. Un mélange convenable pour ce premier bain peut se 
faire avec des parties égales d'essence et de paraffine dure, c'est-à- 
dire fondant à 50** environ. Ou bien, on peut suivre la pratique de 
quelques naturalistes qui emploient non un mélange de paraffine 
avec un dissolvant, mais une paraffine pure fondant à une tempéra- 
ture suffisamment basse. On trouve maintenant dans le commerce 
des paraffines fondante 36" C. Lorsqu'on croit que les objets sont 
dûment saturés de ce mélange, ou de paraffine molle, on les porte 
dans la masse définitive dont on veut se servir pour les coupes, et 
on les y laisse, à la température de fusion de la masse, jusqu'à ce 
qu'ils en soient parfaitement pénétrés. Il est quelquefois nécessaire 
de leur donner un troisième bain de paraffine pure pour enlever 



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1>XLUSI0N A LA PARAFFINE ET MASSES SEMBLABLES 203 

jusqu'aux dernières traces du liquide de pénétration. Ces opérations 
accomplies, on verse les objets et la masse dans une boite d'inclu- 
sion, et Ton y oriente l'objet dans la position voulue, ou bien on 
laisse refroidir le tout dans le récipient qui a servi au dernier bain. 

Nous aurons à revenir sur cette partie de la manipulation. 

La durée de ces bains doit nécessairement varier selon la nature 
de l'objet et son volume. Un embryon de la grosseur d'un pois doit 
être parfaitement pénétré par un séjour de trente minutes dans le 
mélange et d'une heure dans la parafQne pure fondant & 4S^ G., du 
moins si Ton emploie l'essence de cèdre. 

Je dois dire ici que toute cette pratique de bains successifs de mé- 
langes d'essence et de paraffine me parait élre en général superflue. 
Avec l'essence de cèdre en tout cas, aucun mélange n'est nécessaire, 
et l'on peut porter directement dans la paraffine fondue. La pratique 
de bains successifs de paraffine molle et de paraffine dure me paraît 
entièrement illusoire. 

Si l'on emploie le chloroforme, on peut également suivre la marche 
que nous venons de décrire, si on le désire. Ainsi, on peut employer 
avec BûTScuLi, un bain préliminaire d'un mélange à parties égales 
de paraffine dure et de chloroforme, mélange fondant à 35<> environ, 
suivi d'un bain de paraffine pure. Mais il vaut mieux profiter de la 
volatilité du chloroforme, et employer la méthode élégante de Gies- 
BRECHT et de BuTscHLi (Zool. Anzeig.j 1881, p. 484; Biol. Centralbl., 
1881, p. 591). Les objets, ayant été soigneusement déshydratés par 
l'alcool absolu, sont pénétrés de chloroforme, auquel on peut ajouter 
en cas de nécessité un peu d'éther sulfurique pour les empêcher de 
flotter. On chauffe le tout au bain-marie et Ton ajoute au chloroforme 
par intervalles de petits morceaux de paraffine. A mesure que la 
paraffine fond, on en ajoute et l'on continue à le faire aussi longtemps 
que des bulles de vapeur se dégagent des objets. Lorsque les bulles 
ne se forment plus, on peut élre sûr que les objets sont pénétrés de 
paraffine. Il ne reste plus qu'à chasser le chloroforme, ce qu'on fait 
en continuant à chauffer, à la température de fusion de la paraffine, 
jusqu'à ce que tout le chloroforme soit entièrement volatilisé. Il est 
urgent que le chloroforme soit entièrement chassé, car, s'il en reste 
une trace dans la paraffine, celle-ci reste si molle qu'il est impossible 
d'en obtenir de bonnes coupes. Pour savoir si tout le chloroforme est 
volatilisé, il suffit de plonger une aiguille chauffée dans la masse; 
elle ne doit pas provoquer un dégagement de bulles. 

L'évaporation du chloroforme est une opération souvent très 
longue ; avec des objets un peu volumineux elle exige des jours 



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^^■ 



20 i 



CHAPITRE XV 



entiers. C'est pour ce motif, entre autres, que nous pensons que la 
méthode du chloroforme n'est indiquée que pour les objets très 
petits. 

265. Etuves et bains-marié. — Il est important que la paraffîne ne 
soit pas exposée à une atmosphère humide pendant qu'elle est à Tétat 
liquide. Si donc on fait usage d*un bain-marie pour les inclusions, celui-ci 
doit être agencé de manière à ne pas exposer la paraffine à la vapeur d*eau. 
Un modèle très commode est celui de Paul Mayer, dont on trouvera une 
description dans Joum. Roy. Mie, Soc.,, ^883, p. 146. 

On peut se le procurer pour un prix peu élevé en s'adressant à la direc- 
tion de la Station zoologique de Naples, ou à la Maison Paul Rousseau, 24, 
rue des Fossés-St- Jacques, à Paris. Mais il vaut toujours mieux se servir 
d'une étuve. Nous recommandons particulièrement le modèle dont on trou- 
vera une description dans le Lehrbuch de Fol, p. 121. On trouvera dans la 
Zeù. f. wiss. Mik. ou dans le Joum. Roy. Mie. Soc. et autres journaux techni- 
ques de ces dernières années de nombreuses descriptions d*étuves thermos- 
tatiques. La plupart de ces appareils sont construits pour le chauffage au 
gaz. Pour les laboratoires qui ne possèdent pas de gaz, citons l'appareil 
chaufTable au pétrole fabriqué par F. Santorius àGottingen {Zeit. f, xoiss. 
Mik., X, 2, 1893, p. 161), et celui d'ÂLTMANN {ibid., p. 221 ; Cf. Centralb. f. 
Bacterlol., etc., XII, 1892, p. 654), également construit pour le pétrole. 

266. Inclusion dans le vide. — Il est des objets qui, soit à cause de 
leur grosseur, soit à cause de leur structure, ne se laissent pas pénétrer par 
la paraffine employée de la manière ordinaire, même après des heures ou 
des jours de séjour dans le bain de paraffine. Pour ces objets il convient 
d'employer la méthode dite c de Tinclusion dans le vide >, ou mieux c à 
basse pression >, méthode qui a non seulement l'avantage de garantir une 
pénétration complète en un temps très court, — quelques miuutes, mais 
aussi celle de prévenir les effondrements de tissus qui peuvent facilement 
avoir lieu dans l'inclusion d'objets qui possèdent des cavités internes, quand 
on emploie la méthode ordinaire. En principe, cette méthode consiste à 
faire passer l'objet dans des bains de paraffîne placés dans le vide ; on y 
arrive avec un dispositif quelconque permettant de maintenir la paraffine à 
l'étal liquide. On trouvera dans le ZooL Anzeig., 1884, p. 230, une descrip- 
tion avec figures du dispositif employé par Hoffmann. Dans cet arrange- 
ment, le vide est produit par une pompe pneumatique aspirante à eau, les 
baquets contenant la paraffine étant placés dans un dessiccateur maintenu 
au bain-marie et percé d'une ouverture par laquelle [lasse un tube qui le 
met en rapport avec la pompe aspirante. Cet appareil, qui est très simple 
et efficace, demande cependant qu'on ait à sa disposition de l'eau sous forte 
pression. Pour remédier à cet inconvénient, Francoite a imaginé un dis- 
positif très simple qui permet de produire un vide suffisant par la conden- 
sation de la vapeur d'eau. On en trouvera la description avec la figure dans 
le Bull. Soc. Belge Micr., p. 45. 

FoL [Lelirb., p. 121) emploie la pompe aspirante à eau de la manière pro- 
posée par lloil'mann, mais il a simplifié l'appareil pour la réception de l'ob- 
jet. Au lieu de mettre les objets avec la paraffine dans des baquets qu'on 



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INXLUSION A LA PAaAFFINE ET MASSES SEMBLABLES 205 

introduit dans le dessiccateur où se fait le vide, Fol met Tobjet avec la paraf- 
fine dans un tube de verre à forte paroi, fermé par le bas {une petite éprou- 
vette) et muni en haut d'un bouchon de caoutchouc traversé par un tube 
qui le met en communication avec la pompe. L'éprouvette plonge dans un 
récipient contenant de Teau à la température de fusion de la paraffine. On 
fait le vide une ou deux fois, on attend cinq à trente minutes, ou jusqu'à 
ce que Ton constate qu'il ne se forme plus de bulles d'air autour de l'objet ; 
puis on laisse entrer l'air, on jette la paraffine qui a acquis une consistance 
anormalement dure, et on refait l'inclusion dans de la paraffine fraîche 
d'après la méthode ordinaire. 

Voyez aussi au besoin la méthode de Pringle, dans Journ, of Path and, 
BacterioL, 1892, p. 117, ou dans /owni. Jioy, Mie. Soc, 1892, p.* 803. 

267. Inclusion définitive et orientation. — Aussitôt que les 
objets sont bien et dûment pénétrés de la paraffine, on procède à 
rinclusion définitive selon l'une des méthodes qui ont été exposées au 
numéro 261 . Si Ton a choisi le procédé du verre de montre, et si Ton a 
donné le bain de paraffine dans ce récipient même, il ne sera pas en 
général nécessaire de passer à une manipulation spéciale d'enrobage ; 
il n'y a plus qu'à refroidir la masse et en découper un bloc contenant 
l'objet. 

Mais il se peut que Ton ait besoin de donner à l'objet une position déter- 
minée et reconnaissable par la suite dans la paraffme ; en d'autres termes, il 
se peut qu'on ait besoin d'un procédé d'orientation. Le numéro 261 adonné 
des indications suffisantes pour permettre d'obtenir une orientation gros- 
sière mais généralement suffisante par la méthode des boites de carton ou 
par celle des boites métalliques. Voici maintenant un procédé dû à Patten 
{Zeit. f, wiss, Mik,^ XI, I, 1894, p. 13) qui est susceptible de plus de pré- 
cision, et permet d'orienter plusieurs petits objets dans le même bloc de 
paraffine. A cette fin, on commence par fixer les objets en position avant de 
les mettre dans le bain de paraffine. On les pénètre d'abord par l'essence 
de bergamote ou de girofie. On se procure du papier à lettres de cette sorte 
qui a des côtes élevées se croisant à angle droit. Ce doit être du papier 
glacé; mais à défaut de papier à côtes on peut prendre du papier lisse et 
le régler avec un crayon tendre. On prépare maintenant un mélange dû 
collodion et essence de girofie, de la consistance de miel épais. On pose sur 
un petit rectangle du papier, une goutte de ce mélange, ou plusieurs 
gouttes si Ton opère avec plusieurs objets. On prend les objets, on les laisse 
égoutter et on les pose dans les gouttes de collodion, en donnant à chacun 
une position déterminée par rapport aux lignes du papier. Gela se fait 
au besoin sous la loupe ou même sous le microscope composé. Les 
objets gardent la position qu'on leur a donnée. Cette opération accom- 
plie, on met le tout dans de l'essence de térébenthine, qui enlève l'essence 
de girofie et laisse les objets fixés dans le coUodion. On passe au bain de 
paraffine, et après inclusion et refroidissement de la manière usuelle, on 
découpe un bloc de paraffine comprenant le papier. Le papier se laisse 
maintenant enlever sans peine, laissant la face inférieure de la paraffine 



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206 CHAPITRE XV 

gravée des lignes d'oricntatioa du papier, au-dessus desquelles se trouvent 
les objets dans l'orientation qu'on leur a donnée au commencement. 

Une modification plus compliquée de cette méthode a été décrite par 
WooDWORTii, dans Contrib, from the ZooL Lab. Mus. Comp, Zool.^ Harvard, 
XXV, 3, 4893, p. 45. 

Une méthode similaire a été décrite par Field et Martis, dans Zeit, f. 
W188, 3m., XI, I, 189t, p. 11. 

268. Refroidissement de la masse. — La pénétration des 
objets par la masse d'inclusion ayant été dûment accomplie, on doit 
procéder au refroidissement de la masse. C'est là un point auquel 
les anatomistes attachent en général une grande importance. Ils 
admettent que la paraffine est un corps cristallisablc, et que, si on 
l'abandonne au refroidissement lent, il se forme très souvent des 
cristaux qui prennent naissance jusque dans Tintcrieur des tissus, au 
grand détriment des structures délicates. Il serait donc nécessaire de 
surveiller le refroidissement et d'empêcher qu'il n'ait lieu lentement. 
Je crois qu'on a un peu exagéré l'importance de cette préeaution. 

Après avoir pratiqué comme les autres pendant de longues années 
le rite du refroidissement, j'en suis arrivé à douter de son impor- 
tance et de son efficacité. J'ai eu souvent des masses excellentes après 
un refroidissement lent ; et j'en ai eu de mauvaises après un refroi- 
dissement conduit selon les règles. M. Lindsay Joiinson, qui a fait de 
nombreuses expériences comparées sur ce sujet, a eu l'obligeance de 
m'écrire qu'apparemment la manière du refroidissement n'est qu'une 
cause minime de la formation de cristaux. Celle-ci serait provoquée, 
selon lui, par la présence d'une petite quantité de l'essence de péné- 
tration demeurée dans la paraffine. En tout état de cause, si l'on 
désire prendre toutes les précautions possibles, voici comment on peut 
procéder pour le refroidissement: 

Si les objets sont petits, on peut les sortir de la masse fondue avec 
aussi peu de paraffine que possible, à l'aide d'une spatule, et les 
laisser refroidir sur des lames de verre ou sur la spatule elle-même, 
puis les ajuster avec une aiguille chauffée sur un cylindre ou sur 
un cône de paraffine (voyez n*' 261 (b) ; Born, Arch. fur mik. Anat., 
XXllI, 1883, p. §91 ; Brass, Zeil. f, wiss. Mik., II, 1885, p. 301). Pour 
fixer les objets sur le cône de paraffine avec l'aiguille chauffée, il est 
bon d'observer la précaution de ne pas employer une aiguille chauffée 
au delà de la température nécessaire, et de ne faire fondre que la 
plus petite quantité possible de paraf/lne; moins on en fait fondre 
à la fois et plus elle se refroidit rapidement. En pratiquant cette 
méthode avec adresse, on obtient des préparations imbibées et entou- 



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INCLUSION A LA PAKAITINE ET MASSES SE3IBLABLES 



207 



rées d'une paraffine parfailement homogène, sans cristaux et sans 
bulles. 

Si rinclusion s'est faite dans des boites de papier, on peut les mettre 
refroidir sur une plaque de pierre ou de métal, ou bien (Caldwell) 
les mettre dans Teau froide. Il faut en ce cas commencer par tremper 
seulement le fond de la boite dans l'eau, et ne la submerger en entier 
que lorsque la paraffine est prise ; autrement on verrait se produire 
dans la masse des creux qui se rempliraient d'eau. Frenzel {A7'ch. 
f. mik. Anat., XXV, 1885, p. 142) recommande de jeter la masse 
entièrement dans Teau aussitôt qu'elle est suffisamment prise. Graf 
Spee {Zeit. f. toiss. Mik., II, 1885) fait l'inclusion de petits objets 
dans des verres de montre, qu'il met ensuite sur de l'eau froide. 
Selenka refroidit ses objets en faisant passer un courant d'eau froide 
à travers le tube & inclusion dont nous avons parlé ci-dessus (n® 261 (/*). 

Je me trouve très bien du procédé des verres de montre ; rien de plus 
simple que de les faire flotter sur de l'eau froide. Pour découper 
ensuite le bloc voulu, il e^t bon d'employer un scalpel légèrement 
chauffé; avec cette précaution la paraffine a moins de tendance à se 
briser ou à former des fentes qui peuvent endommager les objets. 

Les auteurs admettent qu'il est bon de faire les coupes aussitôt que 
possible après le refroidissement complet de la masse, parce que la 
paraffine continue à cristalliser lentement même après refroidisse- 
ment ; dans les blocs de paraffine qui ont été conservés pendant des 
semaines ou des mois on est exposé à trouver des cristaux très volu- 
mineux. C'est fort possible qu'il en soit ainsi, mais il est certain que 
l'inconvénient est rarement grave. J'ai des blocs vieux de plusieurs 
années enrobant des préparations qui se montrent aussi bien conser- 
vées que le premier jour. 

269. Mise en coupes. — Les objets ayant été enrobés par un de 
ces procédés, et orientés dans la position voulue, et le refroidissement 
ayant été obtenu par une des méthodes indiquées, doivent maintenant 
être examinés avec soin. 11 arrive souvent que la paraffine en se 
refroidissant forme autour des objets des bulles, des cavités, ou des 
taches opaques. On enlève les taches et l'on remplit les cavités en 
pratiquant avec une aiguille chauffée des piqûres autour de l'objet 
dans tous les endroits où la paraffine ne présente pas le degré d'ho- 
mogénéité voulue ; il faut même quelquefois promener l'aiguille 
entièrement autour de l'objet. Aussitôt que la paraffine ainsi fondue 
s'est complètement refroidie, les manipulations de l'enrobage sont 
terminées, et Ton peut procéder h la mise en coupes. 



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208 



CHAPITRE XV 



Les coupes d'objets enrobés par Tinfiltration avec la paraffine se 
font à sec, c'est-à-dire avec un couteau qui n'est ni mouillé d'alcool 
ni d*aucun autre liquide. 

Enroulement des coupes. — Les coupes faites de cette manière 
ont une grande tendance à s'enrouler sur la lame du couteau et à 
former ainsi des rouleaux qu'il est toujours difficile et souvent impos- 
sible iTétaler sans les briser. Voici quelques indications qui peuvent 
aider i\ parer à cet inconvénient. 

Le couteau doit, autant que possible, avoir une position transver- 
*iale, faisant un angle droit avec la ligne de section ; caries couteaux 
obliques provoquent ou du moins facilitent Tenroulement. 

La paraffine doit posséder un degré de dureté proportionné à la 
température du laboratoire. Nous avons trouvé qu'une paraffine 
ayant son point de fusion à 4S^ G. est celle qui convient lorsque la 
température du laboratoire se trouve entre 15 et 17** G. Pour une 
Leniprrature de 22° G. il faut une paraffine fondant à 48** G. *. Nous 
avons établi ces températures d'après des observations faites dans un 
laboratoire chauffé par une cheminée ouverte; il est possible qu'elles 
ne s"a[ipliquent pas parfaitement aux pièces chauffées par des poêles, 
qui s*jnt dans des conditions très différentes à l'égard du rayonne- 
ment de la chaleur. Et nous les avons établies d'après des expériences 
faites avec le microtome Thoma. Les microtomes à couteau fixe 
(Cambridge, Minot, etc.) permettent l'emploi d'une paraffine beau- 
coup plus dure. D'après notre expérience, l'emploi d'une masse 
tîonvenable est le plus pratique de tous les moyens qui ont été pro- 
posés pour empêcher l'enroulement des coupes. 

Si, après qu'on a commencé de faire les coupes, on s'aperçoit que la 
masse n'a pas été convenablement choisie, on peut encore la corriger sans 
déranjjrerrobjet. Si la masse est trop dure, il faut placer près du microtome 
une lampe munie d'un réflecteur parabolique à l'aide duquel on projette sur 
Tobjei le:§ rayons calorifiques de la flamme de la lampe. La température 
convenable s'obtient en approchant ou éloignant la lampe. Si, au contraire, 
la masse s'est montrée trop molle, on peut la durcir en plaçant au foyer 
d'un iL'Ilocteur pareil un morceau de glace au lieu de source de chaleur 
I Fol. Lehrb., p. 123). H suffit du reste souvent de modifier la température 
de Tappartement en ouvrant ou en fermant une fenêtre, ou de changer la 
posiliori du microtome de manière à le mettre plus au frais ou plus au 
chaud. 

' [k's parafûnes ayant approximativement ces points de fusion sont faciles à 
trouver dans le commerce. On peut aussi s'en procurer en combinant dans les 
ItraporlLons voulues une pararfine très dure et une paraffine très molle. Pour 
faire une masse fondant à 45" C. on peut prendre deux parties de parafline fon- 
dant :\ 00% et une partie de paraffine fondant ii 36°. 



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INCLUSION À LA PARAFFINE ET MASSES SEMBLABLES 209 

On a proposé des masses spéciales ayaat moins de tendance à s*enrouler 
que la paraffine pure. Ainsi, on peut ajouter à la paraffine un peu de vase- 
line, environ un cinquième pour la paraffine dure. Nous ne recommandons 
pas ce moyen. 

On peut éviter renroulement en faisant les coupes en chaînes ou 
rubans continus. Dans ces conditions il n'y a en général que la pre- 
mière coupe de la chaîne qui se roule. Nous décrivons ce procédé 
dans le numéro suivant. 

On peut empocher renroulement par des moyens mécaniques. Le 
plus simple, et à notre avis le meilleur, de ces moyens consiste à 
retenir avec une aiguille courbée, avec une languette de papier, ou, 
ce que nous préférons, avec un petit pinceau, le bord de la coupe 
qui commence à se rouler. Des appareils très ingénieux, consistant en 
des barres ou des rouleaux ajustés le long du tranchant du couteau, 
ont été proposés. Nous ne nous en servons pas et ne les recomman- 
dons pas; car outre qu'ils sont en général d'une construction com- 
pliquée et toujours difficiles à ajuster, nous leur reprochons d'aplatir 
et de tasser les coupes d'une manière nuisible pour les structures déli- 
cates. On trouvera la description du Schnittstrecker de F.-E, Schultze 
dans le Zool, Anzeig,, 1883, p. 400 ; de celui de Mayer, Andres et Gies- 
BRECiiT dans Mitth. a. d. Zool. StaL Neapel, IV, 1883, p. 429 ; de 
celui de Decker dans Arch, f. mik, Anat., XXIU, 1884, p. 637 ; de 
celui de Francotte dans BulL Soc. Belge de Mie, X, 1883, p. 55 ; de 
celui de Gage and Smith dans The Microscope, Feb. 1884, et dans 
WuiTMAN, Methods of research in microscopical Anatomy, 1885, 
p. 91 ; de celui de SxRASSERdansZetï. f. wiss. Mik., IV, 2, 1887, p. 218 ; 
de celui de Born, ibid., X, 2, 1893, p. 157, et dans /owrn. Roy. Mie. 
Soc:, 1894, p. 132. Ce dernier nous paraît peut-être le plus recom- 
mandable de tous. Un petit dispositif très simple se fait en coupant la 
tète à une épingle ordinaire et en fixant cette épingle au moyen de 
deux peCiles pelotes de cire sur la surface de la lame et parallèlement à 
son tranchant. On en règle l'élévation en l'enfonçant plus ou moins 
dans la cire (cite' (ïaprèsRef. Handbook oftheMed. Se, Supp., p. 440). 

Enfin, on peut renoncer à empêcher l'enrouleracnt, et se borner à 
le rendre moins nuisible. A cet efi'et, on taille le bloc de paraffine 
contenant Tobjet en prisme à arête très aiguë, de manière à donner 
aux coupes la forme d'un triangle isocèle juste assez large à sa base 
pour contenir la section de l'objet et dont la hauteur ait au moins 
cinq ou six fois la longueur de la base. L'arête du prisme étant 
orientée vers le tranchant du couteau, on obtient des coupes enroulées 
dont les spires vont en s'élargissant du sommet à la base, la section 

ANAT. UICROSC. 14 



.t: 
. I 



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210 



CHAPITRE XV 



de l'objet se trouvant dans la dernière spire, qui est la plus ouverte. 
La coupe étant placée sur un porte-objet avec la dernière spire en 
bas, il suffît de chauffer légèrement pour que la partie contenant 
Tobjet se déroule complètement. On éloigne le reste de la paraffine en 
la faisant fondre et en ajoutant un dissolvant. 

Voici un des meilleurs procédés pour dérouler les coupes (Henne- 
GUY, Joum. de VAnat. et de la Phys., 1891, p. 398). Après avoir 
étalé au pinceau une couche d*albumine de Mayer aussi mince que 
possible sur le porte-objet, on laisse tomber sur celui-ci quelques 
gouttes d'eau distillée qu'on étale avec un agitateur tenu horizontale- 
ment. Les coupes sont ensuite disposées en série à la surface de la 
couche d'eau. La lame de verre est portée sur la platine de l'étuve à 
inclusion, platine dont la température est de 45 à 50^ C. En quelques 
Instants les coupes se déplissent et s'étalent complètement sur le 
porte-objet. Celui-ci est alors placé à la partie supérieure de Tétuve, 
sur la lame de verre qui ferme le compartiment où sèchent le§ prépa- 
rations, et dont la température ne dépasse guère 40° G. Au bout de dix 
minutes, un quart d'heure, toute l'eau est évaporée, et on peut alors 
faire fondre la parafOne et ajouter un dissolvant. Il est important que 
la paraffîne ne fonde pas avant que toute l'eau soit évaporée, sans quoi 
les coupes n'adhèrent plus au porte-objet et risquent de se déchirer. 

270. Coupes en chaîne. — Rubans de coupes. — 11 arrive, 
dans certaines conditions, que si l'on fait une série de coupes sans 
enlever du couteau chaque coupe à mesure qu'elle se fait, mais en les 
laissant reposer sur la lame dans la position qu'elles y prennent 
d'elles-mêmes, on oblient une chaîne ou un ruban de coupes, chaque 
coupe se collant d'elle-même par ses bords antérieur et postérieur à 
celle qui la précède et à celle qui la suit. Des chaînes de coupes ainsi 
faites présentent sur les coupes isolées des avantages qui sont souvent 
d'une grande importance. La série se coupe beaucoup plus rapide- 
ment. Elle se laisse monter aussi beaucoup plus facilement, car pour 
placer la série sur le porte-objet, on n'a qu'à saisir la chaîne par un 
bout et la transporter intégralement sur la lame de verre. De plus, 
l'intégrité de la chaîne nous garantit l'intégrité de la série ; lorsque 
nous avons déposé sur le porte-objet une chaîne de coupes, nous 
pouvons être parfaitement certain qu'aucune coupe n'a été égarée, 
qu'aucune n'a été placée irrégulièrement, et que toutes ont gardé 
Tordre de succession dans lequel elles ont été coupées. Pour les tra- 
vaux embryologiques, on comprend à quel point cela est un avantage 
précieux. 



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INCLUSION A LA PARAFFINE ET MASSES SEMBLABLES 211 

Voici quelles sont, d'après notre expérience, les conditions néces 
saires pour la production des chaînes de coupes. 

1** La paraffine doit avoir une certaine consistance, c'est-à-dire 
qu*il faut employer une masse d'une dureté proportionnée à la tem- 
pérature du laboratoire. Nous n* avons rien à ajouter à ce que nous 
avons dit à ce sujet plus haut, numéro 269. 



On a recommandé de faire rinclusion dans de la paraftine dure, d*en 
tailler un bloc contenant Fobjet, puis d'entourer ce bloc d*une mince couche 
de paraffine molle, qu*on enlève ensuite des côtés du bloc, de sorte que les 
coupes présentent sur leurs bords antérieur et postérieur seulement une 

marge de paraffine molle plus propre à faciliter l'adhésion que ne Test la ' 

paraffine dure. On obtient facilement la production d'une couche de paraf- i 

fine molle autour du bloc en plongeant celui-ci pendant un instant dans de | 

la paraffine molle fondue. 

Spee, Brass et Foettingér recommandent une préparation spéciale de 
la paraffine d'inclusion. Nous parlerons plus loin de ces modes de prépa- 
ration. I 

On a aussi proposé d'enduire d'une couche très mince de solution de 
baume du Canada le côté du bloc de paraffine qui est tourné vers le cou- 
teau. I 

L'une et l'autre de ces méthodes peuvent être utiles, mais aucune n'est 

indispensable en général. 

I 

2*^ Le bloc de paraffine doit être taillé de façon à avoir ses bords, 
antérieur et postérieur, parallèles au tranchant du couteau. 

3^ Le couteau doit avoir une position transversale, c'est-à-dire que 
son tranchant doit faire angle droit avec la ligne de coupe. 

iP II faut faire les coupes en succession aussi rapidement que pos- 
sible, et surtout imprimer au couteau un mouvement très rapide. 
Pour réaliser cette condition, les microlomes de Caldwell, de la Cam- 
bridge Scientific Instrument Company, de Minot, Reinhold-Giltay, etc. , 
se montrent d'un grand secours, mais ils ne sont nullement obliga- 
toires ; on se tire bien d'aiTaire avec le microtome à glissement de 
Thoma ou de Schanze. 

271. GoUodiozmage des coapes fragiles. —Malgré les plus grandes 
précautions prises dans la préparation préliminaire ainsi que dans la péné- 
tration et l'infiltration, il arrive quelquefois que l'objet à couper est devenu 
cassant ou même friable ; il se brise devant le rasoir, ou ne donne que des 
coupes si friables qu'il est impossible de les monter sans déranger les rap- 
ports de quelques-unes de leurs parties. Les œufs surtout présentent assez 
souvent cet inconvénient. On y remédie en enduisant la surface de l'objet 
avant chaque coupe d'une mince couche de collodion, qui sert d'une manière 
parfaitement efficace à maintenir en position les parties des coupes les plus 
fragiles. 



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.212 CHAPITRE XV 

On avait débuté en déposant, avant chaque coupe» sur la surface libre de 
Tobjet une goutte de coUodion. Cette pratique a un inconvénient : la quan- 
tité de collodîon employée ramollit la paraffine à un degré nuisible, et, de 
^ plus, en séchant, donne aux coupes une tendance à s'enrouler. Voici, d'après 

Mark {Amer, NaluraL, 1885, p. 628 ; Joum. Roy. mie. Soc, 1885, p. 738), 
comment il faut procéder : 

Dans un petit flacon muni d'un pinceau qui passe à travers son bouchon 
et plonge, mais à une faible profondeur seulement, dans le collodion, on 
met un peu de collodion fluide. Le critère de la bonne consistance du col- 
lodion est que, quand on en applique une couche mince sur la paraffîne, 
celte couche doit sécher en deux ou trois secondes, sans laisser de vernis 
luisant à la surface de la parafflne. Dans cet état, le collodion parait ne pas 
produire de membrane à la surface de la paraffîne, et ainsi ne cause pas 
de tendance k s'enrouler dans les coupes ; d'autre part, il parait pénétrer la 
préparathDn à une certaine profondeur et en flxer les parties dans leurs posi- 
tions. Pour maintenir le collodion à ce degré de consistance, on a sous la 
main un flacon d'éther, avec lequel on allonge le collodion aussitôt qu'il 
commence à laisser des traces luisantes sur la paraffîne. 

Tout étant prêt pour l'opération des coupes, on retire le pinceau du flacon 
de collodion, on l'exprime en l'essuyant sur le goulot du flacon, de manière 
à l'avoir chargé seulement de peu de collodion, et, sans tarder, on enduit 
rapidement la surface de la préparation d'une mince couche de collodion. 
Il faut avoir soin de ne pas collodionner les faces verticales du bloc de pa- 
raffîne, et surtout celle qui est tournée vers l'opérateur, car si cela arrive, 
la coupe risque de s'attacher au couteau par ce bord et même d'être empor- 
tée et d'adhérer à la surface inférieure du couteau. Aussitôt que le collodion 
aura séché (nous avons dit que ce doit être en deux ou trois secondes), on 
fait une coupe. On retire le couteau, et, sans tarder, on passe une deuxième 
couche de collodion sur la surface nouvellement affranchie de la paraffîne. 
Pendant que cette deuxième couche sèche, on enlève du couteau la pre- 
mière coupe et on la porte sur un porte-objet préparé avec le fîxatif de 
ScïLELLiBAUM en ayant soin de l'y poser avec la surface collodionnée en des- 
sous. Puis on fait la deuxième coupe, et on répète toute la série des opéra- 
tions que nous avons décrites. Avec un peu de pratique on peut arriver à 
faire des coupes en chaîne, en coliodionnant chaque coupe. 
f^ IIenking {Zeit. f. tviss. Mik., III, 4, 1886, p. 478) reproche à ce procédé 

que l'éther du collodion ramollit la paraffîne, et préfère une solution de 
paraffîne dans l'alcool absolu. Ou bien, pour des objets extrêmement fra- 
giles, comme les œufs des Phalangides, une solution très claire de gomme 
laque dans l'alcool absolu. 

Rabl [ibid., XI, 2, 1894, p. 170) emploie de la paraffîne surchauffée, 
maintenue à environ 100<^ G. au bain-marie. Ce procédé a aussi l'avantage 
d'empêcher l'enroulement des coupes. 

IlEiDER (ibid.^ VIII, 4, 1892, p. 509 ; Embryonalentw. von Ifydrophilus, 
p. 12) emploie une solution faite en mélangeant du collodion à un volume 
égal de solution sirupeuse de mastic dans l'éther, et en allongeant le mélange 
d'éther jusqu'à ce qu'il soit parfaitement liquide. 

272. Nettoyage et montage des coupes. -> Pour débarrasser 
les coupes de la paraffine dont elles sont infiltrées, nous avons le 



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INCLUSION À LÀ PARAFFINE ET MASSES SEMBLABLES 213 

choix entre de nombreux dissolvants de la paraffine. On emploie 
la térébenthine, la térébenthine chauiïee, la créosote, un mélange 
de quatre parties de térébenthine avec une partie de créosote, un 
mélange de térébenthine et d'essence de girofle, le naphte, le pétrole, 
Tessence de bergamote, Tessence de cèdre et d'autres essences, Talcool 
absolu chaud, la benzine, le xylol, et même (pour des coupes conte- 
nant très peu de paraffine), la solution de baume de Canada dans le 
xylol dont on se sert pour le montage. Personnellement, nous don- 
nons au xylol la préférence sur tous ces dissolvants. Le naphte ne 
doit pas être employé pour les coupes destinées à être montées direc- 
tement dans le baume, vu qu'il ne se mêle pas parfaitement avec 
cette substance. 

Pour terminer la préparation, on chauffe le porte-objet (nous sup- 
posons qu*on y a déjà collé les coupes) au-dessus d'une petite flamme, 
et on le plonge aussitôt que la paraffine s'est fondue dans un tube de 
xylol ou autre dissolvant. Un séjour de quelques minutes ou même 
quelques secondes sufBra pour éloigner la paraffine par le xylol. Il 
n'y a plus alors qu'à ajouter une goutte de baume et un verre à cou- 
vrir. 

278. Résumé de la méthode de la paraffine. — Voici un 
exemple d'une inclusion à la paraffine réduite à sa plus simple expres- 
sion, c'est-à-dire dépouillée de tous les procédés accessoires ayant trait 
à l'orientation, à la collodionisation et à la sériation des coupes, etc. 
Déshydratez un petit objet dans l'alcool absolu. Mettez dans un petit 
tube bas un peu d'essence de bois de cèdre (assez pour couvrir l'objet). 
Versez sur l'essence une quantité pareille d'alcool absolu. Mettez 
l'objet dans cet alcool. Laissez-le (au mieux en bouchant le tube) 
jusqu'à ce qu'il soit tombé au fond de l'essence de cèdre, et que sa 
surface ne montre plus de couches réfringentes brillantes dues au 
mélange imparfait des liquides. Enlevez l'alcool avec une pipette. 
Faites fondre de la paraffine dans un verre de montre et mettez-y 
l'objet. Ayez soin que la paraffine soit de la dureté que nous avons 
recommandée au numéro 269. Après quelque temps, portez l'objet 
dans un autre verre de montre avec une nouvelle quantité de paraf- 
fine fondue. Ayez bien soin de ne pas laisser monter la température 
au-dessus du point de fusion de la paraffine (la paraffine surchauffée 
subit une élévation de son point de fusion et devient plus dure). Aus- 
sitôt que vous pensez que l'objet doit être parfaitement pénétré de 
paraffine pure, faites flotter le verre de montre sur de l'eau froide. 
Après refroidissement, découpez avec un scalpel légèrement chauffé 



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2i4 CHAPITRE XV 

un bloc de parafQne contenant Tobjet. Avec une aiguille chauffée, 
fixez ce bloc sur un cône de paraffine déjà fondue dans le porte-objet 
du microtome. 11 n'y a plus qu'à couper. Désirez-vous avoir les 
coupes en ruban ? Alors taillez soigneusement le bloc de parafQne en 
rectangle; taillez tout près de l'objet sur trois côtés, mais laissez un 
petit mur de paraffine sur le quatrième. Mettez le couteau dans la 
position transversale. Orientez le bloc de sorte que le côté qui a le 
mur de paraffine soit tourné vers le tranchant du couteau et soit 
parallèle à lui. Coupez rapidement. Collez la série de coupes sur 
porte-objet par l'une des méthodes que nous donnons dans le cha- 
pitre xvii. Chauffez un instant sur la flamme. Mettez pendant 
cinq minutes dans un tube de xylol. Montez au baume ou passez à 
Talcool pour colorer ensuite. 

FORMULES DES MASSES D'INCLUSION 
PARAFFINE E^T MÉLANGES DE PARAFFINE 

274. ParafAne pure. — Suivant nous, la paraffine pure forme, 
pour les travaux ordinaires, une masse bien préférable aux mélanges. 
Nous avons indiqué au numéro 269 les degrés de dureté de la paraf- 
fine qui nous paraissent les plus convenables. Aucune préparation 
spéciale de la paraffine n*est nécessaire en général. 

275. Préparation de la paraffine pure (Graf Spee, Zett. f. wiss. 
Mik., II, 4885, p. 8). — Graf Spee prend de la paraffine fondant à 50^ G. 
environ. Il chauffe dans une capsule de porcelaine avec une lampe à esprit- 
de-vin jusqu'à ce qu'il se produise des vapeurs blanches désagréables et 
que le volume de la masse éprouve une légère réduction. Gela arrive en un 
laps de temps variant de une à six heures, selon la quantité de paraffine 
employée. La masse est devenue d'un jaune brun, et au refroidissement elle 
présente une surface de section graisseuse ou savonneuse au toucher. Le 
point de fusion de la masse s'est élevé de quelques degrés. 

* Spee recommande cette masse pour la production de coupes en chaînes. 
f- On la trouve toute faite chez Grûbler. 

}l Brass [op, cit,^ p. 300) emploie de la paraffine vieillie, car il a 

[^. remarqué que la paraffine qui a été gardée pendant des années a 

p? perdu la faculté de cristalliser. Je pense que cette observation est 

fondée. 

Pour obtenir avec la paraffine du commerce une paraffine blanche, très 
i dure et bien homogène, Foettinger {Arch. de Biologie, VI, 1885, p. 424) 

, emploie un procédé compliqué qui ne nous a pas donné de bons résul- 

tats. 



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INCLUSION A LA PARAFFINE ET MASSES SEMBLABLES 



^5 



276. Paraffine et cérisine (Schulgin, ZooL Ànzeig.^ 1883, p. 21). — 
Paraffine fondant à 55^ G. ; cérisine, q. s. Si la masse ainsi obtenue est trop 
dure, ajouter de la vaseline, q. s. 

Paraffine et oire. — Schulgin emploie aussi un mélange de paraffine 
et de cire blanche dans les proportions de 10 à 1 ; nous ne savons pas si 
cette formule a été publiée. 

Brass (Zeil.f, wiss. Afik.^ II, 1885, p. 30!) recommande de prendre pour 
100 parties de paraffine 4 à 6 parties de cire blanche. ^Pour le nettoyage 
des coupes-, Brass emploie la benzine.) 

Walsem (i6irf., XI, 2, 1894, p. 216) conseille (pour les objets volumineux) 
l'addition de 5 p. 100 de cire jaune. 

MASSES AU SAVON 

277. Inclusions au savon. — Le savon offre comme masse d'inclusion 
des avantages qui sont dans certains cas d'une grande importance. Le savon 
étant soluble dans Falcool, et contenant une proportion considérable d'eau, 
permet Tinclusion par infiltration d'objets qui n'ont pas été déshydratés, 
considération qui peut être quelquefois très importante en histologie. Les 
masses sont pénétrantes, elles sont parfaitement transparentes, et possèdent 
une consistance qui fournit de très belles coupes. Après lavage, les coupes 
sont dans un état avantageux pour subir le traitement par les réactifs les 
plus divers. 

La transparence des masses au savon est d'un grand avantage pour l'orien- 
tation des objets. 

Le lecteur se rappellera que toutes ces masses sont alcalines, et peuvent 
décolorer des tissus colorés par des teintures qui ne résistent pas aux alca- 
lis ; pour la même raison, les lavages doivent être très soigneusement faits, 
autrement la conservation des tissus sera compromise. Mais c'est vraisem- 
blablement surtout parce que le savon se prête moins bien que la paraffîne 
à la confection rapide de séries ininterrompues de coupes qu'il a cédé le 
pas à la paraffine. 

278. Savon ordinaire à l'alcool (Kadyi, Zool.Anzeig,, 1879, p. 477). 
— On prend du savon blanc ordinaire du commerce (savon au stéarate de 
soude, savon animal). On le râpe; et l'on en fait dissoudre 25 grammes 
dans 100 ce. d'alcool à 96<3, en chauffant dans une cornue au bain-marie. 
On filtre, si cela parait nécessaire. Si maintenant on verse dans un verre de 
montre un peu de la solution, celle-ci se prendra immédiatement en une 
masse blanche. Cela indique que la solution ne contient pas assez d'eau ; on 
en ajouta par petites quantités, et après chaque addition on étudie l'effet 
produit, en versant une goutte de la solution dans un verre de montre. On 
verra la masse devenir de plus en phis transparente jusqu'à ce que, enfin, 
elle ne montre plus qu'une faible opalescence bleuâtre. La préparation est 
alors terminée. 

Il n'est pas possible d'indiquer d'avance la quantité précise d'eau qu'il 
faut ajouter, puisque cela dépend naturellement de la proportion d'eau 
déjà contenue dans l'échantillon de savon employé. Nous pouvons dire 
que pour 120 grammes de solution de savon il faudra le plus souvent 5 à 
10 grammes d'eau« 



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216 



CHAPITRE XV 



Il faut ajouter Peau avec une grande prudence ; car, si Ton en ajoute 
trop, la masse se solidifiera lentement ou même pas du tout. C'est lorsque 
la masse contient le minimum d*eau nécessaire pour la rendre transparente 
qu'elle possède le plus de fermeté et d'élasticité. 

Outre la masse dont nous avons indiqué approximativement la composi- 
tion, on peut en préparer qui contiennent 10, 20, 30, 40 p. 100, ou plus ou 
moins, de savon. Weisker s'est servi avec avantage d'une masse contenant 
des parties égales de savon et d'alcool. Une telle masse est transparente, 
mais jaune et huileuse, et se solidifie très lentement. Après refroidissement 
elle se montre cependant très ferme. Son point de fusion est assez élevé, et 
elle est moins pénétrante que les masses plus alcooliques. Elle rend des 
services pour les objets très durs, et surtout pour les structures chiti- 
neuses. 

Kadyi coupe avec un rasoir mouillé d'alcool fort, ce qui a l'avantage de 
maintenir la lame toujours propre. Pour éloigner la masse des coupes, il 
les met dans de l'alcool à 96 p. 100 qui, à chaud, dissout la masse immédia- 
tement et, à froid, après un certain temps. 

279. Savon à la glycérine (Poelzam, Morph. Jahrh., 1877, p. 558 ; 
nous citons d'après Salensky). — On prend du savon blanc ordinaire et on 
le coupe en tranches minces qu'on expose au soleil jusqu'à ce qu'elles 
deviennent blanches. On les réduit alors en poudre et l'on ajoute de l'alcool 
de manière à faire une bouillie épaisse. A cette bouillie on ajoute de l'alcool 
et de la glycérine en des proportions telles que le mélange contienne, pour 
10 parties de savon, 22 parties de glycérine et 35 parties d'alcool à 90 p. 100. 
On chauffe jusqu'à ce qu'on ait obtenu une solution parfaitement transpa- 
rente, sirupeuse, un peu jaunâtre. 

La masse s'emploie selon les méthodes connues. Pour la séparer des 
coupes, Salensky emploie l'eau ou l'alcool très dilué. 

280. Autres masses au savon (Flemming, Arch, f. mik.Anat.y 1873, 
p. 123. — Pfitzer, Ber, deulsch. bot. Ges., 1887, p. 65; Journ. Roy. Mie. 
Soc, 1888, p. 316; Pou, Journ. de Micr., XIlï, 1889. p. 337 (alcool à 
90 p. 100, 1 partie ; glycérine, 1 partie; savon à la glycérine, 1 à 2 parties). 
—- Chauffer ensemble la glycérine et l'alcool à 60<* ou 70*^ C, et ajouter le 
savon en petits morceaux. 

GELATINE 

281.— L'inclusion à la gélatine est une méthode qui offre l'avantage 
d'être applicable à des objets qui n'ont été déshydratés, voire même à 
des objets qui n'ont été traités que par des liquides aqueux. Elle peut 
donc rendre des services importants pour l'étude d'organismes délicats 
et très riches en eau, tels que plusieurs Cœlentérés. Le mode opératoire 
est le même que pour les autres masses liquides à chaud, si ce n*est 
que pour la gélatine les objets doivent être pénétrés par l'eau et non 
par l'alcool ou une essence. Après inclusion et refroidissement de la masse 
on peut quelquefois procéder immédiatement à l'opération des coupes; 
mais il est rare que la masse acquière sans autre traitement une consis- 
tance suffisante. Pour la durcir, on peut la traiter pendant dix à trente 



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INCLUSION A LA PARAFFINE ET MASSES SEMBLABLES 217 

minutes avec Talcool absolu (Kaiser), ou pendant quelques jours par Tal- 
cool à 90 p. 100 suivi d*alcool absolu (Klebs), ou par l^acidc chromique 
(Klebs) ; ou bien on peut la geler (Sollas). 
La masse se sépare des coupes par le lavage à Teau chaude. 

282. Gélatine à la glycérine (Klebs, Arch. f, mik. Anat., 1869, 
p. 165). — Solution concentrée de colle de poisson dans Teau^ 2 parties ; 
glycérine, 1 partie. 

283. Gélatine à la glycérine (Kaiser, Bot. Centralb., 1880, p. 25 ; 
Joum, Roy, Mie. Soc, 1880, p. 504). — - On fait gonfler 1 partie de gélatine 
française pendant deux heures dans 6 parties d'eau ; on ajoute 7 parties de 
glycérine, et un centième du poids du mélange diacide phénique concentré. 
On chauffe pendant dix à quinze minutes, en reYnuant le tout jusqu'à ce 
que les flocons produits par Tacide phénique aient disparu. On filtre à 
chaud & travers du verre pilé fin, humecté, et placé dans un entonnoir. 

284. Gélatine à la glycérine (Gerlach, Unters, a, d. Anat, Inst. 
Erlangen, 1884 ; Jour, Boy. Mie. Soe., 1883, p. 541). — Gélatine, 40 grammes ; 
solution saturée d'acide arsénieux, 200 ce; glycérine, 120 ce. On clarifie la 
solution avec du blanc d'œuf. On peut la garder pendant des années dans 
un flacon bien bouché. Gerlach prépare ses objets pour l'inclusion par un 
bain de glycérine diluée (1 partie de glycérine pour 2 d'eau), dans lequel il 
les laisse jusqu'à ce qu'ils en soient parfaitement pénétrés. Il trouve avan- 
tageux d'ajouter un peu de thymol à la glycérine. 

286. Gélatine à froid (Brunotti, /our». de Botan., VI, 1892, p. 194). — 
On fait dissoudre à l'aide de la chaleur 20 grammes de gélatine dans 200 ce. 
d'eau distillée, on filtre et ajoute 1 gramme de sublimé corrosif dans 30 à 
40 ce. d'acide acétique cristallisable. Cette masse possède à 15^ G. la con- 
sistance d'un sirop épais. Les objets doivent être pénétrés d'abord par un 
mélange de 1 volume de cette masse avec 2 à .3 volumes d'eau, puis par la 
masse concentrée. Puis on durcit dans de l'alcool ou dans du bichromate 
de potasse, acide picrique, etc. On voit que ce procédé écarte entièrement 
l'emploi de la chaleur. 



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.CHAPITRE XVI 

COLLODION (CELLOÏDINE), GOMME, GOMME-GOPAL, ETG. 



286. Avantages de la méthode au collodion. — Les masses 
d'inclusion au collodion sont assez transparentes et offrent de grands 
avantages pour l'orientation des objets à couper. Le collodion a sur 
la paraffine l'avantage de ne pas être cristallisable, Timbibition peut 
s'opérer graduellement et sans l'aide de la chaleur; de plus, les 
objets, quoiqu'ils doivent être déshydratés par l'alcool absolu, n'ont 
pas besoin d'être traités par une essence avant Tinclusion. Il résulte 
de ces propriétés que le collodion est une masse éminemment favo- 
rable à la bonne conservation des structures délicates. Il a un autre 
avantage qui est des plus précieux pour certains cas ; on peut colo- 
rer les coupes dans les teintures histologiques ordinaires (carmin, 
hématoxyline, et quelques anilines, — pas toutes), sans qu'il soit 
nécessaire d'enlever la masse au préalable ; car le collodion ne se 
colore pas dans ces teintures, et ne s'oppose pas non plus à la colo- 
ration des tissus. De plus, on peut monter les coupes dans la glycérine 
ou dans le baume, sans enlever la masse, qui demeure parfaitement 
transparente et homogène, et par conséquent invisible, dans ces 
milieux. C'est là un avantage précieux lorsqu'il s'agit de coupes d'ob- 
jets dont les parties n'ont pas de cohésion naturelle et qui se brise- 
raient ou tomberaient en morceaux si elles n'étaient pas enrobées 
pendant toutes ces manipulations dans une substance protectrice. 
Mais la qualité la plus importante des masses au collodion est peut- 
être la faculté qu'elles ont d'imbiber les pièces volumineuses. Le 
séjour dans les solutions de collodion étant absolument inofTensif 
pour les éléments les plus délicats, on peut prolonger à volonté pen- 
dant des jours ou des semaines le bain nécessaire pour infiltrer les 
objets, et arriver ainsi à l'inclusion d'objets qui seraient littéralement 



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COLLODION, GOMME, GOMME-COPAL, ETC. 219 

cuits si on les chaufîait pendant le même temps dans un bain de 
paraffine. 

Le défaut capital de cette méthode, c'est que les masses au collo- 
dion ne présentent pas une consistance permettant d'obtenir des 
coupes suffisamment fines pour plusieurs recherches d*anatomie et 
d'histologie ; la limite inférieure de l'épaisseur des coupes au collo- 
dion se trouve à 0™™,007, tandis que celle des coupes à la paraffine 
se trouve à 0™™,00l. Nous disons bien « la limite inférieure » et nous 
voulons dire qu'une méthode qui ne donne que par exception des 
coupes d'une finesse de 0"",007 ne répond pas à tous les besoins. 
Un inconvénient, c'est que c'est un procédé très long. Il faut envi- 
ron trois jours pour faire à la celloïdine une inclusion qui deman- 
derait une heure à la paraffine. II est vrai que le temps nécessaire se 
trouve notablement abrégé par la méthode rapide de Gilson (n® 298). 

287. GoUodion, Celloïdine et Photoxyline. — La très impor- 
tante méthode de l'inclusion au collodion est due à M. Duval f^Joum, 
de VAnt.^ 1879, p. 18§). La c celloïdine » recommandée plus tard par 
Merkel et ScmEFFERDECKER {Arch. f. Anat. u. Phys., 1882, p. 200), 
n'est autre chose qu'un collodion pharmaceutique qui présente 
l'avantage d'être livré sous forme de plaques solides qui sont solubles 
dans un mélange à parties égales d'éther et d'alcool absolu. On peut 
facilement en faire venir par la poste en écrivant à Wittick et Ben- 
KENDORF, Schering's Grtine Apotheke, 19, Ghaussée-Strasse, Berlin, N. 
On en trouve du reste maintenant chezGRûBLER et chez la plupart des 
fournisseurs de microscopie. 

Dans une exposition plus récente de sa méthode {Jour, de Micr.^ 
1888, p. 197), Duval enseigne que la celloïdine ne possède aucun 
avantage réel sur le collodion. SeniEFFERDECKER, dans un nouveau 
travail, Zeit. f. wiss. 3Iik,, V, 4, 1888, p. 804, déclare qu'elle lui est 
supérieure en bien des points. Il me semble que la celloïdine permet 
d'obtenir des masses plus parfaitement anhydres, et qu'elle permet 
de doser plus commodément la concentration des solutions. Mais 
pour l'un et l'autre le résultat définitif me parait être le même. 

La photoxyline (Krysinsky, Virchotv's Arch., CVIII, 1887, p. 217 ; 
Eusse, Zeit. f. wiss. MiL, IX, 1, p. 47) est également un collodion breveté. 
G*est un produit sec. On se la procure aux mêmes sources que la celloïdine. 
D'après Busse, elle aurait Tavantage de fournir une masse qui après durcis- 
sement dans Talcool à 85 p. 100 demeure parfaitement transparente. Mais 
puisque par la méthode récente d'éclaircissement avant les coupes, que 
nous décrivons plus loin, on obtient avec la celloïdine ou le collodion ordi- 



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220 CHAPITRE XVI 

Baire des masses d'une transparence parfaite, il me semble qu'on pourra 
pour la plupart des travaux se passer de photoxyline. 

288. Marche générale. — La marche générale diffère de 
celle de la méthode à la paraffine en ce que Ton ne pénètre pas par 
une essence avant de passer au bain d'inclusion et que la masse ne 
durcit pas spontanément mais demande des opérations spéciales pour 
lui procurer la consistance voulue. Jusqu'à ces derniers temps, on a 
eu l'habitude de ne procéder à l'éclaircissement qu'après la confec- 
tion des coupes. Une modification récente qui me paraît être pour 
beaucoup d'objets un grand perfectionnement, consiste à éclaircir la 
masse avant de faire les coupes. Nous décrirons d'abord la marche 
traditionnelle telle qu'elle se pratique dans la plupart des labora- 
toires, et nous donnerons dans un paragraphe spécial la méthode 
par éclaircissement avant les coupes. J'ajoute que pour ma part 
cette dernière méthode est celle que je pratique et que je recom- 
mande. 

289. Préparation des ol]jets. — Les objets doivent être bien 
déshydratés par l'alcool absolu. S'ils sont de nature à se laisser faci- 
lement pénétrer, on les transportera directement dans une solution 
très peu épaisse de collodion, mais, s'ils sont de nature peu per- 
méable, on les pénétrera par l'éther, ou par un mélange d'éther et 
d'alcool absolu. 

On peut prendre un mélange de 1 volume d'éther, ou 2 ou jusqu'à 
10 volumes pour 1 d'alcool absolu ; c'est un point qui n'a pas grande 
importance. 

290. Les bains de collodion. — Le secret du succès ici c'est de 
pénétrer les objets d'abord par une solution peu épaisse, ensuite 
par une solution très épaisse. L'emploi de la celloïdine est très com- 
mode, parce qu'il permet de titrer exactement les solutions. Suivant 
Apathy (Zeit. f. wiss. Mik,, VI, 2, 1889, p. 164), il est bon d'employer 
la celloïdine desséchée. On débite une quantité de celloïdine en 
tranches minces qu'on laisse sécher à l'air jusqu'à ce qu'elles soient' 
devenues jaunes, transparentes et d'une consistance cornée, puis on 
les fait dissoudre dans un mélange à parties égales d*éther et d'alcool 
absolu. ËLScuNiG {ibid.y X, 4, 1893, p. 443) a observé que la dissolu- 
tion se fait plus vite si on laisse d'abord tremper les morceaux pen- 
dant vingt-quatre heures dans la quantité nécessaire d'alcool, et qu'on 
ajoute l'éther ensuite. Après essai, il me semble bien qu'il en est 



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COLLODION, GOMME, GOMME-GOPAL, ETC. 221 

ainsi. L'emploi de celloïdine séchée fournit des solutions qui sont 
privées de l'excès d'eau qui se trouve dans la celloïdine fraîche, et 
donnent après durcissement une masse plus transparente et d'une 
consistance meilleure. 

On peut appeler c peu épaisse » une solution contenant de 4 à 
6 p. 100 de celloïdine séchée, et solution c épaisse > celle qui en 
contient de 10 à 12 p. 100. Les proportions suivantes pour trois bains 
successifs ont été établies par Busse [ihid.y IX, 1, 1892, p. 47) ; — 
N® 1, 10 parties de celloïdine séchée, ou de photoxyline, pour 
180 du mélange d'éther et alcool absolu ; n^ 2, 10 parties pour 105 du 
mélange ; n^ 3, 10 parties pour 80 du mélange. 

Je n'emploie d'habitude que deux solutions, une faible, et une 
forte, correspondant à peu près au numéro 2 de Busse. Le 
numéro 3 de cet auteur est si épais que son emploi exige beaucoup 
de patience. 

Les objets doivent rester dans le premier bain (dans un flacon ou 
autre récipient bien bouché) jusqu'à ce qu'ils soient parfaitement 
pénétrés. Il faut pour cela des jours, même pour de petits objets ; 
pour de gros objets, comme les embryons humains de six à 
douze semaines, il faut des semaines et même des mois. Lorsque 
l'objet est dûment pénétré par la solution faible on passe à la ou les 
solutions fortes. Quelques observateurs recommandent de ne pas 
sortir l'objet de la solution faible, mais de laisser celle-ci se con- 
centrer graduellement par évaporation tout en ajoutant de temps à 
autre un peu de solution forte. 

291. Inclusion définitive. — Si V objet est tel qu'il n'y a pas 
d'inconvénient à le collei^ directement sur un support adapté au 
porte-objet du microtome^ et si Ton n'a pas besoin de manipulations 
spéciales d'orientation de l'objet ni de sérialion des coupes, aucune 
inclusion spéciale n'est nécessaire et aussitôt que les objets sont 
bien pénétrés par la solution forte on peut procéder au durcisse- 
me7xt. Pour les objets qui pour l'un ou l'autre de ces motifs 
demandent une inclusion afin de les avoir enrobés dans un bloc de 
collodion, on procède comme suit. 

Les objets une fois pénétrés, on peut faire l'inclusion définitive 
dans des boîtes de papier, selon l'une des méthodes connues 
décrites numéro 261. Pour ces inclusions, les boîtes en papier 
rondes (fig. 2, n"^ 261) sont particulièrement recommandables, le 
bouchon se prêtant de la manière la plus commode à fixer l'objet 
dans le microtome. Avant de faire l'inclusion dans ces boîtes, il est 



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222 



CHAPITRE XVI 



bon de les préparer en y versant une goutte de collodion qu'on 
laisse sécher complètement. Cela a pour but d*empécher que des 
bulles ne se dégagent du bouchon et ne viennent se loger dans la 
masse d'enrobage. 

Les verres de montre profonds, des godets à couleurs humides 
pour aquarelle, etc., forment de bons moules à inclusion. Il faut 
veiller à ce qu'ils soient parfaitement secs. 

Orientation. — Désire-t-on marquer la position de Tobjet dans la 
masse pour faciliter ensuite Torientation des ligaes de coupe, on peut 
employer la méthode d^EvcLESHEiMER (Amer, Nat\, XXVI, 1892, p. 354; 
Joum. Roy. Mie. 5oc. 1892, p. 563). On fait Tinclusion dans une boite 
métallique pareille à celles décrites au numéro 261. Les parois tant laté- 
rales que terminales de la boite sont pei*cées d'une ligne de petits trous 
régulièrement espacés. A travers la boite sont tendus des fils de soie qui 
passent dans les trous et sont assujettis sur l'extérieur delà botte au moyen 
d'une goutte de celloïdine. On laisse à chacun un bout libre de 4 à 5 centi- 
mètres. On trempe ces bouts libres dans une solution peu épaisse de 
celloïdine mêlée de noir de fumée. On pose Tobjet sur le treillis formé par 
les fils tendus à Tintérieur de la boite, on remplit de collodion, et Ton durcit 
le tout. Après durcissement, on dissout au moyen d'une goutte d'éther le 
collodion qui] assujettit les fils en dehors et on les tire à travers la masse. 
Ils laissent derrière eux une série de lignes noires servant à Torienta- 
tiou. 

Apathy (Zeit. /". wiss, Mik., V, I, 1888, p. 47) conseille d'arranger les 
objets sur une petite plaque rectangulaire de gélatine posée sur le fond du 
récipient. On sort cette plaque après durcissement avec le bloc à couper, 
et on la coupe avec lui. Les bords de la plaque forment de bonnes lignes 
d'orientation. 

D'après une troisième méthode, qui se laisse utiliser pour les petits 
objets, l'inclusion se fait dans une éprouvette. Après durcissement 
par le chloroforme, la masse un peu rétractée se laisse extraire de 
l'éprouvette à l'aide d'une brusque secousse. (Voyez au paragraphe 
suivant.) 

Il se peut que pendant ces opérations il se soit produit des bulles 
dans la masse. En ce cas, avant d'aller plus loin, il convient d'exposer 
le tout pendant une heure ou deux, jusqu'à ce que ces bulles aient 
disparu, à l'action des vapeurs d'éther dans un récipient bien clos. 
Il faut veiller à ce que la masse ne soit pas en contact avec Téther 
liquide (Busse, Zeit. f. wiss. Mik., VIII, 4, 1892, p. 467). 

292. Durcissement. — a) On procède d'habitude comme suit, 
par évaporation graduelle suivie d'un traitement par V alcool. 
On fait l'inclusion dans très peu de masse ; il est bon qu'il y en ait 



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GOLLODION, GOMME, GOMME-GOPAL, ETG. 223 

juste assez pour couvrir largement Tobjet. Si Ton s*est servi d*un 
godet de porcelaine, on le couvre avec un verre renversé, de 
manière à laisser à découvert un coin ou une marge de la masse 
pour qu'une lente évaporation puisse avoir lieu. Si ce sont des boiles 
de papier, on les met sous une cloche, en faisant en sorte que 
celle-ci ne s'applique pas exactement sur. son support. Au bout de 
quelques heures, le collodion s'est durci à Textérieur et s'est un peu 
rétracté, de sorte que l'objet enrobé commence à être à sec. On le 
couvre d'une goutte de collodion, et l'on remet la préparation à 
couvert comme auparavant. (Si l'on a laissé trop sécher la première 
couche de collodion, il est bon de la mouiller avec une goutte d'éther, 
pour assurer que la deuxième couche adhère à la première.) Après 
quelques heures, on ajoute une nouvelle goutte de collodion; et l'on 
répète cette opération à des intervalles de quelques heures pendant 
deux ou trois jours, ou plus. On trouve enfin que l'objet est enrobé 
dans une masse d'une certaine consistance sans avoir subi de rata- 
tinement. 

Le secret de la réussite du durcissement par évaporation consiste 
à rendre Tévaporation très graduelle. Si les objets sont gros, il est 
bon de mettre la masse qui les contient sous une cloche fermant 
hermétiquement, et de ne soulever la cloche, pour permettre aux 
vapeurs d'alcool et d'éther de s'échapper, que pendant quelques 
secondes une ou deux fois par jour. 

Nous avons souvent trouvé avantageux de durcir nos objets dans 
la vapeur d'alcooL A cet effet nous les mettons, après enrobage sur 
du liège ou dans les boîtes de papier, dans un flacon contenant assez 
d'alcool pour baigner à peine le fond de la masse. 

Lorsque la masse a atteint une consistance telle que le bout du 
doigt (la pulpe, pas l'ongle) ne l'impressionne plus, on achève le 
durcissement en jetant le tout dans l'alcool. (On peut commencer 
par l'alcool, en y jetant la masse liquide, mais ce procédé donne 
lieu très souvent à la formation de bulles d'air.) On éloigne d'abord 
le papier, ou l'on sort la masse du récipient qui l'a contenue et on la 
porte dans une quantité considérable d'alcool (si la masse ne se laisse 
pas dégager au premier moment, il faut attendre qu'elle ait fait un 
court séjour dans Talcool). On a employé pour le durcissement des 
titres d'alcool très divers. On peut maintenant regarder comme 
établi par les expériences ad hoc de Busse {Zeit. f. wis$. Afik., IX, 
1, 1892, p. 49), que l'alcool de 85 p. 100 est celui qui convient le 
mieux, tant sous le rapport de la transparence de la masse définitive 
que sous celui de sa consistance pour les coupes. C'est du reste là. 



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224 CHAPITRE XVI 

une conclusion qui se rapproche beaucoup de la pratique de la plu- 
part des anatomistes. 

Il faut de un jour à quelques semaines pour achever le durcisse- 
ment. 

Le récipient contenant V alcool ne doit pas être hermétiquement 
clos^ mais doit être au moins légèrement ouvert. 

On voit que ce procédé est d'une longueur excessive. Je pense qu'il 
n'a de raison d'être que si, comme le prétendent quelques auteurs, 
les objets volumineiuv se durcissent mieux par cette méthode que 
par celles que nous allons maintenant exposer. 

b) La méthode du durcissement par le chloroforme est due à Vial- 
LANES [Rech, sur VHist. et le Dév. des Insectes^ 1883, p. 129) ; c'est 
pour les petits objets la méthode la plus sûre, la plus rapide, et celle 
qui donne la meilleure consistance à la masse. Elle consiste à jeter 
les objets enrobés dans du chloroforme. Sous l'influence de ce réactif, 
le collodion se prend immédiatement en une masse suffisamment 
dure pour être coupée ; il n'y a plus qu'à attendre que l'action du 
chloroforme se soit propagée jusqu'au centre de la masse, ce qui 
a lieu en quelques heures ou en quelques jours, selon les cas. Si 
l'inclusion a été faite dans un tube, il n'y a qu'à verser sur le collo- 
dion une quantité suffisante de chloroforme ; après durcissement, 
la masse, un peu rétractée, se laisse facilement extraire du tube. 
Nous recommandons particulièrement ce procédé, qui donne des 
résultats bien meilleurs que l'alcool, pour les objets petits et moyens; 
il est moins recommandable pour les objets très volumineux, parce 
que le durcissement trop énergique des couches extérieures de la 
masse fait obstacle à la diffusion nécessaire pour que le durcissement 
de l'intérieur se produise. Il arrive parfois que le collodion devient 
opaque sous l'action du chloroforme ; en ce cas, il n'y a qu'à 
attendre, car il s'éclaircit toujours par la suite, après un temps plus 
ou moins long. Il est très important d'employer du chloroforme 
absolu, car celui qui contient de l'eau ne produit pas la réaction 
voulue. En faisant usage de la méthode d'inclusion dans un tube, 
il convient de retirer la masse de l'éprouvette aussitôt qu'elle est 
suffisamment durcie pour permettre cette manœuvre, et de la mettre 
dans un récipient convenable avec une quantité considérable de 
chloroforme, jusqu'à ce qu'on ait obtenu la consistance voulue de 
toute la masse. 

Cette méthode est incomparablement plus rapide que celle de 
l'alcool, et d'après mon expérience, elle donne une consistance pour 
le moins aussi bonne, souvent meilleure. 



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COLLODION, GOMME, GOMME-COPÂL, ETC. 225 

Depuis quelque temps je fais mes durcissements à la vapeur de 
chloroforme. Pour cela il suffit de mettre la masse liquide (après en 
avoir éloigné les bulles, si elle en contient, par la vapeur d'éther 
comme nous Tavons dit plus haut) dans un dessiccateur sur le fond 
duquel on a versé un peu de chloroforme. L'action est très rapide, 
et il me semble que la transparence de la masse se maintient mieux 
qu'avec le chloroforme liquide et que la consistance défmitive est 
meilleure. Nous reviendrons sur ce sujet, numéro 297. 

Florman (Zei7. f. wiss. Mik., VI, 2, 1889, p. 184) a conseillé de renoncer 
à tout durcissement secondaire et d'achever le durcissement en continuant 
soigneusement Tévaporation graduelle de la manière décrite au commence- 
ment de ce numéro, en ayant soin de dégager la masse de son récipient et 
de la retourner fréquemment. Je puis constater qu'on peut arriver au but 
par ce moyen, mais il faut les plus grandes précautions pour éviter un 
ratatinement nuisible. 

Une pratique récente consiste à compléter le durcissement du collodion 
par la congélalion, A cet effet, on durcit d'abord la masse par l'alcool selon 
l'une des méthodes que nous avons décrites. Puis on la met dégorger 
pendant quelques heures dans Teau, pour enlever la majeure partie de 
Talcool (il n'est pas bon d'enlever l'alcool entièrement, car en ce cas la 
masse peut facilement acquérir par la congélation une dureté excessive). 
On trempe finalement la masse pendant un moment dans une solution de 
gomme qui sert à la faire adhérer à la platine du microtome, et l'on fait 
geler. A mesure qu'elles sont faites, on met les coupes dans de l'eau chaude. 
Si la masse est devenue d'une dureté trop grande pour fournir de bonnes 
coupes, on y remédie en chauffant le couteau dans de l'eau chaude. 

293. Conservation des blocs. — Si l'on ne désire pas passer immé- 
dfalement à la mise en coupes, on peut conserver indéfiniment les blocs de 
collodion durci dans de l'alcool faible (70 p. 100). Ou bien, en les plongeant 
daas de la paraffine fondue (Apatuy, ZeU. f. wiss. MiLy V, 1, 1888, 
p. 45). 

Des numéros d'ordre peuvent être écrits avec un crayon tendre sur le fond 
des boîtes de papier servant à l'inclusion, ou avec un crayon gras sur le fond 
des verres de montre. Après dégagement de la masse durcie, on trouvera 
l'écriture imprimée sur le collodion (Apathy, ibid,). 

294. Mise en coupes. — Le collodion formant une masse très 
transparente, il est quelquefois difficile d'apercevoir les contours des 
coupes à mesure qu'on les fait, ce qui nous prive d'un secours utile 
pour Torientution de coupes de petits objets sur le porte-objet. Il est 
donc souvent bon d'employer pour l'inclusion du collodion teint (par 
exemple, par l'acide picrique dissous dans Talcool) assez pour que les 
contours des coupes puissent être aperçus. 

Si les objets ont été enrobés sur du liège ou sur de la moelle de 

ANAT. UICROSC. 15 



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226 



CHAPITRE XVI 



sureau, il n'y a plus qu'à adapter le tout à Tétau du microtome. Si 
Ton a employé des boîtes de papier ou des godets de porcelaine, il 
faut prendre un morceau de liège ou de moelle de sureau, ou, ce qui 
vaut souvent mieux, de bois tendre, et le couvrir d'une couche de 
collodion qu'on laisse sécher. On retire la masse contenant l'objet, 
on la taille de manière à obtenir une surface lisse en dessous, on 
mouille cette surface avec une goutte d'alcool absolu, puis avec une 
goutte d'éther, et on l'applique fermement sur le morceau de bois 
tendre ou de moelle de sureau, sur lequel on a préalablement déposé 
au moment même une nouvelle goutte de collodion très épais. On 
met le tout pendant quelques heures dans l'alcool faible pour achever 
la réunion des pièces; ou bien dans le chloroforme, qui consolidera le 
joint beaucoup plus vite, quelquefois en peu de minutes. 

M. LiNDSAY Johnson m'écrit qu'il trouve très commode d'employer 
pour cette opération un mastic fait d'environ une partie de cire avec 
deux parties de colophane. Il faut bien sécher le fond du bloc de col- 
lodion, chauder légèrement le porte-objet du microtome, si possible, 
au-dessus d'une flamme, laisser tomber dessus quelques gouttes du 
mastic fondu, et appliquer le bloc de collodion. L'union est parfaite 
en quelques secondes. 

Il est un avertissement que nous croyons devoir donner. S'il s'agit 
d'objets volumineux et résistants, il faut bien se garder de les fixer 
sur un morceau de liège et de mettre celui-ci entre les mors d'une 
pince de microtome. Car ce liège n'est pas un corps rigide : lorsqu'on 
serre la pince, il se déforme, et la masse élastique de collodion qu'il 
porte se déforme avec lui. Nous avons vu des embryons se courber 
sous l'influence de la pince à tel point que les coupes obtenues étaient 
de véritables calottes. Si donc on se sert d'un microtome dont le 
porte-objet est muni d'une pince, nous recommandons de coller les 
objets sur un morceau de bois tendre. Le nouveau porte-objet à 
cylindre mobile, du microtome Thoma, n'a pas l'inconvénient dont 
nous parlons, et permet d'employer le liège. 

Jelinek (Zext. f, wiss. MiL, XI, 2, 1894, p. 237) conseille de monter les 
objets sur du < stabilité >, qui est un matériel de caoutchouc employé 
comme isolant électrique. On en trouve des blocs convenables chez Hermann 
DuMLER, 25, Mariahilferstrasse^ Vienne (VI, 1). 

Les coupes se font avec le rasoir oblique^ largement mouillé d'al- 
cool (de 70 à 85^). Il est avantageux d'employer une disposition per- 
mettant de faire tomber automatiquement de l'alcool goutte à goutte 
sur la lame pendant toute la durée de l'opération des coupes. Il est 



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i-^M 



COLLODION, GOMME, GOMME-GOPAL, ETC. 



227 



quelquefois nécessaire de couper entièrement sous Talcool, ce qui 
n'est guère praticable sans le secours d'un microtome ad hoc, tel que 
celui de Gudden ou celui de Malassez. 

295. Traitement des coupes. — Les coupes doivent être trans- 
portées dans l'alcool (de 70 à 85 p. 100), à mesure qu'elles sont 
faites. On peut ensuite les traiter par les réactifs colorants ou autres, 
ou les monter dans la glycérine, sans qu'il soit nécessaire d'enlever 
la masse. 

Certaines couleurs d'aniline cependant colorent fortement le collo- 
dion. Si on les emploie, il faut prendre le parti d'enlever la masse 
ensuite. 

Pour monter dans le baume, il faut quelques précautions, si l'on ne 
veut pas voir se dissoudre la masse, qui remplit la fonction très utile 
de maintenir en place les parties détachées des préparations. Il faut 
déshydrater avec un alcool d'un titre qui ne doit jamais être supérieur 
à95^ NiKTFOROw (Zei7. f, wiss Mik,, VIII, 2, 1891, p. 189) déshydrate 
dans un mélange à parties égales d'alcool et de chloroforme. 

Pour éclaircir ensuite les coupes, on a recommandé l'essence de 
bergamote, l'essence de bois de santal ou l'essence d'origan. On 
recommande surtout d'éviter Tessence de girofle, qui ordinairement 
dissout le colludion très rapidement. 11 y a cependant des échantillons 
d'essence de girofle qui le dissolvent très lentement et peuvent être 
employés. L'essence d'origan donne, selonl'échantillon qu'on emploie, 
des résultats très divers : tantôt elle n'éclaircit pas le collodion, et 
tantôt elle le dissout. On recommande de prendre ÏOleum origani 
Creticij et non VOL orig. Gallici, mais voyez pour cette essence au 
chapitre des Agents éclair cissants. 

Avec l'essence de bergamote on réussit ; [mais on lui reproche de 
ratatiner les coupes. Minot recommande le chloroforme. L'essence de 
bois de cèdre a l'inconvénient d'agir très lentement, mais elle donne 
en déflnitive les meilleurs résultats pour celui qui a la patience de les 
attendre. 

DuNUÂM (d'après Minot, Zeit. f. toiss. Mik.y 1886, p. 175) recom- 
mande particulièrement un mélange de 3 parties d'essence blanche 
de thym {white oil of thyme) avec 1 partie d'essence de girofle. Ce 
mélange éclaircit rapidement, et ramollit la masse juste assez pour 
empêcher le ratatinement qui se produit par l'emploi de l'essence de 
thym seule. Minot trouve que ce mélange donne de meilleurs résul- 
tats que tout autre éclaircissant, sans excepter le chloroforme. 

FiSH {Amer. Mie. Soc, Proceedings, 16 th Ann. Meeting, 1893) 



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228 



CHAPITRE XVI 



recommande un mélange d'essence rouge de thym, 1 partie, avec 3 
parties d'huile de ricin (celte dernière est ajoutée en vue de la nature 
volatile de l'essence rouge de thym). Fisii explique que l'essence rouge 
est le produit de la première distillation de l'essence brute, l'essence 
blanche étant le produit d'une deuxième distillation. L'essence rouge 
a une réaction neutre et se dissout facilement dans l'alcool. D'après 
une communication récente (écrite, dont j'ai à remercier M. Fisu), on 
peut avec avantage substituer l'essence blanche à l'essence rouge du 
mélange ; cela facilite les orientations. On a recommandé l'acide pho- 
nique ; mais c'est là un réactif qui n'est pas du tout bon pour certains 
tissus. 

Weigert {Zeit, f. wiss. Mik.^ IH, 4, 1886, p. 480) a conseillé un 
mélange de 3 parties de xylol avec i partie d'acide phénique anhydre. 
Ce mélange ne doit pas être employé après des colorations aux ani- 
lines basiques, car elle les décolore. Pour celles-ci, prendre 1 partie 
d'huile d'aniline à la place de l'acide phénique dans le mélange. 

L'aniline seule éclaircil bien, mais elle brunit les préparations si Ton n'a 
pas soin de Téloigner parfaitement. On y arrive en mettant les préparations 
pendant vingt-quatre heures dans le chlorororme (van Gieson, Journ, Roy. 
Mie. Soc.^ 1887, p. 519, revue de tous ces éclaircissants). 

La créosote a été recommandée par Max Flescii. 

Eyclesiietmer (ibid., 189:2, p. 563) emploie un mélange de parties 
égales d'essence de bergamote, essence de cèdre et acide phénique. 

296. Revue. — Dans les paragraplies précédents, nous avons 
exposé la marche de la méthode du collodion telle qu'elle se prati- 
quait habituellement jusqu'à il y a deux ou trois ans. C'est une 
méthode minutieuse, longue et compliquée. Après une opération 
longue et délicate de pénétration par le collodion, elle exige une 
opération longue et encore plus délicate de durcissement par évnpo- 
ration suivi d'un autre durcissement par l'alcool. Puis il faut se sou- 
mettre à l'obligation de tenir les pièces constamment mouillées 
d'alcool pendant l'opération des coupes. Et même la manipulation 
subséquente des coupes exige quelques précautions spéciales. Plu- 
sieurs de ces inconvénients sont écartés par la pratique récente 
à' éclaircissement avant coupes, méthode qui me paraît certainement 
destinée, du moins pour bien des objets, à remplacer l'ancienne. Ellr 
donne des masses aussi transparentes que le verre, ce qui facilite plus 
qu'aucune autre méthode d'inclusion l'orientation de l'objet dans lo 
microtome. Elle donne une meilleure consistance à la masse et per- 



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COLLODION, GOMME, GOMME-COPAL, ETC. 229 

met ainsi de réaliser des coupes beaucoup plus fines. Elle abolit Tobli- 
gation de tenir Tobjet mouillé d'alcool pendant les coupes. Elle 
permet de conduire beaucoup plus rapidement toutes les opérations à 
partir de Tinclusion définitive. 

297. Procédé par éclaircissement avant les coupes. — Ce 

procédé est dû à Bumpus (Amer. NaturaL, XXVI, 1892, p. 80 ; Joum, 
Roy, Mie. Soc. y 1892, p. 438). On fait l'inclusion comme d'habitude, 
et l'on durcit la masse dans du chloroforme. Après durcissement, on 
la met dans de l'essence blanche de thym, jusqu'à ce qu'elle soit 
parfaitement éclaircie. On la colle avec du collodion sur un morceau 
de bois adapté au porte-objet du microtome, et Ton durcit le joint 
dans du chloroforme. On coupe avec un couteau inondé d'essence de 
thym. 

Eycleshëimer (op. ct7., p.3S4, ou /ou772., p. 563) recommande éga- 
lement ce procédé, le bloc de collodion étant éclairci au moyen 
d'acide phénique, ou de glycérine, ou du mélange cité numéro 293. 

FisH(toc. c^^, n* 29S) recommande également ce procédé. Iléclair- 
citdans le mélange que nous avons cité, numéro 293. 

Voici comment je procède moi-même depuis quelque temps, m'ins- 
pirant de la méthode de Gilson, numéro suivant. L'inclusion se fait 
de la manière usuelle, et la masse est durcie pendant une heure ou 
plusieurs dans la vapeur de chlorofoi^me (il n'y a qu'à poser le réci- 
pient contenant la masse dans un dessiccateur ou dans une Siehdose 
de Suchannek sur le fond de laquelle on a versé un peu de chloro- 
forme). Une heure suffira bien pour de petits objets, mais on peut 
laisser le tout indéfiniment dans la vapeur de chloroforme. Il est bon 
de sortir la masse de son récipient aussitôt qu'elle est devenue suffi- 
samment re'sistante pour permettre cette opération, pour qu'elle soit 
exposée à l'action des vapeurs sur toute sa surface. (En tout cas, il me 
semble que le durcissement préliminaire à la vapeur garantit une con- 
sistance meilleure que celle qu'on obtient en passant directement au 
mélange durcissant et éclaircissant.) Après durcissement, j'éclaircis 
dans le mélange de Gilson (numéro suivant), soit en général 1 partie 
de chloroforme pour 2 parties d'essence de cèdre. De temps à autre, 
j'ajoute un peu d'essence de cèdre, et je continue ainsi jusqu'à ce que 
le mélange ne contienne que relativement très peu de chloroforme; 
ou bien, aussitôt l'objet pénétré, on laisse le flacon débouché et le 
chloroforme se volatilise. Il n'est pas bon de prendre d'emblée de l'es- 
sence de cèdre pure, parce que dans ce cas l'éclaircissement est très 
lent, tandis que dans le mélange, il est rapide. Après éclaircissement, 



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230 CHAPITRE XVI 

on peut couper tout de suite, ou Ton peut conserver les blocs indéG- 
niment à sec dans un récipient clos. Il est souvent bon de les laisser 
évaporer pendant quelques heures avant de faire les coupes. Je fais 
les coupes à sec. La masse n'évaporant qu'excessivement lentement, 
il n'y a aucune nécessité à la couvrir d'essence pendant l'opération 
des coupes. J'ai eu des blocs qui sont restés pendant des semaines 
sur le microtome sans inconvénient. Celle-ci est la méthode que je 
! recommande personnellement. Elle a les avantages que nous avons 

exposés au numéro précédent. 

i 

I 298. Méthode rapide de Gilson. — M. le professeur Gilson a 

I bien voulu me communiquer le procédé suivant : déshydrater, impré- 

! gner d'éther, plonger dans du collodion ou de la celloïdine diluée, 

I dans un tube à réaction ; faire bouillir en plongeant le tube dans un 

! bain de paraffine fondue, jusqu'à ce que le liquide prenne la consis- 

; tance sirupeuse (cette ébullition se faisant à une température très 

i basse n'altère pas les tissus) ; monter la pièce dans ce même collodion 

[ épaissi sur un bloc ; durcir dans le chloroforme (environ une heure) ; 

^ éclaircir dans l'huile de cèdre (ou bien durcir directement dans un 

! mélange de chloroforme et huile de cèdre) ; mettre au microtome et 

! couper en couvrant chaque fois la pièce d'une goutte d'huile de cèdre 

i pour faire flotter la coupe. 

Il est évident que ce procédé a le grand avantage d'abréger énor- 
mément le temps nécessaire pour l'imbibilion des pièces par le collo- 
dion. 

299. Inolusion double dans le collodion et la paraffine. — 

Cette manœuvre est parfois utile pour TiDclusion d'objets dont on désire 
avoir des coupes très fines et qui sont trop fragiles pour donner de bons 
résultais par Tinclusion à la paraffine seule. 

Procédé de Kultschizky (Ztit, f. wiss. Mik,, IV, 1, 1887, p. 48). Imbiber 
de celloïdine (vingt-quatre heures). Puis, sans autre, mettre la pièce dans 
Tessence d'origan. Ensuite dans un mélange de paraffine et essence d'ori- 
gan, chauffe à pas plus de W* G. Puis mettre dans de la paraffine pure. 
Ryder (Joum, Boy. Mik. Soc, 1888, p. 512) recommande ce procédé^ 
[ mais en substituant le chloroforme à l'essence d'origan. 

Ces procédés ont le défaut de ne pas assurer une pénétration complète de 
l'objet par la paraffine, et en conséquence ils ne réussissent pas toujours. 
; FiELD et Martin (Bull. Soc. Zool. de France, 1894, t. XIX, p. 48) ont imaginé 

, d'obvier à cet inconvénient en faisant des inclusions simultanées dans la 

celloïdine et la paraffine. On prépare l'objet en l'imprégnant d'un mélange 
à parties égales d'alcool absolu et toluène. On fait une solution (de la con- 
sistance d'essence de girofle) de celloïdine sèche dans le même mélange 
d'alcool et toluène. On sature cette solution de paraffine, ajoutée en 



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COLLODION, GOMME, GOMME-GOPÂL, ETC. 231 

copeaux à une température qui ne doit pas dépasser 20 à 23^ G. On 
pénètre Tobjet de cette solution (la pénétration est plus rapide que dans la 
celloïdine usuelle). On durcit la masse en la jetant dans une solution 
saturée de paraffine dans du chloroforme, et finalement on fait Tinclusion 
dans de la paraffine pure de la manière ordinaire. Ou bien, on durcit dans 
une solution de paraffine dans du toluène, et Ton procède comme précé- 
demment. Les coupes se font comme pour la paraffine seule. 



AUTRES MASSES LIQUIDES A FROID ET SOLIDIFIABLES PAR ÉVAPORATIOiN 

300. L'inclusion à la gomme offre quelques avantages qui sont, 
dans certains cas, d'une grande importance. Les objets sont enrobés 
dans une masse transparente ; ils ne sont, en aucune façon, privés 
de leur eau naturelle ; et ils ne sont pas soumis à l'action de la cha- 
leur. Pour les travaux ordinaires, les masses à la gomme ne sau- 
raient certes pas entrer en concurrence avec la paraffine et le collo- 
dion ; mais, pour des tissus très délicats et en même temps très 
riches en eau, comme le sont ceux des Cœlentérés, elles peuvent 
rendre de grands services. 

301. Gomme simple (Stricker, Ifandb. d. Gewebelehre, p. XXIV). 
— On fait infdtrer les objets avec une solution concentrée de gomme ara- 
bique ; puis on fait Tinclusion, dans une boite de papier, et Ton met le 
tout, pour durcir la masse, pendant quelques jours dans TalcooL J'ai vu 
faire de cette manière des masses excellentes. 

302. Gomme glycérique (Jouet, Arch. de Zool. exp. et gén., 
t. X,188i, p. XLIII du n** 3). — On fait une solution de gomme ara- 
bique pure, ayant la consistance d'un sirop épais. Ou bien, on se sert 
des solutions de gomme qu'on trouve dans le commerce sous le nom 
de < colle forte blanche liquide >. Ces solutions ont l'avantage d'avoir 
une consistance uniforme ^ On verse un peu de la solution dans un 
verre de montre, de manière à ne pas l'emplir tout à fait. Puis on 
ajoutte 6 à 10 gouttes de glycérine pure, qu'on mélange aussi par- 
faitement que possible à la gomme. On met les objets dans la masse, 
et on laisse sécher le tout pendant un à quatre jours. Au bout de ce 
temps, la gomme doit avoir pris la consistance du cartilage ; cela 
arrive plus ou moins rapidement, selon l'état hygrométrique de l'air* 
Ordinairement, la gomme est liquide tout le premier jour, pâteuse 
le second, cartilagineuse le troisième. On découpe alors dans la 
masse une lame contenant l'objet, on la retourne et on la laisse 

1 Nous sommes à peu près sûr que ces solutions contiennent de la gélatine. 



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232 CHAPITRE XVI 

sécher jusqu'à ce qu'on la trouve bonne à être coupée. Avec une élu ve 
ou avec le secours du soleil on peut arriver à dessécher les pièces 
très rapidement, mais il vaut certainement mieux employer un des- 
sèchement très lent. Joliet a toujours trouvé que c'était après avoir 
attendu à peu près huit jours qu'il obtenait les meilleures coupes. 

Les proportions de glycérine et de gomme doivent varier, dans 
les limites que nous avons indiquées, avec la saison et la nature des 
objets. On mettra un peu moins de glycérine en hiver ou par un 
temps pluvieux, qu'en été ou par un temps sec. On peut imbiber les 
objets dans la glycérine avant de les porter dans la masse ; mais 
alors il faut tenir compte de la quantité de glycérine que chaque 
objet porte avec lui, et en mêler d'autant moins à la gomme direc- 
tement. 

Pour monter les coupes, Joliet recommande de les déposer sur le 
porte-objet au milieu d'une goulte d'eau ; on couvre et on ajoute au 
bord de la lamelle une goutte de glycérine ; celle-ci ne tarde pas à 
pénétrer, à se substituer à l'eau qui s'évapore et à se mêler à la 
gomme fondue avec laquelle elle forme un excellent liquide conser- 
vateur. 

303. Dextrine (Robertson, Journ.ofAnat., XXIV, 1890, p. 230). 
— On mêle ensemble 8 parties de glucose, 10 de dextrine et 1 d'acide 
borique. On ajoute de l'eau en raison de 3 parties d'eau pour 2 du 
mélange et l'on fait dissoudre en chauffant à ébuUition. Emploi 
comme pour la masse de Joliet, cidessus. 

804. Gromme-laque (Hyatt, Amei\ Mon. Micr. Joum., I, 1880, p. 8; 
Joum. Roy. Mie. Soc, 1880, p. 520). — Les objets doivent être pénélrés 
d'abord par ralcool, puis par une solutioQ de gomme-laque dans ralcool. 
Prendre un cylindre de bois tendre, le fendre en long, pratiquer dans les 
moitiés une cavité de la grandeur voulue pour recevoir Tobjet, Ty placer 
avec une grande quantité de solution épaisse de gomme laque, remettre les 
moitiés du cylindre en place et les ficeler. Après un jour ou deux, la gomme- 
laque s'est durcie. Pour faire les coupes, on trempe le cylindre dans de 
l'eau chaude et Ton fait des coupes à travers le tout. Si, à Texamen des 
coupes, on trouve la gomme-opaque, il est facile de l'éclaircir par Tadditlon 
d'une goutte de solution de borax. 

Cette méthode a été imaginée pour permettre de faire des coupes à tra- 
vers des organes ehitineux très durs, 

305. Gomme-copal (v. Kocn, ZooL Anzeig., 1878, p. 36). — Tri- 
turer des fragments de gomme-copal dans un mortier avec du sable, 
verser du chloroforme dessus en quantité suffisante pour obtenir 
une solution peu épaisse, et filtrer. Les objets, déshydratés par 



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^r^^^mtm'^ 



COLLODION, GOMME, GOMME-COPAL, ETC. 233 

Talcool, sont mis dans une capsule avec la solution de copal, qu'on 
évapore lentement en plaçant la capsule sur une tuile chauffée par 
une veilleuse. Aussitôt que la solution se laisse étirer en fils qui 
sont cassants après refroidissement, on enlève les objets de la cap- 
sule et on les met sécher pendant quelques jours sur la tuile. Lors- 
qu'ils ont acquis une dureté telle qu'ils ne se laissent plus marquer 
par Tongle, on peut faire les coupes. 

Pour les objets pour lesquels cette méthode fut imaginée — les 
Coraux — les coupes se font par la méthode d'usure. On fait d*abord 
des tranches aussi minces que possible, à l'aide d'une scie fine. On 
les use d'un côté sur une pierre à aiguiser de manière à obtenir une 
surface lisse, et on les cimente, la surface lissée en bas, sur un . 
porte-objet, à l'aide d'une solution de copal ou de baume de 
Canada. On laisse sécher le porte-objet pendant quelques jours sur 
la tuile chauffée. Lorsque le mastic est devenu parfaitement dur, 
on use la surface exposée des coupes, d'abord sur une meule, puis 
sur une pierre une à aiguiser, jusqu'à ce qu'elles soient suffisamment 
minces et polies ; on lave à l'eau et l'on monte au baume de Canada. 

Cette méthode est extrêmement importante pour fétude d'objets 
contenant des parties très dures et des parties molles dont on désire 
connaître les rapports. Imaginée pour l'étude des Coraux, on peut 
la mettre aussi à profit pour l'élude du tissu osseux, des dents, des 
coquilles calcaires, etc. Elle n'est nullement difficile à pratiquer. 

306. Colophane et cire (Ehrenbaum, ZeiL f, wiss. Mik., 1884, 
p. 414). — EiiRËNBAUM recommande de faire pénétrer les objets par 
une masse consistant en 10 parties de colophane et 1 partie de cire. 
L'addition de la cire a pour but de rendre la masse moins cassante. 
On traite les coupes par les méthodes d'usure connues (n^ 308). 
Lorsqu'elles sont achevées, on les traite d'abord par l'essence de téré- 
benthine, puis par le chloroforme, pour faire disparaître les dernières 
traces de la masse. 

307. Baume de Canada (Weil, Zeit. f, wiss, Mik., V, 2, 1888, 
p. 200). — Baume sec, dissous dans du chloroforme, pour plus de 
détails voyez loc. cit. ou Journ. Roy, Mie. Soc., 1888, p. 1042. 

METHODES DE CONGELATION ET AUTRES 

308. Gomme simple. — Ou peut soumettre les tissus frais à la congé- 
lation sans les avoir fait pénétrer par aucune masse d'inclusion. Mais cette 
pratique est défectueuse parce qu'elle donne lieu à la formation de cris- 



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234 CHAPITRE XVI 

taux de glace qui déchirent les tissus. Il faut donc chercher à pénétrer les 
tissus avec une masse qui ne cristallise pas en se gelant. 

On emploie très communément à cet effet la gomme arabique. Après 
imbibition, on en entoure Tobjet placé sur la platine ou dans le cylindre du 
microtome. 

309. Sirop de gomme (Hamilton, Joum. of Anat. and PhysioL, 
1878, p. 254). — Il parait que la présence du sucre dans Teau a pour effet 
de produire à la congélation une glace présentant, au lieu d*aiguilles, des 
granules qui ne nuisent pas aux tissus. Hamilton fait donc pénétrer ses 
objets par un sirop obtenu en faisant dissoudre deux parties de sucre blanc 
dans une partie d*eau. Il importe que le sirop ait cette concentration-là. 
Puis il les fait pénétrer par une solution de gomme, dans laquelle ils sont 
gelés. 

310. Gomme et sirop [Gole, Methods of Mie, Research, p. xxxix). 

Mucilage de gomme arabique P. B 5 parties. 

Sirop officinal P. B 3 — 

Mêlez, et ajoutez au mélange 1 p. 100 d'acide phénique pur. 

Pour le cerveau, la moelle, la réline, enfin tous les organes fragiles, il 
faut prendre 4 parties de sirop pour 5 de mucilage. 

Le mucilage de gomme arabique P. B. se compose de 4 parties de gomme 
arabique dissoutes dans 6 parties d'eau distillée, la solution étant passée 
à travers de la mousseline fine. 

Le sirop se fait en dissolvant 1 partie de sucre blanc dans 1 partie d*eau, 
et en faisant bouillir. 

Après pénétration, les objets sont essuyés et entourés de solution de 
gomme pure, dans laquelle lis sont gelés. Cette pratique a pour but d'em- 
pêcher les coupes de s'enrouler. 

811. Dextrine (Webb, Joum. Roy Mie. Soc., 1890, p. 113). Solution 
épaisse de dextrine dans de la solution d'acide phénique dans Feau à 
2,5 p. 100. 

312. Gélatine glycérique (Sollas, Quart. Journ, Mie. Se, 1884, 
p. 163). — Sollas emploie une gelée à la glycérine ordinaire (voyez ci-dessus, 
n«>» 28 i à 284) ; elle doit former au refroidissement une masse un peu 
ferme. 

Les coupes obtenues après congélation sont mises rapidement sur un 
porte-objet : elles y adhèrent. Aussitôt qu'on a déposé sur la lame le nombre 
voulu de coupes, on les couvre d'une goutte de glycérine ; on ajoute un 
couvre-objets, on le lute, et la préparation est achevée. Avec le temps, la 
glycérine pénètre la gélatine des coupes ; il est facile d'en activer la pénétra- 
tion en mettant la préparation dans une étuve chauffée de 20® à 30® C. 

313. Gomme et gélatine (Jacobs, Amer. NaL, 1885, p. 734; Joum. 
Roy. Mie. Soc. y 1885, p. 900). — Gomme arabique, 5 parties; gomme adra- 
gante 1 partie ; gélatine, 1 partie. Faire dissoudre dans l'eau chaude q. s. 



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COLLODION, GOMME, GOMME-COPAL, ETC. 235 

pour donner une gelée peu épaisse après refroidissement. On ajoute à Teau 
employée pour faire la dissolution un sixième de glycérine. 

314. Huile d'anis (Kûqne, Centralblati f, BacL, XII, 1892, p. 28 ; 
Joum. Roy. Mie, Soc., 1892, p. 706).— Pénétrer par Thuile d'anis, geler sur 
le microtome, couper, enlever Thuile par de Talcool, ou bien (Moore), 
monter directement dans le baume. Cette méthode sera souvent commode 
à cause de la facilité de congélation ; Thuile d*anis se solidifie à lO^' G. 

316. Blanc d*œiif(R0LLBTT, Denkschr. math, naturw. KL k. Acad. Wiss. 
Wien, 1885 ; ZeU. f. wiss. Mik., 1886, p. 92). — Rollett met de petits morceaux 
de tissus frais dans du blanc d'œuf pris sur un œuf fraîchement pondu, 
les porte dans ce blanc d'œuf sur la platine d*un microtome à congélation 
et les y enrobe dans une nouvelle quantité de blanc d*œuf. On fait geler et 
on coupe. Il faut se servir d'un rasoir bien refroidi. On porte les coupes 
sur un porte-objet, et on les examine soit dans le blanc d'œuf, soit dans la 
glycérine diluée. 

316. Inclasion au blanc d'œnf suivi parla coagulation par la 
chaleur. — Entièrement démodée, mais voyez au besoin Zeii. f. wiss. Mik., 
1884, p. 223 (RUNGE) ; Morph. Jahrb., Bd. ii, 3tes Heft, 1876, p. 445 (Gal- 
derla) ; Zool. Anz.^ 6 vol. i, 1878, p. 130 (Selenka) ; Joum. Roy. Mie. Soe., 
1883, p. 304 (Thoma); et Becker, Zur Anat. d. ges. u. kranken Linse (Ruge). 



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CHAPITRE XVII 

MÉTHODES POUR COLLER LES COUPES EN SÉRIES 
SUR LE PORTE-OBJET 



317. Choix d'une méthode. — Pour les travaux ordinaires nous 
recommandons les procédés suivants. Pour des coupes à la paraffine 
déjà colorées, le coliodion de Scuaellibaum. Pour les coupes à la paraf- 
fine destinées à être colorées, Talbumine de Mayer, à moins que la 
teinture qu'on veut employer ne soit de celles qui colorent Talbu- 
mine, ou à moins que les coupes ne soient plissées ; en ces cas, une 
des méthodes à l'eau distillée du numéro suivant. Pour les petites 
coupes à lacelloïdine, un des procédés aux vapeurs d'éther (Summers). 
Pour les grandes coupes à la celloïdine, la méthode de Weigert. Les 
autres méthodes citées sont du reste toutes bonnes (quoique quelques- 
unes d'elles ne soient pas aussi infaillibles que le disent les auteurs). 

A. — Méthodes pour coupes a la paraffine 

318. La méthode à ralcool ou à Teau distillée. — Le pi^in- 
cipe de cette méthode est dû à Gaule (Ai*ch, f, Anat. u. Phy.^ Phys, 
Abth., 1881, p. 156). — Mouiller la lame avec de Talcool, et y arran- 
ger les coupes à l'aide d'un pinceau également imbibé d'alcool; 
laisser évaporer l'alcool ; chauffer, de manière à faire fondre la paraf- 
fine ; poser dessus une lamelle mince ; ajouter au bord de la lamelle 
une goutte de xylol, puis, après un moment, une goutte de solution 
de baume de Canada dans le xylol. 

// faut mouiller d'alcool, et il faut chauffer; Tune de ces manœuvres 
ne suffit pas sans l'autre. 

C'est là un procédé que nous pratiquons très souvent, car il est 
très commode. Il va sans dire qu'il suppose une certaine adresse. 



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MÉTHODES POUR COLLER LES COUPES EN SÉRIES 237 

Nous recommandons de poser d'abord la lamelle et d'appuyer avec 
le doigt sur Tun de ses angles pendant que Ton chauffe au-dessus de 
la flamme d'une lampe À alcool; la paraffine fondue se ramasse sur 
cet angle et on Tenlève avec un papier à cigarette. On laisse le papier 
k cigarette en place et Ton ajoute le xylol et le baume. Si Von n'a 
que peu de coupes à monter, ou si Ton désire seulement faire un 
examen préliminaire de Tobjet dans une essence sans tenir à la con- 
servation définitive des coupes, ce simple procédé suffit parfaite- 
ment. 

Des modifications apportées à ce procédé par d'autres travailleurs 
l'ont rendu applicable au montage de séries très étendues de coupes. 

SucuANNKK {Zeit, f. wiss. Mik,, VII, 4, 18Dl,p. 464) a établi que les 
conditions suivantes sont obligatoires. 

Premièrement, les lamelles doivent être absolument libres de toute 
trace de graisse à leur surface, pour que l'alcool (à 50 p. 100, ou 
bien l'eau distillée, qu'on peut également employer) puisse s'étaler 
en une couche mince et d'égale épaisseur. Secondement, les lamelles 
ne doivent pas être chaufi'ées à plus de 40° G., car il importe que 
V alcool ou Veau s'évapore lentement et que la paraffine soit seule- 
ment ramollie^ pas fondue^ tant que l'évaporation n'est pas achevée. 
Pour ce motif, Hoyer avait déjà conseillé une évaporation lente à la 
température du laboratoire. 

GuLLAND [Journ. of Anal, and Phys,, XXVI, 1891, p. 56; Journ. 
Roy. Mie, Soc. , 1892, p. 161) fait flotter ses coupes, pour les déplis- 
ser, sur de Teau chaude (pas assez chaude pour faire fondre la paraf- 
fine) ou bien sur l'alcool, dans une cuvette, et de là les conduit en 
position sur la lamelle. On fait égoutter la lamelle et l'on évapore à 
une température basse comme ci-dessus (lorsque l'eau s'est entière- 
ment évaporée, les coupes prennent un aspect sec et un peu transpa- 
rent). Des coupes minces seront en général fixées en une heure ; des 
coupes épaisses demanderont six heures ou davantage. La fixation 
étant jugée complète, on fait fondre la paraffine, on l'éloigné par le 
dissolvant qu'on voudra, et l'on peut monter ou bien passer à la colo- 
ration ou à toutes autres manipulations qu'on voudra, sans grande 
crainte de voir les coupes se déranger. 

II paraît cependant certain que la méthode n^eslpas infaillible, et 
que les résultats dépendent plus ou moins de la nature des coupes. 
Ainsi Sciiieffekdecker {Zeit. f. wiss, Mik., IX, 2, 1892, p. 202) a 
trouvé que plus les coupes sont grandes et minces, et mieux elles 
adhèrent; eivice versa. Et M. Pringle m'écrit qu'il a trouvé que les 
coupes de matériel fortement fixé dans les solutions chromiques, de 



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238 CHAPITRE XVII 

manière à rendre insolubles les albuminoîdes des tissas, n'adhèrent 
pas bien. 

M. Heidenqain {Kern, u. Protoplasma, 1892, p. 414) procède 
comme Ta indiqué Scchannbk, employant de l'eau distillée et évapo- 
rant plusieurs heures à une température ne dépassant pas 35^ G. Il 
trouve Teau préférable à Talcool, qui est trop mobile sur la lamelle 
et s'évapore trop vite. Heidenhain aussi a trouvé que le procédé est 
moins sûr avec du matériel chromique. 

La méthode de Durham {Quart. Joum. Mie, Sei,, 1891, p. 116; 
Journ. Roy. Mie. Soe., 1892, p. 293) est la même, si ce n'est qu'il 
emploie l'alcool à 70 p. 100 au lieu d'eau. 

Wlassak (« Les coupes du système nerveux central » de Mercier, 
Paris, RuefT, 1894, p. 118) monte les coupes d'abord sur une goutte 
d'eau tiédie déposée sur la lamelle, puis les expose à la vapeur d'eau 
distillée bouillante, puis les met dans l'étuve. 

319. Gollodion (Sghjblubaum, Arch, f. mik, Anat., 1883, p. 565). 
— On mêle ensemble une partie de collodion et, selon la consistance 
du collodion, 3 ou 4 parties d'essence de girofle. On étale une quan- 
tité minime de la solution claire ainsi obtenue sur le porte-objet, à 
l'aide d'un petit pinceau. Gela forme une couche collante sur laquelle 
on dépose les coupes, en les étalant et en les aplatissant un peu avec 
un pinceau, à mesure qu'elles sont faites. Pour les fixer, Schœllibaum 
chauffe le porte-objet à une douce chaleur sur un bain-marie jusqu'à 
évaporation de l'essence de girofle, ce qui a lieu en cinq à dix 
minutes. Nous pouvons assurer qu'on arrive au but bien plus simple- 
ment et tout aussi sûrement en tenant le porte-objet au-dessus de la 
flamme d'un bec de Bunsen ou d'une lampe à alcool jusqu'à ce que la 
paraffine soit fondue et que l'essence de girofle se soit rassemblée en 
larmes entre les coupes, ce qui arrive en quelques secondes ou au 
plus, en une demi-minute ; il est tout à fait inutile de faire évaporer 
l'essence. Gela fait, il est utile de faire la manipulation suivante (dont 
je dois la connaissance à l'obligeance de M. le professeur Korotnefp). 
On tient le porte-objet devant les lèvres, aussi près que possible, et 
l'on projette l'haleine vigoureusement sur les coupes. L'essence et en 
même temps la paraffine fondue sont projetées en larmes de tous 
côtés en dehors de l'espace occupé par les coupes ; on essuie avec une 
serviette. Par ce moyen, la majeure partie de la paraffine est enlevée 
du coup, ce qui facilite le travail du dissolvant à employer ensuite. 
De plus, les coupes se trouvant en contact plus intime avec le collo- 
dion collent mieux. 



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MÉTHODES POUR COLLER LES COUPES EN SÉRIES 239 

On traite alors les coupes par uq dissolvant quelconque de laparaf- 
Qne qui n*attaque pas le collodion (Scujsllibaum recommande Tessence 
de térébenthine ; pour notre part, nous préférons et nous recomman- 
dons le xylol). L*on monte au baume, ou bien on passe par Talcool 
absolu aux alcools plus faibles et à la coloration dans une teinture 
alcoolique ou aqueuse. 

FiELD et Martin {BulL Soc. ZooL de France, XIX, 13 mars 1894, p. 48), 
ont trouvé que le xylol, le toluol, et la benzine préparent le collodion à 
une solution plus aisée dans Talcool; de sorte que ces éclaircissements 
seraient à éviter pour les cas où Fou doit procéder à la coloration des coupes. 
Ces auteurs recommandent, pour ces cas, Téther de pétrole (pétrole léger 
d*une densité égale à 0,650) ou le chloroforme. 

Personnellement, nous ne recommandons pas la méthode de Schœl- 
libaum pour les coupes à colorer, parce que nous ne l'avons pas trou- 
vée suffisamment sûre, les coupes ayant trop de tendance à se détacher 
dans Talcool. Nous la recommandons pour le matériel déjà coloré^ 
parce qu'elle est commode et donne des préparations très propres. 
Elle a le défaut de ne pas bien se prêter aux manipulations nécessaires 
pour aplanir des coupes plisséea. 

On trouvera peut-être, après la coloration, que la couche de collodion 
entre les coupes est devenue opaque. Gela provient de ce que Ton a 
employé une solulion trop riche en collodion, ou bien de ce que Ton a 
étalé le collodion en une couche trop épaisse. On fait disparaître facilement 
cette opacité en déshydratant et en traitant à plusieurs reprises par Talcool 
absolu et Tessence de térébenthine, puis en chauffant doucement ; ou bien, 
en brossant Tespace opaque avec un pinceau imbibé d'essence de girofle. 

La solution de collodion peut être faite avec l'essence de lavande au 
lieu d'essence de girofle. 

Gage préfère préparer ses porte-objets avec une couche de collodion nor- 
mal qu*il laisse sécher et dont il rend la surface collante, au moment de 
s*en servir, en la brossant légèrement avec un pinceau imbibé d*essence de 
girofle. SuMifERS (The Microscope, 1886, p. 66, et Journ, Roy. Mie. Soc, 
1886, p. 544) emploie également une couche sèche, qu'il rend collante après 
y avoir posé les coupes, en y déposant une goutte d'un mélange à parties 
égales d'alcool et d'éther, qu'on laisse évaporer. Cette méthode dispense de 
l'emploi de la chaleur et pourra surtout rendre des services pour les coupes 
à la celloïdine. 

Strasser emploie un collodion riciné, pour lequel voyez Zeit. f. wiss. Mik., 
IV, I, 1887, p. 45, et VI, 2, 1889, p. 153. Pour la méthode très compliquée 
de cet auteur au moyen de papier gommé et coliodtonné, qui nécessite 
l'emploi d'un microtome spécial, voyez Zeit. f, wiss. MiL, III, 3, 1886, 



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240 CHAPITRE XVII 

p. 346, et VI, 2, i889, p. 154, et Vil, 3, 1890, p. 290, et p. 304, et IX, I, 1892, 
p. 8. Oa trouvera dans Journ. Roy, Mie. Soc, 1892, p. 703, un court extrait 
(le ce dernier mémoire^ avec figure du t Sclinitt-Âufklebe-Mikrotom ». 

Gallemaerts (Bull. Soc. Belge deMicr.^ XV, 1889, p. 56) préfère employer 
une solution saturée de pyroxyline dans Tacétone, qu'il allonge d'alcool 
absolu. 

320. Gomme -laque (Giesbrecht , Galdwell, Mayer). — Voici la 
méthode originelle de Giesbrecht, qui trouve encore des adhérents (Zool. 
Anzeig., 1881, p. 48i). On fait une solution pas trop forte de laquA rou^çe 
dans Talcool absolu, et on la filtre. On prend un porte-objet chauffé, et on 
le couvre d'une couche mince de laque à l'aide d'une baguette de verre 
qu'on plonge dans la solution et qu'on passe une seule fois horizontalement 
sur la lame. On laisse sécher celte couche. 

Au moment de faire les coupes, on rend la couche de laque collante en la 
brossant légèrement avec un pinceau imbibé de créosote. On pose les coupes 
sur cette couche ; on chauffe le tout au point de fusion de la paraffine 
pendant un quart d'heure, ce qui fait évaporer la créosote ; on éloigne la 
paraffine en traitant les coupes par quelques gouttes de térébenthine, et 
l'on monte au baume de Canada. 

Dans les Mitth. zool. Stat. Neapel, de la même année, il est recommandé 
de prendre de la laque blanche au lieu de laque rouge, et de faire la solution 
dans l'alcool absolu (1 partie de laque pour 10 d'alcool absolu). La laque 
blanche du commerce étant souvent très difficilement soluble dans l'alcool, 
Kingsley recommande de prendre de la laque rouge et de la faire blanchir en 
l'exposant au soleil (Voyez Wihtman, Melhods in Microscopical Anatomy, 
1885, p. 117). Mark emploie les solutions de laque dont se servent les 
artistes pour fixer les dessins au fusain. Dans le même numéro des Mil- 
Iheilungen nous trouvons encore une modification du procédé originel qui 
consiste à brosser la lame avant de s'en servir avec de l'essence de girofle 
au lieu de créosote, la lame étant légèrement chauffée. 

Il faut observer que les solutions de baume de Canada employées pour 
monter les coupes sont capables de dissoudre la laque. Il est donc bon de 
poser le baume sur le vçrre à couvrir et de mettre celui-ci rapidement en 
place, de manière à assujettir les coupes au plus vite. 

La méthode de Galdwell {Quart. Journ. Mie. Se, 1882, p. 336) 
constitue une simplification importante de ce procédé. On prépare la 
lame au moment de s'en servir en la brossant légèrement avec une 
forte solution de gomme-laque dans la créosote. Après avoir posé les 
coupes, on les chauffe pendant une demi-heure à une température un 
peu supérieure au point de fusion de la paraffine, et on les traite par 
la térébenthine, comme nous Tavons dit. 

Ces deux méthodes ont le défaut de laisser se former des granula- 
tions dans la couche de gomme-laque. Mayer attribue la formation de 
ces granulations à l'emploi de la créosote ou de l'essence de girofle, 
et propose de les éviter en employant comme dissolvant Tacide 



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MÉTHODES POUR COLLER LES COUPES EN SÉRIES 241 

phénique. Yoicî comment il prépare la solution. On pulvérise la laque 
et on la chaufTe avec des cristaux d'acide phénique incolore jusqu à e 
qu'elle soit dissoute. Il faut alors ûllrer, ce qu'on peut faire en ayant 
soin de chauffer l'entonnoir pendant le filtrage. Si la solution est trop 
épaisse, on peut ajouter quelques cristaux d*acide phénique. (Voyez 
Joum. Roy. Mie. Soc^ 1886, p. 9i0, et Whitman, Methods in Mie. 
Anat.y p. 117.) 

Plus récemment, Mayer {Intem. Monatsehr. f. AnaL, 1887. Hft 2) 
rappelle que l'acide phénique chaud attaque certains tissus, et propose 
le procédé suivant. On prépare des lamelles à la laque alcoolique 
selon le procédé de Giesbrbcht. On pose les coupes à sec, en les 
appliquant fortement sur la couche de laque, et on expose pendant 
une demi-minute aux vapeurs d'élher. 

Ces méthodes ne permettent pas la coloration des coupes. J'ajoute 
pour ma part que je ne comprends pas bien en vertu de quoi les 
méthodes à la gomme-laque trouvent encore des fauteurs, nonobstant 
les procédés plus commodes et plus sûrs qui sont maintenant connus. 

321. Albumine (Paul Mayer, MiUh. zool, Stat. Neapel, IV, 1883, 
p. 521), — On prend un blanc d'œuf, on y ajoute un peu de solution 
de salicylate de soude, et l'on filtre. Au liquide filtré on ajoute un 
volume de glycérine et encore un peu de salicylate, ou un autre anti- 
septique. 

D'après Intem. Monatsehr. f. Anat., 1887, Hft 2, on doit prendre 
80 grammes de blanc d'œuf, 50 grammes de glycérine, et 1 gramme 
de salicylate de soude, les bien agiter ensemble et filtrer. Je fais 
observer qu'en tout cas on doit en premier lieu dissoudre le salicylate 
dans un peu d'eau, car il ne se dissout que difficilement dans l'albu* 
men avec de l'eau avant d'ajouter la glycérine. 

Fol (Lehrbueh, p. 134) prend un blanc d'œuf qu'il réduit en neige 
en le battant, laisse déposer, filtre rapidement à travers un filtre 
pneumatique, ajoute un volume de glycérine, filtre encore une fois, 
et ajoute un peu de camphre ou d'acide phénique. J'ai trouvé que 
l'acide phénique précipite beaucoup d'albumine, et je conseille de s'en 
tenir au salicylate jusqu'à ce qu'on ait trouvé mieux. 

On étale ce fixatif en couche mince sur le porte-objet au moment 
de s'en servir, on pose les coupes sur la couche humide, on chauffe 
pendant quelques minutes au bain-marie, et l'on enlève la paraffine 
fondue par l'essence de térébenthine. 

Je trouve préférable de chauffer au-dessus d'une flamme et de 
chasser la paraffine fondue au moyen d'un vigoureux souffle, comme 

ANAT. SIICROSC. IQ 



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242 CHAPITRE XVII 



Tf nous l'avons dit pour la méthode de ScajELLiSAUM. J'enlève la paraf- 

1 fine par le xylol ou le toluol. On peut Tenlever à froid si l'on veut. 

i; Fol fait observer que dans tous les cas les coupes, colorées ou non, 

t qui sont destinées à être montées dans le baume, doivent être soigneu- 

f sèment lavées dans Talcool ; autrement, il restera dans Talbumine 

des traces de glycérine qui troublent les préparations par la suite. 

Cette méthode est particulièrement appropriée aux séries de coupes 
qu'on désire traiter par les teintures. L'albumine est extraordinaire- 
ment tenace, de sorte qu'on ne risque aucunement de voir les coupes 
se détacher. Pour la coloration, on peut employer les teintures ordi- 
naires ou les anilines. Dans l'un et l'autre cas, si l'on fait usage d'un 
procédé de coloration suivie de décoloration, cette méthode offre 
l'avantage de faciliter beaucoup la surveillance de la décoloration ; 
si l'on arrête celle-ci au moment même où la couche de fixatif a perdu 
sa couleur, on obtient en général une coloration nucléaire parfaite- 
ment précise. 

Nous avons donné, numéro 269, un procédé pour le déplissage des 
coupes combiné avec l'emploi de l'albumine comme fixatrice. 

Dans notre expérience, la méthode de Mayer au blanc d'œuf est 
une méthode absolument sûre. 

Il arrive souvent que le mélange de Mayer se trouble après quelque temps, 
ce que Ton a attribué au développement d'un microbe. On a dit (Yosseler, 
Zeii, f. iviss. Mik., VII, 4, 4891, p. 457) que le mélange devenu trouble a 
perdu ses propriétés adhésives et doit êli*e jeté. Dans mon expérience voici 
ce qui se passe. Le liquide devient laiteux, puis se trouble tout à fait, enfin 
se caille tout à fait, en passant à un état caséeux. Mais à aucun moment il 
n'a perdu ses propriétés adhésives. Tant qu'il conserve assez d'humidité 
pour humecter le pinceau, il colle aussi bien que le premier jour, sinon 
mieux. 

J'ajouterai que je crois qu'il y a quelquefois avantage à allonger le mé- 
lange d'eau ; il le supporte très bien. 

322. Albumine (Mann, Zeii, f, wiss. Mik., XI, 4, 1894, p. 486). — Du 
blanc d'œuf bien secoué avec 10 volumes d'eau distillée et filtré deux 
fois à travers le même papier. En enduire une provision de lamelles, 
les laisser sécher à l'abri de la poussière (elles se conserveront indé- 
finiment dans l'état voulu). Flotter les coupes sur de l'eau chaude 
(40® C), d'après le procédé de Gulland, dans un récipient profond. 
Glisser une lamelle sous les coupes, les arranger, retirer la lamelle 
et la poser pendant cinq minutes sur une étuve à3S° C. Xylol, alcool, 
etc., etc. 

Des lamelles enduites d'albumine et conservées à sec avaient déjà 



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MÉTHODES POUR COLLER LES COUPES EN SÉRIES 



243 



été employées par Gage pour coupes au collodion (Voir Zeit, f, tozss. 
Mik,, X, 1, 1893, p. 77.) 

323. Gomme arabique (Flobgel, ZooL Anzeig., 1883, p. 563). — 
Faire une solution de 1 partie de gomme arabique dans 20 parties 
d'eau ; filtrer et ajouter un peu d'alcool pour prévenir le développe- 
ment de moisissures. Ëtaler cette solution sur le porte-objet en la 
versant dessus et laissant, égoutter les lames (il est important de 
n'employer que des porte-objets très soigneusement nettoyés). 

Les coupes ayant été posées en ordre sur la couche collante ainsi 
formée, on éloigne la paraffine par une goutte de benzine, et Ton 
monte au baume. (D'après Flcegel, si les coupes ne contiennent que 
très peu de paraffine, il n'est pas nécessaire de les traiter par un 
dissolvant, la solution de baume suffisant à dissoudre l'excès de paraf- 
fine. Nous pouvons constater qu'il en est ainsi, mais nous ne 
recommandons pas cette pratique, qui peut donner lieu à des granu- 
lations dans les préparations.) 

On peut modifier cette méthode en laissant sécher complètement la 
gomme sur la lame, après quoi on y pose les coupes à sec. Pour les 
faire adhérer, il suffit d'humecter la surface de la gomme en dirigeant 
l'haleine dessus. 

Cette méthode est excellente pour les coupes destinées à être 
montées directement dans le baume, mais elle ne permet pas la colo- 
ration dans des teintures aqueuses. 

Waddington {Joum, Quehett Club, 1881, p. i99) recommande le procédé 
suivant pour la préparation d'une gomme arabique parfaitement pure et ne 
présentant pas de granulations sous le microscope. Faire une solution peu 
épaisse de gomme arabique dans de Teau distillée. Filtrer. Verser le liquide 
filtré dans de Talcool fort et bien agiter; la gomme se précipite sous forme 
d*une masse pâteuse. Recueillir celte masse sur un filtre et la laver avec de 
Talcool jusqu'à ce que Talcool de lavage ne contienne plus d'eau. La sécher. 
On obtient ainsi une poudre blanche qu'il faut faire dissoudre dans l'eau 
distillée et filtrer deux fois. On peut alors verser la solution sur des lames 
porte-objets, faire égoutter et sécher ces lames, et les conserver indéfini- 
ment, prèles à être employées. 

324. Gomme à l'alun de chrome (Frenzel, A7xh, f, mik. Anat., 
1885, p. 51). — Faire une solution peu épaisse de gomme arabique 
dans l'eau, et l'additionner de solution aqueuse d'alun de chrome. On 
peut mettre un excès de ce réactif sans inconvénient. Finalement, on 
ajoute un peu de glycérine et une trace d'alcool {loc. cit,y p. 142). 
On prépare les lames avec cette solution de la manière connue. 



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244 CHAPITRE XVH 

on y pose les coupes (il est indifférent qu'elles aient été faites par la 
voie sèche ou par la voie humide) et on les chauffe pendant un quart 
d'heure, au plus, à une température de 30 à 45** G. Cela suffît pour 
rendre la gomme insoluble. 

Cette méthode permet la coloration sur porte-objet. La couche de 
gomme ne se colore pas dans les teintures les plus usitées; seules la 
safranine et la fuchsine la colorent d'une manière nuisible. 

325. Mucilage de coings (Born et Wieger, Zeit, f, wiss. Mik., 1885, 
D. 346). — On prend du mucilage de coings ordinaire des pharmacies. A 
ieux volumes de ce mucilage on ajoute un volume de glycérine et une trace 
d'acide phénique. Emploi comme pourTalbumine de Mayer. 

On éloigne la paraffine fondue par une goutte d'essence de térébenthine, 
puis on porte la lame dans Talcool absolu, où on la laisse une demi-heure ; 
il est important que Talcool soit absolu et que la lame y reste le temps 
indiqué. On peut alors colorer. Il est cependant nécessaire d'éviter les tein- 
tures alcalines, telles que le carmin ammoniacal et le carmin au borax, car 
les liquides alcalins attaquent la couche de mucilage et font détacher les 
coupes. 

326. Autres méthodes pour coupes à la paraffine. Méthode 
d'OBREGiA, importante n® 334. 

Agar-Agar (Gravis, BulL Soc. Belge de Micro., XV, 1889, p. 72). Solu- 
tion d'agar-agar à 1 pour 1000 dans l'eau, à employer comme le mucilage 
de Born. 

Gélatine (Gray, Journ. Hoy. Mie. Soc, 1890, p. 117). Solution de géla- 
tine à 1 p. 100 dans l'eau, emploi compliqué. 

Méthode de TValsem, au papier gélatine (Zeit. f. wiss. Mik., XI, 2, 
1894, p. 229). Excessivement compliqué. 

B. — Méthodes pour coupes aqueuses 

327. Gélatine et alun de chrome (Fol, Lehrbuch, p. 132). — 
On fait dissoudre 4 grammes de gélatine dans 20 ce. d'acide acétique 
cristallisable, en chauffant au bain-marie et en agitant fréquemment. 
A 5 ce. de la solution on ajoute 70 ce. d'alcool à 70 p. 100 et 1 à 2 ce. 
d'une solution d'alun de chrome à 5 p. 100 dans l'eau. On verse ce 
mélange sur le porte-objet à préparer. On laisse sécher à Tair, et au 
bout de quelques heures la couche de gélatine passe à l'état insoluble. 
Cependant la gélatine conserve la faculté de se gonfler un peu et de 
devenir collante en présence de l'eau. On plonge donc le porte-objet 
sous la surface de Teau dans laquelle nagent les coupes, on fait 
glisser les coupes à leur place et on lève le tout avec précaution ; les 
coupes se trouvent fixées en place. 

Cette méthode s'applique soit au cas de coupes faites sous l'eau. 



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MÉTHODES POUR COLLER LES COUPES EN SÉRIES 245 

soit au cas de coupes faites dans des masses de gomme ou de savon ; ces 
masses se gonflant beaucoup en présence de l'eau, il est bon de les 
éloigner avant de coller les coupes, autrement les coupes se soulèvent 
en des plis nombreux. 

On pourra la trouver utile pour les grandes coupes faites à la cel- | 

loïdine . | 

Notons ici que la méthode d'ÛBREGiA, numéro 334, peut très bien 
s'appliquer aux coupes aqueuses. | 

328. Poli (Malpighia, II, 1888, 2, p. 3; ZeiL f. wiss, Mik., V, 3, 1888, | 

p. 361) enduit le porte-objet de gélatine de Kaiser (qo283) fondue, y dispose | 

les coupes, et ajoute de la glycérine et un verre à couvrir. 

d29.Gntta-Percha (ou Gaoutohouc), Frenzel et Threlfall {Zool, 
Anz,j 1883, p. 51, 301 et 423). J'ai trouvé que cette méthode élégante 
n'est pas sûre, car la pellicule de gutta-percha se déchire très facilement. 
C'est probablement pour ce motif que cette méthode est maintenant entière- 
ment abandonnée. 

C. — Méthodes pour coupes au collodion î 

i 
330. Méthode à Téther de Summers {Journ. Roy. Mie, Soc, j 

1887, p. 823). — Outre le procédé donné numéro 319, qui est appli- j 

cable aux coupes au collodion, Summers trouve que le suivant suffit 

parfaitement. On met les coupes pendant un instant dans de Talcool à | 

98 p. 100, on les dispose sur le porte-objet et Ton verse dessus de la 

vapeur d*élher. Le collodion se ramollit et devient transparent, et 

Ton porte la lamelle dans de Talcool à 80 ou même 95 p. 100. On 

peut colorer. ! 

Gage {Zeit, f. wiss. Mik.^ X, 1, 1893, p. 77) trouve que si les coupes 
doivent être colorées il est préférable d^employer des lamelles albuminées | 

selon le procédé indiqué n^ 322 ; les coupes y adhèrent mieux. 

EYCLESHEniER {Amer. Nat,, xxyi, 1892, p. 334 ; Journ, Roy. Mie, 
Soc.^ 1892, p. 563) procède ainsi. Les coupes sont arrangées sur le 
porte-objet avec assez d^alcool pour les tenir humides, pas assez pour 
les flotter. On les couvre d'une bande de papier fln non-glacé (toilet 
paper) qu'on assujettit au moyen d'un fil enroulé autour du papier ; 

et de la lamelle. Les tours du fil doivent passer entre les coupes, 
s'ils arrivent à passer au-dessus ils entravent la marche de la tein- 
ture. On peut maintenant colorer, traiter avec les liquides usuels ' 
jusqu'à l'alcool de 95 p. 100, et éclaircir dans le mélange n® 298. On 



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246 CHAPITRE XVII 

enlève l'excès d'éclaircissant avec du papier buvard, on coupe le 
fil, enlève le papier en le roulant, et monte au baume. 

Ces procédés suffisent pour les petites séries. Les méthodes qui 
vont suivre ont trait à des séries plus étendues. Nous donnons en 
premier lieu celles d'ApATHY comme étant relativement simples. 

331. Méthode à l'essence de bergamote (Apathy, Mitth, Zool. 
Stat, Neapel, 1887, p. 742; Journ, Boy. Mie. Soc, 1888, p. 670). — 
Faire les coupes avec un couteau enduit de vaseline jaune et mouillé 
d'alcool à 98 p. 100. Flotter les coupes sur de l'essence de bergamote 
(elle doit être verte, doit se mêler parfaitement à l'alcool à 90 p. 100 
et ne pas avoir d'odeur de térébenthine). Les coupes s'étalent sur Tes- 
sence. Avant qu'elles ne s'y enfoncent on les conduit en place sur une 
petite bande de papier à décalquer préalablement plongée dans l'es- 
sence. Lorsqu'on a ainsi disposé une série, on laisse égoutter le 
papier, on en sèche la face inférieure avec du papier buvard, on le 
retourne et on le presse, les coupes en bas, sur un porte-objet bien 
sec. Les coupes se collent au verre et Ton enlève le papier en le rou- 
lant graduellement d'un bout à l'autre. On enlève des traces d'es- 
sence qui peuvent être restées autour des coupes avec un papier à 
cigarette. S'il n'y a pas de coloration à faire, il n'y a plus qu'à 
ajouter du baume et un verre à couvrir. 

Dans le cas d'objets non colorés ou très petits, il est bon d'ajouter à 
l'essence de bergamote un peu de solution alcoolique de safranine. Le col- 
lodion des coupes s'y colore, et rend les coupes visibles. La couleur dispa- 
raît d'elle-même après quelques jours dans le baume. 

Si les coupes doivent être colorées, après enlèvement de l'essence 
on traite par la vapeur d'un mélange d'alcool et éther (voyez au 
numéro précédent). 

Si la coloration doit être faite dans un liquide aqueux, il faut avoir 
soin en arrangeant les coupes de faire en sorte que la marge de cel- 
loïdine de chacune recouvre un peu celle de sa voisine ; alors l'éther 
les fond toutes par les bords en une lamelle continue. Ce feuillet se 
détache du verre dans les liquides aqueux, et on le traite ensuite 
comme une seule coupe. 

332. Méthode au eouteau d'ApATUY {Zeit. f. wiss. Mik., VI, 2, 
1888, p. 168). — Le couteau est couvert de vaseline jaune et d'alcool 
comme dans la méthode précédente. A mesure que les coupes sont 
faites on les conduit à l'aide d'une aiguille ou d'un petit pinceau à un 



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MÉTHODES POUR COLLER LES COUPES EN SÉRIES 247 

endroit sec de la lame du couteau (c'est-à-dire un endroit où il n*y 
a pas trop d'alcool, mais bien de la vaseline, le tout est censé être 
enduit de vaseline). On les dispose en séries en cet endroit, la marge 
de celloïdine de chacune recouvrant celle de sa voisine. Les séries 
doivent être de la longueur du verre à couvrir et être disposées en un 
carré des dimensions de ce verre. Lorsqu'un carré est complet, on 
sèche les coupes en tamponnant le tout avec du papier buvard ; il 
n'y a pas de risque qu'elles s'attachent au papier, car elles sont rete- 
nues par la vaseline. On enduit maintenant le tout avec de la solution 
très épaissse de celloïdine, et l'on laisse évaporer pendant cinq 
minutes à l'air. Puis on enlève le couteau du microtome et on le met 
pour une demi-heure avec les coupes dans de l'alcool à 70 p. 100. 

Si l'on désire préparer plus d'un carré de coupes à la fois, il n'y a 
qu'à mouiller le premier avec de l'alcool à 70 p. 100 et le laisser 
en place pendant qu'on prépare les autres. Le séjour dans l'alcool 
fait solidifîer la celloïdine en un feuillet continu qu'on détache avec 
un scalpel et qu'on peut colorer en masse. Il est bon de le mettre 
immédiatement sur une lamelle, en mouiller les bords avec un 
mélange d'alcool et éther pour qu'il ne se détache pas, et porter le 
tout dans la teinture. 

« 

333. Méthode de Weigert {Zeit, f, wiss, Mik., 1885, p. 490). — 
Les coupes sont faites, comme d'habitude, avec un rasoir mouillé 
d'alcool. Il faut faire attention à ne pas avoir sur la lame assez 
d'alcool pour faire flotter les coupes. On ne prend pas les coupes 
avec un pinceau, mais avec une bandelette de papier. La bandelette 
de papier doit avoir environ deux fois la largeur des coupes. Elle doit 
être découpée dans du papier assez poreux pour s'imbiber facilement 
d'alcool, et en même temps assez résistant, à Tétat imbibé, pour ne 
pas se déchirer sous l'influence d'une légère traction. Weigert recom- 
mande le c papier-closet « ; nous pensons qu'on trouvera facilement 
cette sorte de papier chez les pharmaciens, surtout les pharmaciens 
anglais (demander du c Gloset-paper >). On prend parles deux bouts 
la bandelette de papier imbibée d'alcool, on la tend légèrement et on 
l'abaisse sur la coupe; la coupe y adhère et on l'enlève en faisant 
passer la bandelette horizontalement, ou en la levant légèrement, au 
delà du tranchant de la lame. On commence par poser la première 
coupe vers le bout du papier qu'on tient dans la main gauche ; les 
autres coupes trouvent leur place sur le papier en suivant de gauche 
à droite. Entre chaque coupe on pose la bandelette de papier, les 
coupes en haut, sur un fond humide préparé d'avance en mettant 



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248 CHAPITRE XVII 

dans une assiette du papier buvard, à plusieurs épaisseurs, couvert 
d'une feuille du même papier-closet, le tout étant saturé d*alcool. 
Lorsqu'on a ainsi aligné sur du papier-closet toutes les coupes qu'on 
désire monter, on passe à la deuxième manipulation, qui est le col- 
lodionnage de la série. 

Cela se fait en deux étapes. La première consiste à poser la série 
sur une plaque de verre collodionné. A cet effet, on a préparé 
d'avance des plaques de verre en versant dessus du collodion qu'on 
laisse s'étaler en une couche unie, comme le font les photographes. 
On laisse sécher cette couche (les plaques ainsi préparées peuvent 
être gardées indéfiniment en provision). On prend une de ces plaques, 
de dimensions convenables (pour les petites séries, les porte-objets 
suffisent ; pour les grandes coupes, on se sert de plaques de dimen- 
sions correspondantes) ; on pose sur la surface collodionnée une des 
bandelettes de papier avec les coupes, les coupes en bas, et on la 
presse légèrement contre la plaque ; les coupes adhèrent à la surface 
collodionnée, et l'on peut maintenant avec un peu de précaution 
éloigner le papier sans les déranger. Il faut observer la précaution 
de ne pas coller plus d'une à deux lignes de coupes sur la même 
plaque de verre ; autrement les premières risqueraient de se dessé- 
cher pendant que l'on prépare les suivantes. S'il se trouve un excès 
d'alcool autour des coupes, on l'enlève avec du papier buvard. On 
passe ensuite à la deuxième phase du collodionnage. Elle consiste à 
verser sur les coupes du collodion qu'on laisse s'étaler en une couche 
unie et sécher superficiellement. Aussitôt que cette couche est sèche 
à la surface, on inscrit au coin de la plaque, avec un pinceau chargé 
de bleu de méthylène, les indications nécessaires, et l'on plonge la 
plaque ou bien dans la solution colorante, ou bien dans de l'alcool 
à 80 p. iOO. Dans le liquide, les denx couches de collodion ne tardent 
pas à se détacher du verre en emportant les coupes. Celles-ci gardent 
leurs positions relatives, fermement emprisonnées entre les deux 
feuilles de collodion. On les colore, on les lave, on déshydrate à la 
manière ordinaire, si ce n'est qu'on évite naturellement pour la 
déshydratation l'emploi d'un alcool d'un titre supérieur à 90 à 
96 p. 100. On éclaircit avec le mélange cité numéro 295, en prenant 
toutefois la précaution de laisser les séries soit dans l'alcool, soit dans 
l'éclaircissant plus longtemps qu'on n'y laisserait des coupes libres. 
On découpe les séries dans les longueurs voulues pendant qu'elles 
sont encore dans l'alcool ; on peut les poser à cet effet, pour plus de 
sûreté, sur une bandelette de papier-closet saturée d'alcool. On monte 
définitivement selon les procédés connus. 



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MÉTHODES POUR COLLER LES COUPES EN SÉRIES 249 

Les grands avantages de la très importante méthode que nous 
venons d'exposer se trouvent dans la sûreté des manipulations, ej{^ 
dans sa rapidité. Du moment que les coupes ont été alignées sur le 
papier, on traite la série entière presque comme une seule coupe. 

La modificalioD apportée à ce procédé par Wintersteiner (Zeit, f, vnss, 
Mik., X, 3, 1893, p. 316) consiste simplement à supprimer Talignement des 
coupes sur la bande de papier, et à les faire glisser directement du couteau 
sur la plaque de verre collodionnée. Je me permets de douter que ce soit un 
perfectionnement. 

334. Méthode d'OBREGiA {NeuroL Centrait,, 1890); nous citons 
d'après Gulland, dans Journ. of Paihology^ Feb. 1893; pour de 
plus amples détails voyez Mercier, Les coupes du système neigeux 
central^ 1894, 133). C'est une modifîcation assez commode de la 
méthode de Weigert. On fait un mélange de 

Solution sirupeuse de sucre candi pulvérisé, dans 

Teau distillée bouillante 30 ce. 

Alcool absolu 20 — 

Solution sirupeuse transparente de dextrine dans 
l'eau distillée 10 — 

On prépare les plaques de verre avec ce mélange comme on les 
prépare avec le collodion dans le procédé de Weigert, mais seulement 
deux ou trois jours avant de s'en servir. On les laisse sécher lente- 
ment jusqu'à ce que la surface ne colle plus que légèrement au 
doigt. On fait les coupes et on les cueille sur une bande de papier 
comme dans le procédé de Weigert, ou mieux sur du papier de soie 
satiné. Lorsque toute la série a été cueillie, on la couche sur la plaque 
préparée, on enlève le papier, et l'on inonde la plaque d'une solution 
de celloîdine (ou de photoxyline, 3 p. 100). On pose les plaques à plat, 
et on laisse évaporer. Aussitôt que la pellicule de collodion a acquis 
une certaine consistance, on la divise en rubans avec la pointe d'un 
couteau ; on peut alors mettre le tout de côté, la couche de sucre 
retenant assez d'humidité pour prévenir le dessèchement des coupes. 
Lorsqu'on désire achever la préparation on met le tout dans de l'eau, 
la pellicule de collodion se détache et on la traite comme dans la 
méthode de Weigert. 

Ce qui procède a trait aux coupes au collodion. Pour les coupes à 
la paraffine, les opérations sont simplifiées en ce qu'on supprime 
l'alignement sur la bande de papier. On pose les coupes directement 
sur la plaque préparée, on fait fondre la paraffine, on traite par un 



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250 CHAPITRE XVII 

dissolvant de la paraffine, puis par Talcool, et on couvre de la solu- 
tion de collûdioQ et Ton procède comme ci-dessus. 

L'avantage principal du procédé d'OfiREGU, c'est qu'il s'applique 
également bien aux coupes à la celloîdine, aux coupes de matériel 
qui n'a pas été enrobé du tout, et aux coupes à la paraffine, tandis 
qu*on ne peut pas bien employer la méthode de Weigert pour ces 
dernières. 



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CHAPITRE XVIII 



AGENTS ÉCLAIRCISSANTS 



335. — Nous entendons Ici par agents < éclaircissants > les liquides 
dont on se sert dans le but d'augmenter la transparence des prépa- 
rations microscopiques par voie optique. Ces liquides ont toujours 
un indice de réfraction qui approche de celui des éléments des tissus, 
et c'est en s'insinuant entre ces éléments qu'ils permettent aux rayons 
lumineux de poursuivre leur marche à travers les tissus sans subir 
ces variations brusifues de direction qui sont la cause de l'opacité des 
préparations imbibées d'un milieu dont la réfringence est très infé- 
rieure à celle des éléments de la préparation. C'est assez dire que tous 
les agents dont nous parlons sont des liquides fortement réfringents. 
En outre, on demande en général à un agent éclaircissant de remplir 
encore la fonction d'éloigner Talcool dont la préparation se trouve 
imbibée et de faciliter la pénétration de la résine qui sert à la conser- 
vation permanente de la préparation. Ces liquides doivent donc être 
de nature à se mêler librement à l'alcool, et être en même temps des 
dissolvants du baume de Canada ou d'un autre milieu résineux 
employé pour la conservation. La plupart de ces liquides se trouve- 
ront donc parmi les huiles essentielles. 

336. Manière d'employer les éclaircissants. — Nous avons 
déjà insisté à plusieurs reprises sur l'importance de la précaution qui 
consiste à éviter autant que possible de porter une préparation brus- 
quement dans un liquide beaucoup plus dense que celui où elle se 
trouve, par exemple, de l'alcool dans l'essence de cèdre. Nous avons 
AU numéro 6 expliqué le procédé qu'il convient d'employer pour 
rendre le passage d'un liquide à un autre aussi graduel que possible ; 



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252 



CHAPITRE XVllI 



il sera donc superflu d'y revenir. Ce procédé est celui qui con- 
vient pour tous les objets entiers. 

Pour les coupes, les déformations par osmose ne sont guère à 
craindre, et Ton peut convenablement les éclaircir en inondant 
simplement le porte-objets de quelques gouttes d'essence qu'on fait 
aller et venir sur le verre. 

On peut activer la pénétration des éclaircissants en les employant 
à chaud. 

Il arrive quelquefois que l'essence se trouble pendant l'opération 
de l'éclaircissement. Gela est dû à une combinaison entre l'huile essen- 
tielle et l'humidité de l'air (plutôt que celle des tissus). On peut en 
général chasser Topacité ainsi causée en chaufl'ant(HATCHETT Jackson, 
ZooL Anz., 1889, p. 630). J'ai trouvé que ce remède ne suffit pas 
toujours, car dans certains états de l'air l'opacité persiste, nonobs- 
tant des chauffages répétés. C'est pour cela que je conseille d'opérer 
toujours les éclaircissements autant que possible dans un récipient 
clos. 

337. Choix d'un éclaircissant. — Cela dépend naturellement 
du but que l'on se propose. Nous pensons toutefois que les éclaircis- 
sants suivants doivent se trouver sur la table de travail : essence de 
cèdre, comme éclaircissant normal pour les préparations à monter 
au baume, et comme milieu normal pour les dissections fines; essence 
de girofle, pour les dissections fmesdans lesquelles on désire profiler 
de la propriété qu'a cette essence de former des gouttes très convexes, 
ne s'étalant pas facilement sur le verre, ou de sa propriété de rendre 
(^s tissus fragiles ; essence de bergamote^ liquide très mobile, excel- 
lent éclaircissant, se mêlant parfaitement à Talcool à 90 p. 100; acide 
phénique, pour les préparations qui n'ont été qu'imparfaitement dés- 
hydratées. 

Les éclaircissants spéciaux de la celloidiiie ont été indiqués au 
numéro 295. 

338. Classification des éclaircissants. — D'après les re- 
cherches détaillées de Stieda, les huiles essentielles peuvent être 
classées dans les deux groupes suivants, selon la rapidité plus ou 
moins grande avec laquelle elles effectuent l'éclaircissement des 
coupes : 



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Qoo^^ 



i 



AGENTS ÉGLAIRCISSANTS 



253 



A. Groupe dont Tessence de 
térébenthine est le type. Ces 

essences ëclaircissenl sans trop de 
peine des coupes parfaitement dés- 
hydratées, mais n'éclaircissent pas 
du tout ou seulement après plusieurs 
heures des coupes qui ne le sont peu. 

Essence de térébenthine, 

— d'absinthe, 

— de baume de Copahu, 

— d'écorces d'orange, 

— de cubèbe, 

— de fenouil, 

— de fleurs de millefeuille, 

— de sassafras, 

— de genévrier, 

— de menthe crépue, 

— d'origan, 

— de lavande, 

— de cumin, 

— decajeput, 

— d'écorce de cascarille, 

— de sabinc, 

— de citron. 



B. Groupe dont ressenoe de 
girofle est le type. Ces essences 
éclaircissent avec une très grande 
rapidité les coupes bien déshydra- 
tées, et un peu plus lentement et 
avec un peu de ratatinement celles 
qui ne le sont pas. 

Essence de girofle, 

— de Gaultheria, 

— de cassia, 

— de cannelle, 

— d'anis étoile, 

— de bergamote, 

— de cardamome, 

— de coriandre, 

— de carvi, 

— de romarin. 



Nous avons à ajouter au groupe des bons éclaircissants TesseDce 
de bois de cèdre, Tessence de bois de santal, l'acide phénique et la 
créosote. 

Neelsen et ScuiEFFERDECKER [Arck. f. Anal. u. Phys.y 1882, p. 206) 
ont examiné une série d'essences dans le but d'en trouver qui réunis- 
sent les bonnes qualités d'éclaircir rapidement des coupes sorties de 
Talcool à 95 p. 100, de ne pas attaquer les teintures d'aniline, et 
d'éclaircir le collodion sans le dissoudre. Ils ont examiné les pro- 
priétés des essences suivantes : anis, ambre, goudron de bouleau, 
cajeput, Acoj'us calamus, Cassia, bois de cèdre, citron, aneth, thym, 
pin, menthe, cumin, niobe, origan, Palmarosa, Mentha piperata, 
Mentha pulegium, romarin, sassafras, nard, thuya, bois de Santal, 
carvi. De toutes ces essences, trois seulement remplissent ces condi- 
tions : ce sont l'essence de bois de cèdre, l'essence d'origan, l'essence 
de bois de santal. 

U est un autre point de vue d'après lequel nous voudrions pouvoir 
donner une classification détaillée des éclaircissants, c'est celui de 
leurs indices de réfraction. Malheureusement les données nous 
manquent pour cela. Nous pouvons seulement donner quelques indi- 
cations vagues sur les indices de quelques-uns des plus importants de 



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^u 



CHAPITRE XVIII 



ces liquides. L'essence de cèdre a approximativement le même indice 
de réfraction que le crown-glass, qui est égal à celui du baume de 
Canada ; l'essence de cèdre éclaircit donc les objets au même degré 
que le baume. L'essence de girofle a un indice notablement plus élevé, 
il éclaircit donc plus que le baume. L'essence de térébenthine, Tes- 
sence de bergamote et la créosote ont des indices inférieurs à celui 
du baume; en conséquence elles éclaircissent beaucoup moins que les 
autres liquides que nous avons nommés. 

339. Essence de bois de cèdre (Neelsen et ScmEFFERDEc- 
KKR, L c). — Cette essence se trouve dans le commerce (Gehe und 
C"", Dresden ; Scuimmel u. Gomp., Leipzig ; et chez les fournisseurs de 
reaclifs histologiques, Grubler, et autres). Le prix en varie de 18 à 
2t> fr. le kilo, c'est donc environ le même prix que l'essence de girofle 
Gniljler livre par petites quantités à raison de 25 centimes par 
10 grammes). Elle doit être d'un jaune clair, ou, ce qui est mieux, 
d'un vert d'huile d'olive fraîche. Elle se mêle facilement au baume de 
Canada et à l'huile de ricin. Elle s'évapore avec une extrême lenteur. 
Elle éclaircit facilement des tissus sortis de l'alcool à 95 p, 100 ; les 
coupes au collodion demandent cinq à six heures pour être éclaircies. 
Elle n'attaque pas les teintures aux couleurs d'aniline. 

Cette essence est très pénétrante, et, comme elle se mêle facile- 
ment à la paraffine, elle constitue, ainsi que nous l'avons fait obser- 
ver ailleurs, l'un des meilleurs liquides sinon le meilleur, pour pré- 
parer les objets pour rinclicsion à la paraffine. D'après notre expé- 
rience, elle est de tous les éclaircissants /e moins nuisible aiuv tissus; 
aussi sommes^nous maintenant entièrement de l'avis de Neelsen et de 
Schieflerdecker, qui estiment qu'elle est en général le meilleur de 
tous les éclaircissants. 

Noos devons ajouter qu'il est important qu'elle soit d'une bonne 
qualité, et surtout nous devons mettre en garde contre les espèces 
incolores; nous en avons examiné une qui en plusieurs jours, ne péné- 
trait absolument pas des objets parfaitement déshydratés que nous 
avions soumis à son action. 

Je rae sers toujours pour ma part d'une essence épaissie, telle qu'on 
l'emploie pour les objectifs à immersion. 

340. Essence de girofle. — On sait qu'il existe dans le commerce 
des espèces d'essence de girofle plus ou moins foncées de couleur, et 
les auteurs recommandent de n'employer que les espèces les plus 
claires. Nous donnerons quelques explications à ce sujet. Sans doute 



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AGENTS ÉCLÂIRGISSANTS 235 

il y a avantage à ce qu'une bonne essence soit aussi peu colorée que 
possible, mais cette condition n'est pas facile à réaliser avec Tessence 
de girofle. Cette essence jaunit et brunit très facilement avec Tâge ; 
de sorte qu'en faisant choix d'un échantillon très clair, on risque fort 
de tomber sur un produit falsiflé : ce qui arrive fréquemment. 
Nous conseillons au lecteur d'expérimenter avec des échantillons 
de diverses provenances, et de s'en tenir à celui qui lui donne les 
meilleurs résultats. 

L'essence de girofle possède deux propriétés qu'il est important de 
connaître. Déposée sur une lame de verre, elle ne s'étale pas facile- 
ment, mais forme une goutte très convexe, propriété qui est souvent 
précieuse pour les dissections flnes. Une autre propriété importante, 
c'est celle de rendre les tissus extrêmement cassants, propriété qu'on 
peut également mettre à profit pour les dissections. Si l'on désire 
amoindrir ces effets, on peut combiner l'essence de girofle avec de 
l'essence de bergamote. 

L'essence fraîche dissout les couleurs d'aniline plus rapidement que 
la vieille. 

L'essence de girofle a un indice de réfraction très élevé , elle éclair- 
cit les objets plus que le baume. Elle dissout le collodion, ce qui fait 
qu'elle ne convient pas pour éclaircir les coupes d'objets inclus dans 
cette masse. 

Cette essence conserve bien les éléments des tissus soumis à son 
action, et nous estimons que, somme toute, elle est, après l'essence 
de bois de cèdre, le meilleur éclaircissant pour le travail ordinaire. 

341. Essence de cannelle. — Elle ressemble beaucoup à Tessence de 
girofle, mais est, en général, moins épaisse. D'après notre expérience, c'est 
un excellent éclaircissant et nous le recommandons particulièrement. 

342. Essence de bergamote (Schiefferdecker, Arch. f. Anal, 
u. Phys,y 1882, p. 206). — L'essence de bergamote éclaircit rapide- 
ment les objets sortis de l'alcool à 98 p. 100, elle éclaircit bien le col- 
lodion sans le dissoudre, et n'attaq^ie pas les teintures arix couleurs 
<f aniline. D'après notre expérience, cette essence conserve moins bien 
les cellules que les essences précédentes ; nous savons cependant que 
quelques anatomistes sont de l'avis de Schiefl'erdecker, qui trouve 
qu'elle les conserve mieux. 

C'est, croyons-nous, la moins réfringente de toutes les essences 
usuelles. 

SucHANNEK {Zeit. f. wis. Mik., VII, 2, 1890, p. 158) dit que l'es- 
sence blanchie, incolore, n'éclaircit pas bien les préparations impar- 



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^wi^r 



256 CHAPITRE XVni 

faitement déshydratées ; tandis qu'une essence Terte peut absorber jus- 
qu'à iO p. iOO d'eau. 

Van der Stricht {Arch. de Biol.^ XII, 1892, p. 741) dit que Tes- 
sence de bergamote dissout à la longue les granulations graisseuses 
de certains œufs. 

843. Essence d^origan (Neeisen et Schiefferdecker, ibid.). — 
Ces auteurs ont recommandé cette essence comme ayant les mêmes 
propriétés que l'essence de bergamote, c'çst-à-dire qu'ils ont trouvé 
qu*elle éclaircit les coupes au collodion sans dissoudre le collodion. 
Toutes les fois que nous l'avons vu employer pour cet objet, il est 
arrivé ou bien que les coupes ne s'éclaircissaîent pas, ou bien que le 
collodion était attaqué. Des teintures à l'aniline sont plus ou moins 
attaquées par cette essence. 

Sqlire (Methods and Formulas^ p. 81) dit que l'essence d'origan 
du commerce n'est pas autre chose que l'essence blanche de thym 
plus ou moins falsifiée ; et que le produit vendu sous le nom de 
01. Origani Cretici n'est vraisemblablement que l'essence de marjo- 
laine. Voyez ce que nous avons dit au sujet de l'éclaircissement de la 
celloïdine par les essences d'origan et de thym au numéro 295 ; à 
consulter aussi van Gieso.^ [Zeit, f, wiss. Mik., IV, 4, 1887, p. 482). 
L'action de ces essences sur la celloïdine parait être assez incons- 
tante. 

344. Essence de bois de santal (Id., ibid,). — Essence un peu 
épaisse, de couleur pâle, s'évaporant peu et ne changeant pas à la lumière. 
Elle éclaircit rapidement les objets sortis de Talcool à 95 p. 100 et un peu 
plus lentement des coupes au collodion ; elle n'attaque pas les teintures aux 
couleurs d'aniline. Les auteurs que nous citons trouvent qu'elle est un 
éclaircissant des plus utiles. Elle est malheureusement d'un prix un peu 
élevé : elle coûte plus de 60 francs le kilo. 

345. Essence de térébenthine. — Cette essence très communément 
employée est, à notre avis, le plus mauvais des éclaircissants, car elle 
altère à un plus haut degré qu'aucun autre les structures délicates. Ce 
défaut se trouve amoindri par l'emploi d'une térébenthine épaissie qu'on 
obtient facilement en exposant de l'essence de térébenthine en couches 
minces pendant quelques jours à l'air. On verse de l'essence dans une 
assiette qu'on couvre légèrement, de manière à exclure la poussière, et on 
laisse le tout jusqu'à ce que l'essence ait acqujs une consistance sirupeuse. 

L'essence de térébenthine a un indice de réfraction relativement très peu 
élevé ; elle éclaircit beaucoup moins que le baume. 

S46. Acide phénique et créosote. — On peut employer l'un ou 
l'autre de ces réactifs, qui ont une action très semblable. 11 est bon de les 



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AGENTS ÉGLAIRGISSANTS 257 

prendre aussi concentrés que possible. Ils éclaircissent les objets sortis de 
Talcool très rapidement. Il n'est pas nécessaire de prendre les objets bien 
déshydratés, car ces réactifs suffisent à éclaircir, quoique plus lentement^ 
des objets imbibés d'eau. Les éléments sont bien conservés. Nous estimons 
que Tacide phénique est peut-être le meilleur des éclaircissants pour des 
objets qui ne sont pas destinés à être montés dans le baume ; malheureu- 
sement il y a toujours danger de voir les objets éclaircis dans Tun ou l'autre 
de ces réactifs se ratatiner sérieusement lorsqu'on les met dans le baume. 

347. Mélange de Gage [Joum.Roy, Mie. 5oc.,1891, p. 418). — Acide 
phénique cristallisé, fondu, 40 ce. ; essence de térébenthine, 60 ce. 

348. Xylol, benzol, toluol, naphte, chloroforme. — Quoique 
ces liquides soient d'un maniement peu commode, à cause de leur 
grande volatilité, ils peuvent rendre des services pour éclaircir des 
coupes au collodion. Ils servent communément pour séparer la masse 
et éclaircir en même temps les coupes à la paraffine. Des trois pre- 
miers, c'est le benzol qui est le plus volatil, puis vient le toluol, et 
c'est le xylol qui est le moins volatil, les rapports étant comme 4:5:9 
(SouiRE, Methods, p. 80). Le naphte est excellent pour enlever la 
paraffine de coupes destinées à être colorées; mais je conseille de ne 
pas l'employer pour des coupes à monter directement dans le bauma, 
vu qu'il précipite quelquefois le baume. — Voyez aussi au numéro 319, 

349. Huile d'aniline. — Cette substance est un agent éclaircissant 
d'une certaine importance à cause de la facilité avec laquelle elle pénètre 
des préparations très mal déshydratées. L'aniline ordinaire éclaircit facile- 
ment des coupes sorties de l'alcool à 70 p. 100 ; et avec de certaines précau- 
tions on peut obtenir l'éclaircissement de préparations aqueuses sans 
aucune intervention d'un alcool quelconque. On l'a employée à la place à la 
fois d'alcool et d'essence pour préparer des tissus pour le bain de paraffine. 
Pour la manière de procédera cette opération, qui sera d'ailleurs fort rare- 
ment indiquée, ainsi que pour la manière de préparer une aniline abso- 
lument anhydre, voyez Suchannek, ZeiL /". wiss. Mik.y VII, 2, 1890, 
p. 156. 

Pour l'emploi de l'aniline comme éclaircissant de coupes au collodion, 
voyez au numéro 295. 



AKAT. U1CR08C. 



17 



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CHAPITRE XIX 



LIQUIDES ADDITIONNELS ET CONSERVATEURS 



3B0. — Nous donnons dans ce chapitre la composition des divers liquid es 
employés soit pour Texamen temporaire des préparations, soit pour leur 
conservation définitive. Nous commencerons par les milieux aqueux et peu 
réfringents, nous passerons aux liquides alcooliques et glycériques, qui 
contiennent moins d'eau et sont plus fortement réfringents, et nous fini- 
rons par le groupe des milieux encore plus réfringents et parfaitement 
anhydres représenté par les huiles essentielles et les résines. 

351. Eau distillée. — Pour prévenir le développement de 
microbes, il est bon d*y tenir un morceau de thymol ou de camphre. 

L'eau peut être quelquefois employée avec avantage pour Texamen 
de structures délicates qui ont été préalablement bien flxées par 
Tacide osmique ou chromique, ou Tun des sels des métaux lourds ; 
par suite de la faiblesse de son indice de réfraction, elle sert parfois 
mieux qu'aucun autre milieu à rendre visibles des détails de struc- 
ture très fins. Mais il importe de se rappeler qu'il ne faut pas traiter 
par Teau des structures délicates, à moins qu'elles n'aient été fixées 
comme nous l'avons dit, car elle gonfle et déforme très rapidement la 
plupart des éléments cellulaires. 

352. Théorie des liquides indifférents. — Bien des solutions 
ont été imaginées dans le but de donner à l'eau une densité qui 
approche de celle des liquides des tissus, et par ce moyen d'éviter les 
violentes osmoses auxquelles est due Taclion nuisible de l'eau pure. 
La solution normale de sel en est une. Mais l'addition de sel ne sert 
qu'en partie à écarter cet inconvénient. Il reste toujours une circons- 
tance qui peut provoquer l'endosmose, c'est la différence de compo- 
sition des liquidée de3 tissus et de la solution simplement saline. La 



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LIQUIDES ADDITIONNELS ET CONSERVATEURS 



259 



substance des cellules est, en eiîet, un mélange de substances 
c colloïdes > et de substances < cristalloïdes » (Graham), tandis que la 
solution saline ne contient qu'un cristalloïde. Par suite de sa dilTusi- 
bilité puissante, ce cristalloïde passe rapidement par endosmose pour 
rejoindre les colloïdes des cellules. Pour réduire au minimum les 
phénomènes osmotiques, il faut que le liquide additionnel contienne 
la proportion voulue de sel de cuisine ou d'un autre cristalloïde, et en 
outre la proportion voulue de substance colloïde. On peut y ajouter, 
par exemple, du blanc d'œuf, ce qui permettra d'atteindre le but. On 
trouvera, en effet, que tous les milieux qui se montrent excellents au 
point de vue de la bonne conservation des tissus frais renferment et 
des cristalloïdes et des colloïdes. Ainsi, Thumeur vitrée contient envi- 
ron 7,8 parties de cristalloïdes (chlorure de sodium), pour 4,6 de 
matières colloïdes et 987 d'eau. Dans 100 parties de liquide amnio- 
tique se trouvent environ 3,8 parties de matières colloïdes (albumine), 
5,8 de sel, et 3,4 d'urée. Dans le sérum du sang on trouve 8,5 parties» 
de substances colloïdes pour 1 de substance cristalloïde (Frey). 

353. Sérum. Sérum iodé. — Ce réactif fut introduit dans la 
technifc|ue histologique par Max Schultze {Virchow's Archiv., 1864, 
p. 268). Nous empruntons les instructions suivantes à Ranvier {Traité^ 
p. 76). Il n'y a que le sérum fabriqué avec l'eau de l'amnios des 
mammifères qui présente des avantages sérieux. Pour se procurer 
de l'eau de l'amnios, on va dans un abattoir de Paris demander des 
gosselins de veau ou de mouton (c'est le nom sous lequel est connu 
l'utérus gravide). Une incision comprenant la paroi utérine et les 
membranes donne issue à un jet de sérum que l'on recueille dans un 
flacon muni d'un entonnoir. Ge liquide doit être parfaitement limpide 
et d'un jaune citrin. On ajoute dans le flacon des paillettes d'iode. 11 
faut agiter tous les jours le mélange, ou retourner le flacon, pour 
que l'iode se mélange à toute la masse, autrement il ne se trouverait 
de l'iode qu'au fond du flacon, et à la partie supérieure se formeraient 
des vibrions et des bactéries. 

Le meilleur procédé pour avoir un bon sérum consiste à le prépa- 
rer dans un flacon qui ne soit pas trop grand ou qui soit très plat, de 
manière que le niveau du liquide ne dépasse pas 2 à 3 centimètres, 
et de telle façon qu'il ne puisse pas y avoir une couche considérable 
de sérum au-dessus de la couche plus fortement iodée du fond. 

On peut aussi employer un autre procédé. Le sérum est mélange 
avec une forte proportion de teinture d'iode ; il se forme un précipité 
d'iode ; on Qltre et l'on a une solution fortement iodée. On verse tous 



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260 CHAPITRE XIX 

les deux ou trois jours un peu de cette solution fortement iodée dans 
le sérum ordinaire qui est ainsi préservé de la putréfaction. Il est à 
remarquer qu'au début Tiode se dissout très lentement dans le 
sérum : mais si Ton continue son action, une partie de cet iode ne 
tarde pas (au bout de quinze jours à trois semaines) à se transformer 
en iodures ; ces iodures contribuent alors à dissoudre une nouvelle 
quantité d*iode, et par suite on peut avoir au bout d'un à deux mois 
un sérum très fortement iodé. C'est ce sérum très fortement iodé et 
présentant une couleur brun foncé qui est le meilleur liquide pour 
ioder un sérum frais. 

354. Sérum artificiel de Kronecker (nous ne savons où cette for- 
mule a été publiée; nous citons d'après Vogt et Yung ; Traité d'Anal, 
comp.prat.f p. 473). 

Sel marin 6 grammes. 

Soude caustique gr. 06 

Eau distillée 1000 grammes. 

365. Sérum artiûoiel (Frey, Le Microscope, p. i3i). 

Blanc d'oeuf 30 grammes. 

Chlorure de sodium gr. 4 

Eau 270 grammes. 

Iode, q. s. pour conserver le mélange. 

D'après Ranvier {Traité, p. 77), c'est 1,5 gramme de teinture d'iode qu'il 
convient d'ajouter. 

356. Sérum glycériquede Migula, voyez Zeit.f. wiss, MA., VII, 2, 
1890, p. 172, ou Joum. Boy. Mie. Soc, 1890, p. 804. 

357. Humeur aqueuse. Blanc d'œuf. — Ces simples liquides 
additionnels ne demandent pas d'autre préparation que d'être filtrés. 
On peut les ioder si on le désire. L'addition d'un morceau de camphre 
(Frey) suffira pour conserver le blanc d'œuf pendant un certain temps. 

358. Solution physiologricEue de sel. Solution saline nor- 
male. — On fait dissoudre 0,78 p. 100 de chlorure de sodium dans 
l'eau distillée. On peut souvent ajouter avec avantage une trace 
d'acide osmique (Carnoy). 

359. Sirop simple. — C'est un milieu très utile pour l'étude de bien 
d es tissus à l'état frais. Une bonne formule consiste en des parties égales 
d'eau et de sucre blanc. 

360. S^op an chloral. — Le sirop simple a l'inconvénient de se laisser 



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LIQUIDES ADDITIONNELS ET CONSERVATEURS 261 

envahir très facilement par des moisissures. Une bonne manière de parer 
à cet inconvénient est de dissoudre du chloral dans le sirop. Il sufôt de 
1 p. 100 de chloral. Mais on peut employer des doses beaucoup plus fortes ; 
nous avons employé jusqu'à 7 p. 100 sans inconvénient. 

361. Sirop phéniqaé. — 1 p. 100 d'acide phénique dans du sirop 
simple. Nous recommandons le sirop phénique Déclat (Ghassaing, avenue 
Victoria, 6, à Paris, ou chez les pharmaciens). — Ce sirop a l'avantage de 
rester toujours par faitement incolore, 

t36Z. Acétate d'alumine {Solution de Gaxmal); (Beale). 

Acétate d'alumine 1 partie. 

Eau 10 — 

363. Acétate de pctassiom (Max Schultze, Arch. /*. tnik. Anal., 
1872, p. 180). — Solution concentrée dans Teau. On en ajoute une goutte 
au bord du verre à couvrir sous lequel se trouve l'objet, imbibé d'eau 
Après vingt-quatre heures on peut procéder à la fermeture de la prépara 
tion. Ge liquide a un inliice de réfraction inférieur à celui de la glycérine. 
On croit qu'il a pour effet de prévenir le noircissement des objets qui ont 
été traités par l'osmium ; mais nous ignorons jusqu'à quel point il possède 
en réalité cette propriété. 

364. Hydrate de chloral. — Solution à 5 p. 100 dans l'eau 
(Lavdowsky, Arch. f. miL Anat., 1876, p. 359) ; 

Ou 2,5 p. 100 dans l'eau (Brady, Brxstish Copepods) ; 

Ou 1 p. 100 dans l'eau (Munson, Journ. Roy. Mie. Soc, 1881, p. 847). 



LIQUIDES MERCURIQUES 

365. Liqueurs de Pacini {Journ. de Micrographie, 1880, p. 138). — 
Pacini fait observer que le bichlorure de mercure coagule et précipite les 
matières albuminoïdes des liquides des tissus, et que pour cette raison il 
convient de lui associer pour certaines préparations de l'acide acétique, et 
pour d'autres du chlorure de sodium. C'est d'après ce princiqe qu'ont été 
imaginées les liqueurs classiques de Pacini. On ne les emploie guère 
aujourd'hui pour le montage de préparations microscopiques, mais ils 
peuvent encore rendre des services pour la conservation des pièces anato- 
miques. Voici la composition des six liqueurs de Pacini ": 

N** 1. — 0,5 p. 100 sublimé corrosir dans Teau. 

Pacini ne se servait de cette solution que dans les cas où il désirait éloi- 
gner le sel ou l'acide de tissus qui avaient séjourné dans l'une des autres 
liqueurs. 

N» 2. — Sublimé 1 partie. 

Sel de cuisine 2 — 

Eau 200 — 



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262 CHAPITRE XIX 

D'un emploi général, mais sert spécialement pour les corpuscules san- 
guins des animaux à sang froid, pour le sperme, les épithéliums, les nerfs 
et les libres musculaires. Cette liqueur sert aussi à fixer les Infusoires. 

K« 3. — Sublimé 1 partie. 

Sel de cuisine 4 — 

Eau 200 — 

Pour les corpuscules sanguins des animaux à sang chaud. 

N" 4. — Sublimé 1 partie. 

Acide acétique . . 2 — 

Eau 300 — 

C'est la meilleure de ces liqueurs sous le rapport de la conservation des 
noyaux, mais elle produit des gonflements dans les corps cellulaires et dans 
les fibres. 

N<> 5. — (Nous citons cette formule et la suivante d'après Frey, le Micros- 
cope, p. 233.) 

N* 5. — Sublimé 1 partie. 

Sel de cuisine 2 — 

Glycérine (de 25* Baume) 13 — 

Eau 113 — 

Il faut mélanger et laisser reposer pendant au moins deux mois. Après 
ce temps on ajoute 3 volumes d'eau et Ton filtre. Cette liqueur conserve 
bien tous les tissus délicats. 

N* 6. — Sublimé 1 partie. 

Acide acétique 2 — 

Glycérine (25' Baume) . 43 — 

Eau 115 — 

S'emploie pour les mêmes objets que la précédente. Elle ne conserve pas 
les corpuscules rouges du sang. 

366. Modifications des liqueurs de Pacini. — Les formules sui- 
vantes sont citées par Frey (d'après Cornil) comme étant employées dans 
l'Institut Pathologique de l'Université de Berlin : 

N» 1. — Sublimé 1 partie. 

Sel de cuisine 2 — 

Eau 100 — 

Pour les tissus riches en vaisseaux des animaux à sang chaud. 

N* 2. — Sublimé 1 partie. 

Sel de cuisine 2 -- 

Eau 200 — 

Pour les mêmes tissus des animaux à sang froid. 

N» 3. — Sublimé 1 partie. 

Sel de cuisine 2 — 

Eau 300 — 

Pour les globules du pus et éléments semblables. 



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LIQUIDES ADDITIONNELS ET CONSERVATEURS 263 

No 4. — Sublimé 1 partie. 

Eau 300 — 

Pour les corpuscules du sang. 

N* 5. — Sublimé 1 partie. 

Acide acétique 1 — 

Eau 300 — 

Pour les épithéliums et le tissu conjonctif ; et pour les globules du pus, 
lorsqu'on désire en démontrer les noyaux. 

N» 6. — Sublimé 1 partie. 

Acide acétique 3 — 

Eau 300 - 

Pour les ligaments, muscles et nerfs. 

N« 7. — Sublimé 1 partie. 

Acide acétique 5 — 

Eau 300 — 

Pour les tissus glandulaires. 

N* 8. — Sublimé 1 partie. 

Acide phosphorique 1 — 

Eau 30 (sic; nous pen- 
sons qu*il faut lire 300). 

Pour les tissus cartilagineux. 

367. Liqueurs de Goadby (Mie, Dict,, art. Préservation), — Personne 
ne se sert plus de ces liquides, et j'en supprime les formules à bon escient. 
La Liqueur d'O'wen (Vogt et Yung, Traité cTAnat. comp, pratique, 
p. 19) est dans le même cas. 

368. Liqueur de Gilson (Carnoy, Biologie cellulaire, p. 94). 

Sublimé gr. 15 

Acide acétique (à 15 p. 100 acélique crislalli- 

sable) 2 ce. 

Glycérine 30 gr. 

Alcool à 60O 60 — 

Eau 30 — 

Nous avons placé ici cette formule à cause du bichlorure de mer- 
cure qu'elle renferme ; mais nous rappelons que, par suite de la pro- 
portion assez considérable de glycérine et d'alcool qu'elle contient 
cette liqueur possède une puissance de déshydratation assez marquée 
et qu'elle ne doit être employée qu'avec des préparations soigneuse- 
m ent fixées. C'est un des meilleurs liquides pour l'étude du noyau et 
du protoplasma en général ; son indice de réfraction est suffisamment 



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264 CHAPITRE XIX 

élevé pour éclaircir au degré convenable les cellules à protoplasma 
sombre et granuleux ou chargé de corps étrangers. 

369. Blanc d'œaf et sablimé (Gage, Notes on hist, methods^ Ilhaca^ 
1885-86 ; Zeit. f. wiss. Mik., 1886, p. 223). 

Blanc d*œiif 15 ce. 

Eau . 200 ce. 

Sublime gr. 5 

Sel de cuisine 4 gr^ 

Mêlez, agitez, filtrez, et conservez au frais. Gage recommande beaucoup 
ce mélange pour l'étude des corpuscules rouges du sang et des cellules 
ciliées. 

AUTRES LIQUIDES 

376. Liqueur de Ripart et Petit {Brebissonia, 1880, p. 92 ; Gar- 
NOY, Biologie cellulaire, p. 9S). 

Chlorure de cuivre gr. 30 

Acétate de cuivre — 30 

Acide acétique cristallisé . . 1 — 

Eau camphrée (pas saturée) 75 — 

Eau distillée 75 — 

Garnoy trouve {loc. cit.., p. Iî27) que ce liquide est en général le 
meilleur de tous pour la conservation des structures du noyau et du 
protoplasma. Il conserve parfaitement toutes les colorations ordi- 
naires, et même pendant longtemps celle du vert du méthyle. 

371. Tanin (Carnoy, loc. et/.). 

Tanin en poudre gr. 5 

Eau 100 — 

372. Picro-carmin. — La solution de picro-carmin a été recomman- 
dée par Ranvier comme liquide additonnel pour les objets frais, dans la 
pensée qu'elle possède une action fixatrice suffisante pour conserver les 
formes des cellules. Carnoy trouve que des cellules y vivent souvent assez 
longtemps pour s'y gorger d'eau et s'y détériorer. 

373. Vert de méthyle. — Carnoy recommande beaucoup la so- 
lution un peu concentrée de vert de méthyle comme liquide addi- 
tionnel pour les tissus frais. En solution un peu forte, le vert de , 
méthyle est un fixateur délicat, et conserve parfaitement pendant 
longtemps les structures cellulaires les plus délicates. On peut souvent 
lui ajouter avec avantage une trace d'acide osmique et un peu d'acide 
acétique. 



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LIQUIDE ADDITIONNELS ET CONSERVATEURS 265 

Nous ne saurions trop insister sur Timportance de ce réactif dans 
les recherches délicates. 

374. Liqueur de Wlckersheimer . (Voyez ZooZ. Anzeig,, 1879, p. 670.) 
— Ce liquide parait être parfaitement iautile en histologie. 

375. Liqueurs au « vinaigre sallcyllque > (Meyer, Arch. f. 
mik. i4na^,4876, p. 868). — On appelle « vinaigre salicylique > une 
solution de 1 partie d*acide salicylique dans 100 parties d'acide pyro- 
ligneux (d'une densité de 1,04 ; il doit être d'un jaune pâle). Avec cette 
solution, Meyer compose les deux liqueurs suivantes : 

N<> 1. — Vinaigre salicylique 1 volume. 

Glycérine allongée de 2 volumes d'eau. . . 10 

S'emploie pour des Hydres, des Nématodes, certaines larves, et 
autres petits organismes. 

N^ 2. — Vinaigre salicylique 1 volume. 

Glycérine allongée de 4 volumes d'eau. . . 10 — 

S'emploie pour les Infusoires. 

Toutes les observations que nous avons rencontrées dans la litté- 
rature histologique au sujet de ces liqueurs portent qu'elles sont 
vraiment excellentes. 

376. Vinaigre sallcyllque & la gomme (Noll, Zool, Anzeig., 
1883, p. 472). 

Liqueur de Meyer (n^ 2) 1 volume. 

Liqueur de Farrant (n<> 358) 1 — 

Ce mélange ne se trouble jamais et ne se dessèche pas. Il réussit 
admirablement pour les Crustacés délicats et leurs larves ; les objets 
ne s^'y ratatinent pas, et n'y deviennent pas trop transparents. II 
réussit également bien pour des préparations durcies et colorées de 
Polypes, de petites Méduses et d'autres Cœlentérés. 

377. Médium de Deane. (Voyez Mie. DicL, art. Préservation.) — 
Ce médium nous parait superflu. 

378. Gomme arabique au chloral (Hoyer, Biol. CentralbL, 
4882, p. 23). — On prend un flacon à large goulot, de 60 centimètres 
cubes de contenance environ. On le remplit aux deux tiers de gomme 



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266 CHAPITRE XIX 

arabique en fragments (pas en poudre). On achève de le remplir avec 
une solution (de plusieurs centièmes) d'hydrate de chloral dans Teau 
à laquelle on ajoute 8 à 10 p. 100 de glycérine. Après quelques jours 
on obtient une solution sirupeuse que Ton Qltre à travers du papier 
de laine. La filtration est lente, mais peut être achevée en vingt-quatre 
heures. 

Ce liquide a l'avantage de sécher suffisamment sous le verre à 
couvrir pour qu'il ne soit pas nécessaire de luter les préparations. 
11 sert pour les tissus colorés par le carmin ou Tl^ématoxyline. Les 
éléments s*y conservent bien, et sont moins éclaircis que dans le 
baume. Si après quelque temps la solution se trouble, il faut la 
filtrer et ajouter un peu de chloral. 

379. Gomme arabique & l'acétate de potasse (Hoyer, ibid.). 
— Ce médium se prépare de la même manière que le précédent, sauf 
qu'à la place de la solution de chloral glycérînée on emploie la solu- 
tion officinale d'acétate de potasse ou d'ammoniaque. 11 sert plus 
spécialement pour les préparations colorées aux teintures d'ani- 
line. 

380. Gk>mme glycérînée (Médium de Farrant : Beale, How io 
work, etc., p. 88). 

Gomme arabique 2 parties. 

Glycérine i — 

Eau 2 — 

 conserver dans un flacon bouché à l'émeri et contenant un 
morceau de camphre. 

D'après Frey, ce médium serait composé de parties égales de 
gomme, de glycérine et de solution saturée d'acide arsénieux dans 
l'eau. 

D'après le Micrographie Dictionary, il se compose de parties 
égales de gomme arabique, de glycérine et de solution d'acide arsé- 
nieux à 0,37 p. 100 dans l'eau. On doit faire dissoudre d'abord la 
gomme dans la solution arsénieuse, et puis ajouter la glycérine avec 
p récaution, pour éviter la formation de bulles d'air. 

381. Gomme glycérînée (Langerhans, Zool Anzeig.y 1879, 

p. 578). 

Gomme arabique 5 parties. 

Eau 5 — 



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LIQUIDES ADDITIONNELS ET CONSERVATEURS 267 

On mêle, et après vingt^quatre heures on ajoute : 

Glycérine 5 parlies. 

Solution aqueuse d'acide phénique à 5 p. 100. iO — 

Pour conserver de petits organismes dansée médium, on en ajoute 
une goutte au bord de la lamelle sous laquelle ils se trouvent ; le 
lendemain on en ajoute encore la quantité nécessaire pour compenser 
la perte par évaporation, et on lute la préparation. Il y a peu de 
ratatinement, et la plupart des couleurs naturelles des organismes 
marins se conservent bien, 

382. Le Mélange d'Ap&thy que nous avons donné au numéro 186 
est recommandé par cet observateur comme un milieu admirable 
pour le montage de toute sorte de préparations. On peut aussi rem- 
ployer pour luler les préparations à la glycérine. 

383. Sirop Fabre-Domergue {La Nature, n9 823, 9 mars 1889, 
supp.). 

Sirop de glucose dil. à 25 du pèse-sel. . . 1000 parties. 

Glycérine blanche 100 — 

Alcool méthylique 200 — 

Camphre à saturation. 

Dissoudre la glucose dans Teau chaude et ajouter les autres ingré- 
dients. Ce mélange étant toujours acide doit être neutralisé par 
l'addition d'un peu de lessive de potasse ou de soude. 

Ce sirop est dit conserver sans altération la plupart des pigments 
animaux. 

384. Glucose de Brun (d'après Fabre-Domergub, Premiers 
principes y 1889, p. 123). 

Eau distillée 140 parties. 

Alcool camphré 10 — 

Glucose 40 — 

Glycérine 10 — 

Mêlez ensemble l'eau, la glucose et la glycérine, ajoutez l'alcool et 
filtrez pour enlever Texcés de camphre qui se précipite. Ce sirop 
n'attaque pas les teintures aux couleurs d'aniline et conserve même 
la coloration du vert de méthyle. 

385. Lévulose. — La lévulose a été recommandée comme milieu 



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268 CHAPITRE XIX 

de conservation par Behrens, KoSsel et Sghiefferdbgker {Dos Mi- 
ftros/pop., etc.,Braunschweig, 1889). Elle ne cristallise pas, et conserve 
bien les colorations au carmin et aux couleurs d*aniline (rhéma- 
toxyline s'y fane un peu). Réfraction un peu supérieure à celle de 
la glycérine. Se mêle à Teau. 

LIQUIDES GLYGÉRIQUES 

386. Glycérine. — Les liquides glycériques étant sans contredit, 
après les résines, les milieux les plus importants pour Texamen et la 
conservation des préparations microscopiques, nous ferons bien de 
dire quelques mots sur l'emploi de la glycérine en général. 

On emploie très souvent pour la conservation définitive des prépa- 
rations histologiques la glycérine fortement allongée d'eau. Cette 
pratique se recommande dans bien des cas à cause de Taugmentation 
de visibilité de certains détails de structure très fins qu'on obtient 
en diminuant l'indice de réfraction de la glycérine par Taddition 
d'eau. Mais au point de vue de la bonne conservation des pièces on 
fera toujours mieux d'employer la glycérine pure, la plus dense qu'on 
peut se procurer, 

La meilleure glycérine est celle de la maison Price, de Londres. 
Elle est neutre, plus dense qu'aucune autre glycérine que nous 
ayons examinée, et possède un indice de réfraction de 1,46. On en 
trouve facilement de petites quantités dans toutes les pharmacies 
anglaises. 

Ce n'est pas une chose facile que de luter les préparations à la 
glycérine d'une façon assez solide pour assurer leur conservation 
définitive. La glycérine est extrêmement pénétrante et finit toujours 
par attaquer tous les luts à la gomme-laque ou au bitume qui ont 
été imaginés jusqu'ici. Il est cependant un moyen très simple de 
prévenir cet inconvénient. On entoure la préparation d'abord d'une 
bordure de gelée à la glycérine (l'une ou Tautre des gelées dont les 
formules vont suivre conviendra). On attend que la gelée se soit 
solidifiée, et l'on procède à la fermeture définitive par le lut de Bell, 
ou par le bitume de Judée. On fera bien de prendre la précaution 
recommandée par Marsh, de rendre la gélatine insoluble en la trai- 
tant, aussitôt qu'elle s'est séchée suffisamment, par du bichromate 
de potasse. (Voyez au chapitre des c Luts et Vernis ».) 

Nous rappelons que la glycérine dissout le carbonate de chaux, et 
qu'en conséquence on ne doit pas l'employer pour la conservation 
d'objets calcaires. 



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LIQUIDES ADDITIONNELS ET CONSERVATEURS 260 

La glycérine ne conserve pas la couleur des préparations colorées 
par la oochenille ou (du moins d*après notre expérience) Thématoxy- 
line. La conservation de la coloration délicate des teintures aux car- 
mins alunés dans la glycérine est chose sur laquelle il ne faut pas 
trop compter. 

387. Glycérine eztra-rôf ringente. — Si dans certains cas il est avanta- 
geux de diminuer Tindice de réfraction de la glycérine par Taddition d'eau, 
dans d'autres il peut être avantageux de Taugmenter. L'indice de réfraction 
de la glycérine de Price est de 1,46 ; en y faisant dissoudre des substances 
appropriées on peut élever cet indice à la hauteur de celui du crown-glass, 
de manière à porter la puissance éclaircissante de la glycérine à la hauteur 
de celle du baume de Canada, et à permettre d'utiliser l'ouverture totale 
des objectifs à immersion homogène. Ainsi, avec une solution de chlorure 
de cadmium dans la glycérine, on peut atteindre l'indice de réfraction de 
1,504; avec une solution saturée de sulfocarbonate de zinc dans la glycé- 
rine, on arrive à 1,501 ; avec une solution saturée d'hydrate de chloral 
(amorphe, de Schering) dans la glycérine, on obtient 1,510; avec Tiodate 
de zinc dans la glycérine, on obtient 1,560, indice qui dépasse celui du 
baume du Canada, qui est de 1,540. (Voyez /ourn. Boy. Mie, Soc, 1879, 
p. 346 ; — 1881, p. 943, et p. 366, — et 1880, p. 1031.) 

Pour préparer la solution de sulfocarbonate de zinc, on prend des 
parties égales de cristaux de sulfocarbonate de zinc et de- glycérine de 
Price, on les mêle ensemble, et l'on chauffe jusqu'à faire bouillir la glycé- 
rine. AU bout d'une heure la solution est faite, mais il vaut mieux continuer 
à chauffer pendant quelque temps, vu que, si l'on ne chauffe que le temps 
nécessaire pour faire dissoudre les cristaux, il y a risque de voir la solution 
cristalliser au refroidissement. Filtrer à chaud. En évaporant doucement la 
solution, ou en y faisant dissoudre encore quelques cristaux, on peut faire 
monter l'indice de réfraction jusqu'à 1,525. {Joum. Boy. Mie. Soc, 1880, 
p. 1031.) 

388. Glycérines alcoolisées. — En combinant en diverses pro- 
portions la glycérine, Teau et Talcool, on obtient une série de liqui- 
des très utiles comme liquides additionnels pour Tétude d'objets qui 
demandent à ne pas être trop éclaircis et à ne subir que très graduel- 
lement l'action d'un milieu dense. Pour les employer, il convient de 
mettre l'objet dans une quantité suffisante du liquide qu'on choisit, 
le couvrir légèrement, et le laisser quelques heures ou quelques 
jours. Au bout de ce temps, l'alcool s'est évaporé avec une partie de 
l'eau et l'on peut procéder à la fermeture de la préparation, ou bien 
monter dans la glycérine plus forte, ou dans une gelée à la glycérine. 
On trouvera ces liquides très importants pour l'étude des fins détails 
de la structure des cellules, ainsi que pour les fines dissections d'ob- 
jets très petits. 



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270 CHAPITRE XIX 

1. Liquide de Galberla. 

Glycérine i partie. 

Alcool 1 — 

Eau 1 — 

2. Nous recommandons pour les objets très délicats le mélange 
suivant. (Rappelons toutefois que la liqueur de Gilson (n** 368) vient 
prendre place, sous le rapport de la densité, entre ce mélange et le 
précédent.) 

Glycérine 1 partie. 

Alcool 1 — 

Eau 2 — 

3. Liquide de Hœntsch. 

Glycérine 1 partie. 

Alcool 3 — 

Eau , .... 2 — 

4. Liquide de Jœger (Vogt et Yung , Ti^aité d'Ânat. comp. prat„ 
p. 46). 

Gl}cérine 1 partie. 

Alcool 1 — 

Eau de mer 10 — 



GLYCÉRINES GÉLATINÉES : GELÉES A LA GLYCÉRINE 

389. Emploi de la glycérine gélatinée, ou gelée à, la gly- 
cérine. — Nous avons déjà fait observer que la glycérine est d'un 
emploi peu commode et peu sûr pour les préparations permanentes, 
à cause de la grande facilité avec laquelle elle attaque les luts, de 
sorte que, malgré toutes les précautions, les préparations faîtes à la 
glycérine pure seront toujours d'une permanence problématique. On 
pare à cet inconvénient en combinant la glycérine avec la gélatine, 
de manière à former un composé qui a la consistance d'une gelée à 
la température normale. Pour se servir de cette gelée, on en 
fait fondre une petite portion sur le porte-objet à l'aide d'une 
lampe à alcool, on y introduit Tobjet préalablement imbibé d*eau ou 
de glycérine S on pose une lamelle, et on laisse refroidir. Gela sufflt 

i Cela suffît quand on fait usage d'une gelée contenant relativement peu de 
gélatine. Pour les gelées fermes, riches en gélatine, on n'obtiendra de bons 
résultats qu'en préparant les objets dans un bain de la même gelée fondue au 
bain-marie. 



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LIQUIDES ADDITIONNELS ET CONSERVATEURS 271 

parfaitement à la conservation des pièces ; il n*est nécessaire de luter 
la préparation que pour mieux assujettir la lamelle en vue d'une 
conservation tout à fait définitive. 

Les gelées à la glycérine ont un indice de réfraction supérieur à 
celui de la glycérine pure. 

Nous sommes d'avis que ces milieux sont d'une importance très 
réelle, et que l'histologiste doit toujours posséder une bonne gelée à 
la glycérine. 

390. Gelée & la glycérine (Deanne) (Frey, Le Microscope. 
p. 231), — Faire dissoudre 30 grammes de gélatine [dans 60 grammes 
d*eau chaude, et ajouter 120 grammes de glycérine. 

391. Gelée & la glycérine (Lawrence (Davies , Prep. and Moun- 
ting of Mie. Objects, p. 84). — On prend une quantité voulue de 
gélatine qu'on laisse ramollir pendant deux ou trois heures dans 
l'eau, on l'exprime, et on la fait fondre. On ajoute 1,5 ce. de blanc 
d'œuf par 25 ce. de gélatine fondue; il faut ajouter le blanc d'œuf au 
moment où la gélatine est refroidie mais encore liquide. On fait bouil- 
lir, ce qui coagule le blanc d'œuf et éclaircit la gélatine. On filtre à 
travers delà flanelle fine, et Ton ajoute pour 25 ce. du liquide filtré 
10 ce. d'un mélange de 2 parties d'eau camphrée avec une partie de 
glycérine. 

392. Gelée & la glycérine {Beale, How to woi% etc., p. 57). — 
Beale fait fondre et clarifie comme dans la formule précédente une 
certaine quantité de gélatine (ou colle de poisson), et la combine avec 
un volume égal de glycérine concentrée. 

393 Gelée & la glycérine (Brandt, Zeitschr, f. wiss. Mik.y 4880, 
p. 69 ; Jowm, Roy. Mie. Soc, 1880, p. 602). — On fait fondre de la 
gélatine de la manière que nous avons exposée plus haut (n^ 391,) on 
ajoute 1,5 vol. de glycérine, et l'on liltre. A la gelée filtré on ajoute 
quelques gouttes d'acide phénique. 

La filtration du mélange est un point d'une importance capitale. 
La gélatine du commerce contient toujours de la poussière et de 
nombreux petits fils. Le papier à filtrer ne laisse pas passer la gelée 
en quantité suffisante, et la flanelle ne fait qu'augmenter la quantité 
de fils. Brandi arrive au but à l'aide du dispositif suivant. On prend 
une bouteille à large goulot, et on la coupe ou on la brise en deux. 
Le goulot est bouché par un bouchon perforé de deux trous. Dans 



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272 CHAPITRE XIX 

Tun de ces trous on ajuste un tube de verre long de 20 cm. ; au dedans 
(le la bouteille il doit faire un peu saillie, et au dehors il 
doit être courbé assez brusquement de côté et effilé en une pointe de 
1 ,5 à 2 mm. de diamètre. Dans Tautre trou on ajuste un entonnoir, de 
telle façon que sa partie large se trouve dans la bouteille, et que son 
tube de décharge passe à travers le bouchon. On tasse du verre pilé 
dans le tube de décharge, on met la gelée de glycérine dans Tenton- 
noir, et Ton remplit d'eau chaude Fespace compris entre Tentonnoir 
et les parois de la bouteille. L*eau chaude s'écoule lentement par 
Torifice du tube de verre, et on la remplace à mesure. 

394. Gelée &la glycérine (Kaiser, Doi, CentralbL, 1880, p. 25). 
— On laisse ramollir 1 partie de gélatine de Paris pendant deux 
heures dans 6 parties d'eau, et l'on ajoute 7 parties de glycérine et 
1 p. 100 d'acide phénique concentré. On chauffe pendant dix à quinze 
minutes, en remuant tout le temps jusqu'à ce que les flocons produits 
par l'acide phénique aient disparu. On filtre à chaud à travers du 
verre pilé fin, humecté et tassé dans un entonnoir. 

Nous nous sommes fait une excellente gelée d'après cette formule, 
en substituant cependant la colle de poisson à la gélatine. On réussira 
à filtrer à travers du papier en tenant l'entonnoir près d'un bon feu 
de cheminée. 

396. Gelée & la glycérine (Seaman, Amer, MonthL Mie, Journ,^ 
1881, p. 534). — On dissout de la colle de poisson dans l'eau de manière 
à avoir une gelée un peu ferme après refroidissement, on ajoute 
10 p. 100 de glycérine, et un peu de solution de borax, d'acide phé- 
nique ou de camphre. On filtre à chaud à travers de la mousseline et 
Ton ajoute un peu d'alcool. 

396. Gelée & la glycérine (Fol , Lehrb,, p. 138). — Fol recom- 
mande les trois gelées suivantes : 

1. Faire fondre ensemble un volume de la gelée de Beale (voyez 
n^ 394) et un demi-volume à un volume d'eau, et ajouter 2 à 5 p. 100 
d'une solution d'acide salicylique, d'acide phénique, ou de camphre. 

2. — Gélatine 30 parties 

Eau 70 — 

Glycérine 100 — 

Solution alcoohque de camphre 5 — 

A préparer comme la gelée de Beale, le camphre étant ajouté en 
dernier lieu en remuant . 



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LIQUIDES ADDITIONNELS ET CONSERVATEURS 273 

3. — Gélatine 20 parties. 

Eau 150 — 

Glycérine 100 — 

Solution alcoolique de camphre 15 — 

A préparer comme la précédente. 

397. Gélatine au^chloral (Gilson, in litt.). — J'ai bien de Tobli- 
gation à M. le professeur Gilson, qui a bien voulu m'envoyer, il y a 
deux ans, la formule suivante d'une gelée très réfringente et en con- 
séquence utile pour des objets de nature opaque auxquels on désire 
épargner les essences et le baume. 

Gélatine gonflée dans Teau pendant 12 heures, 

égouttée, puis fondue 1 volume. 

Glycérine de Price 1 — 

Hydrate de chloral cristallisé 1 — 

On mélange les deux liquides, et Ton ajoute autant de cristaux de 
choral qu*il en faut pour faire augmenter le mélange de la moitié de 
son volume, et Ton chauffe jusqu'à dissolution. On peut y ajouter des 
matières colorantes, vert de méthyle, solutions carminées, etc. 

398. Gelée de Squlre (Squire, Methods and Formulae^ p. 84). 
— 100 grammes de gélatine française, gonflée dans de Teau chloro- 
formée, égouttée et fondue dans 750 grammes de glycérine. Ajouter 
400 grammes d*eau chloroformée dans laquelle on a incorporé environ 
80 grammes de blanc d'œuf ; mélanger intimement, et chauffer à 
ébullition pendant 5 minutes. Ajouter de Teau chloroformée pour 
parfaire le poids total de 1,550 grammes. Filtrer dans une étuve. 



Autres milieux aqueux réfringents 

399. BModure de mercnre et iodare de potaBsium (Stephenson, 
Joum. Boy, Mie, Soc.^ 1882, p. 167). —On ajoute lesdeux sels àde Teaujusqu'à 
saturation, et Ton allonge d'eau s*il y a lieu. La solution saturée a Tindice 
de rérraction énorme de 1,680. J'ai expérimenté avec la solution saturée et 
avec des solutions diluées. Les tissus s'y conservent bien, mais les prépara- 
tions sont bientôt détériorées par un précipité qui se forme dans le liquide. 
Néanmoins, je pense qu'il est bon de ronaaitre ce liquide, qui peut rendre 
des services pour des préparations temporaires par suite de ses propriétés 
optiques vraiment remarquables. 



ANAT. IIICROSC. 18 



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274 



CHAPITRE XIX 



RÉSINES 

400. Les résines et les baumes sont pour la plupart des subs- 
tances solides, ou du moins d'une viscosité très grande, à la tempé- 
rature normale. Elles consistent en un corps amorphe ou vitreux en 
solution dans une huile essentielle. Par distillation ou par évaporation 
naturelle à Tair, les résines perdent leur huile essentielle et passent 
à Tétat solide. Selon nous, c'est toujours de ces résines ainsi privées 
de leur essence par évaporation spontanée ou artificielle qu'il con- 
vient de se servir pour faire les solutions qu'emploie le micrographe. 
Voici pourquoi. Les résines brutes, encore liquides par suite de l'huile 
essentielle qu'elles contiennent, renferment en outre une certaine 
proportion d'eau. Celte eau est nuisible sous deux rapports : elle rend 
plus difflcile le problème de faire une solution parfaitement limpide 
de la résine dans un des dissolvants volatils (xylol ou chloroforme, 
par exemple) qu'on emploie à cette fin, pour des raisons bien moti- 
vées ; elle nuit à la bonne définition et à la bonne conservation des 
tissus^ et surtout à la bonne conservation des pièces colorées. C'est 
pourquoi nous recommandons de faire toujours les solutions, soit de 
colophane, soit de résine damar, soit de baume, avec la substance en 
nature ; nous sommes d'avis qu'on obtient ainsi des solutions bien 
plus belles qu'en employant la substance brute. Fol {Lehrbuch, 
p. 438, 139) est d'un autre avis. 

Les solutions peuvent se faire avec des menstrues volatils, telles 
que le xylol ou le chloroforme ; en ce cas elles sèchent rapidement. 
Ou bien elles peuvent se faire avec des menstrues non volatils, telles 
que l'essence de térébenthine ; elles sèchent alors lentement. Dans 
l'un et l'autre cas, aussitôt que l'évaporation du dissolvant s'est 
accomplie, la résine devient cassante ; elle peut perdre de son adhé- 
sion à la lamelle, qui peut se laisser détacher par un choc si elle 
n'est pas lutée ; elle peut se fendiller et endommager la préparation. 
Pour cette raison, on emploie de préférence les solutions au chloro- 
forme ou au xylol alors qu'on désire avoir une préparation solidifiée 
aussi rapidement que possible, de manière à pouvoir l'utiliser pour 
l'étude sans délai. Les solutions faites à la térébenthine doivent être 
;iu contraire employées de préférence lorsqu'il s'agit en premier lieu 
d'assurer à la préparation une durée aussi longue que possible. 

Au point de vue pratique je crois qu'ï7 n'existe pas une seule de 
ces solutions qui soit un milieu histologique irréprochable. Les solu- 
tions de résine damar au xylol sont très belles et donnent pour des 



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LIQUIDES ADDITIONNELS ET CONSERVATEURS 275 

détails délicats souvent une meilleure définition que le baume de 
Canada. Mais je crois qu'aucune de ces solutions n*est parfaitement 
stable. Dans la plupart de mes vieilles préparations au damar se sont 
développés des granules qui les ont détériorées. lien est de même, mais 
à un degré moindre, du baume de Canada au xylol ou au benzol. Le 
baume au chloroforme se conserve bien, mais brunit beaucoup avec 
Tâge ; de plus, il ne conserve pas bien les couleurs d'aniline. Le baume 
à Talcool de Seiler se maintient très bien, mais ne conserve pas non. 
plus les couleurs d*aniline. Je m'en sers pour les colorations au car- 
min. Pour les couleurs d'aniline j'emploie maintenant la colophane à 
la térébenthine. Elle donne une bonne définition de détails délicats et 
se conserve parfaitement. M. le docteur Paul Mayer m'écrit cependant 
que ces sortes de solutions (c'est-à-dire à la térébenthine) ne valent 
rien pour les colorations à l'hématéine. Puis cette solution a un indice 
trop faible pour les objets qui demandent à être fortement éclaircis. 
Pour ceux-là j'emploie Tessence de cèdre. C'est un milieu d'une défi- 
nition parfaite, et qui se conserve parfaitement. Avec le temps cette 
essence se solidifie suffisamment pour fixer le verre à couvrir ; ou si 
on le désire on peut toujours luter avec le ciment de Bell. Je ne puis 
donc que recommander la colophane à la térébenthine comme milieu 
général ; et si Ton désire avoir un milieu plus réfringent, alors 
Vessence de cèdre pour les couleurs d'aniline, et le baume de Seiler 
pour le carmin (je n'ai pas assez d'expérience quant à son effet sur 
les colorations à l'hématéine). Le baume au xylol est certainement 
un milieu excellent quant à la conservation des couleurs (d*après 
mon expérience; Martinotti cependant dit avoir trouvé que la safra- 
nine y perd), mais j'estime qu'il n'est pas absolument de confiance 
sous le rapport de la formation de granules. (M. le docteur Mayer est 
aussi de cet avis, à ce qu'il a bien voulu m'e'crire récemment.) On le 
voit bien, nous ne possédons pas encore un milieu résineux par f al- 
ternent satisfaisant. 

401. Baume de Canada. — Ce baume se trouve en général dans 
le commerce à l'état liquide ; on le rencontre cependant quelquefois 
à l'état solide. Si on ne le trouve pas sous cette forme, nous recom- 
mandons de le faire évaporer à la chaleur douce et sèche d'une étuve 
jusqu'à ce qu'il devienne cassant après refroidissement. Cette précau- 
tion n'est cependant nullement indispensable. 

Les dissolvants employés pour faire les solutions sont : le xylol, le 
benzol, le chloroforme, l'essence de térébenthine et Talcool. Les solu- 
tions dans le xylol sont moins visqueuses que celles qui sont faites 



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I 



276 CHAPITRE XIX 

dans les autres dissolvants, ce qui les rend beaucoup plus faciles à 
f manier. Elles sèchent vite. Elles peuvent dissoudre sans se troubler 

les traces de paraffine qui peuvent rester dans les coupes. Elles ont 
^ l'avantage d*attaquer moins que les autres solutions les teintures aux 

couleurs d'aniline. Nous avons donné au numéro précédent une esti- 
mation de la stabilité de cette solution, que nous n'avons pas toujours 
trouvée parfaite, ce qui ne veut cependant nullement dire que son 
emploi expose à de graves inconvénients. C'est la solution qu'emploie 
maintenant Mayer en général (Mayer, in litt.) . Les solutions à la 
benzine ressemblent beaucoup aux solutions au xylol, mais nous 
paraissent leur être inférieures sous les rapports que nous avons 
indiqués. Les solutions au chloroforme sont excellentes, mais il nous 
semble qu'avec ce dissolvant il est moins facile d'obtenir une solution 
parfaitement limpide, et que les solutions sont décidément moins 
commodes à manier; elles ont surtout plus de viscosité. D'après Heys 
(Trans, Mie. Soc, 1865, jan., p. 19), il est avantageux de verser la 
solution faite au chloroforme dans des flacons hauts et étroits et de 
la laisser reposer au moins un mois; par ce moyen elle se clarifie. 
Voyez également ce que nous avons dit au sujet de ces solutions au. 
numéro précédent. 

Les solutions à la térébenthine sont peu employées. Il paraît qu'avec 
ce dissolvant il n'est pas très facile d'obtenir des solutions homogènes 
et que lorsqu'elles sèchent, il s'y forme souvent des traînées et des 
bulles d'air. C'est pourquoi nous recommandons de ne pas employer 
le baume de Canada, mais plutôt la colophane toutes les fois qu'on 
désire faire usage d'une solution à la térébenthine. 

Seiler {Proc. Amer, Soc. Mie, 1881, p. 60) recommande de prendre 
du baume de Canada réduit à l'état sec par évaporation comme nous 
l'avons dit, de le dissoudre dans de l'alcool absolu chaud, et de filtrer 
à travers de la ouate. Cette solution aurait, selon Seiler, l'avantage 
que, comme elle nous met à même d'y porter les objets directement 
de l'alcool absolu sans traitement par une essence ou autre agent 
éclaircissant, on évite le ratatinement des tissus causé par l'emploi 
des agents éclaircissants, et l'on évite aussi la dissolution des parties 
graisseuses des cellules. 

Je trouve que c'est là une opération trop délicate, et elle ne m'a 
pas donné de meilleurs résultats que le procédé ordinaire de passage 
par une essence. Mais, comme je l'ai dit plus haut, je trouve que la 
solution de Seiler est une des plus stables qui existent (la mienne, 
faite depuis quatorze ans, est encore parfaitement limpide, et n'a pas 
sensiblement foncé de couleur). Employée de la manière ordinaire, 



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LIQUIDES ADDITIONNELS ET CONSERVATEURS 277 

après un éclaircissant, elle est d'une manipulation assez facile, si ce 
n'est qu'elle a une tendance à condenser l'haleine de Topérateur à sa 
surface sous forme de petites bulles d'eau. La définition est très belle, 
et la conservation presque toujours parfaite ; mes plus anciennes 
préparations ne montrent que quelques granulations sans importance. 
Naturellement on ne peut pas employer cette solution avec les cou- 
leurs d'aniline. A part cela, je m'en suis parfaitement bien trouvé, 

Sauu {Zeit, f, wiss. Mik., 1885, p. 6) a préconisé une solution de 
baume dans l'essence de bois de cèdre. 

Martinotti {Zeit. f. toiss. Mik., IV, 2, 1887, p. 159) a obtenu de 
très belles solutions avec l'essence d'aspic. (» Essence d'aspic rec- 
tifiée, de DuRORiEZ, à Paris.) Malheureursement la solution attaque la 
safranine. 

402. Résine damar, ou dammar, ou d'Ammar. — On peut 
faire des solutions de résine damar dans le xylol, la benzine ou le chlo- 
roforme. Ces solutions sont parfaitement incolores, avantage qu'elles 
présentent sur les solutions de baume de Canada. Mais elles ont l'incon- 
vénient de laisser la résine à l'état d'une grande fragilité ou même 
de friabilité, après évaporation du dissolvant. C'est pour cette raison, 
aussi bien que dans le but de diminuer l'indice de réfraction, qu'on 
fait les solutions, en partie du moins, à l'aide de l'essence de térében- 
thine. 

Les solutions de damar n'ont, pensons-nous, aucun avantage sur 
les solutions de baume de Canada pour les travaux ordinaires d'his- 
tologie ou d'embryologie, et leur sont même inférieures sous le rap- 
port de la durée ; mais elles présentent des avantages indiscutables 
lorsqu'il s'agit de la démonstration de détails de structure très fins ; 
c'est pour ce motif qu'on les emploie de préférence dans les recherches 
cytologiques. 

Flemming [Arch, f. mik. AnaL, 1881, p. 322) fait dissoudre de la 
résine damar dans un mélange à parties égales de benzine et d'essence 
de térébenthine, à l'aide de la chaleur ; il fait évaporer ensuite la 
solution jusqu'à la consistance d*un sirop épais. Nous avons beaucoup 
employé cette solution et avons trouvé qu'elle donne d'admirables 
résultats quant à la définition d'objets difficiles, mais nous avons 
aussi toujours trouvé que nos solutions devenaient troubles après 
quelques mois. ' 

€ C. M. J. » [Journ, Roy. Mie, Soc, 1883, p. 145) explique que le 
damar n'est pas parfaitement soluble dans la benzine ou dans la téré- 
benthine à la température normale ; et que si Ton s'aide de la chaleur 



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Èl% 



CHAPITRE XIX 



pour effectuer la dissolution, on arrive à une dissolution plus com- 
plète sur le moment, mais la solution devient laiteuse avec le temps. 
Il conseille de procéder ainsi. A 3 parties de résine damar broyée on 
ajoute 6 parties de benzine pure, et on laisse la résine se dissoudre à 
la température normale. Après deux jours, on décante la résine dis- 
soute et Ton ajoute une partie d'essence de térébenthine. La solution 
ainsi préparée se maintient indéfiniment d'une limpidité parfaite, et 
Fad Jition d'essence de térébenthine suffit pour empêcher la résine de 
devi^nir trop cassante en séchant. 

Ffitzner [MorphoL Jahrb,^ 1880, p. 469) prend des parties égales 
de damar, de benzine et d'essence de térébenthine, les mêle et les 
laisse dans un endroit chaud jusqu'à ce que la dissolution soit faite. 
Puis il décante et fait évaporer à la consistance voulue. Nous pensons 
que c'est là une meilleure méthode de préparation que celle de Flem- 

MtNG. 

Nous ajouterons que nous avons trouvé que le damar se dissout 
entièrement à froid dans le xylol, et donne ainsi une solution de 
toute beauté en restant limpide indéfiniment; la résine devient cepen- 
dant très cassante en séchant. La définition est extrêmement belle, 
mais comme je l'ai dit plus haut les préparations développent souvent 
avec le temps (pas toujours) des granulations qui les rendent presque 
inutilisables pour les travaux délicats. 

.^ÏAHTiNOTTi {Zeit. f, wiss. Mik.j IV, 2, 1887, p. 1S3) recommande 
de combiner cette solution à de l'essence de térébenthine. 

On pourra lire encore d'autres formules dans Journ. Roy. Mie. 
Soc, 1888, p. 1061, et 1890, p. 680; et dans Squire, Melhodsand For- 
mulœ, p. 84. 

Je reconnais la grande beauté de la définition fournie par ces solu- 
tions, mais il me semble malheureusement quaucune d'elles ne 
mérite une grande confiance sous le rapport de la conservation 
indéfinie. 

403. Colophane. — L'emploi d'une solution de colophane dans 
l'essence de térébenthine, préconisé par Kleinenberg, est en effet fort 
à recommander. La solution est incolore et limpide, et reste indéfi- 
niment telle. Elle sèche très lentement. L'indice de réfraction est infé- 
rieur à celui du baume, et donne de très bonnes définitions des objets 
difdeiles. Nous employons beaucoup cette solution, et comme nous 
avons pu nous assurer qu'elle est la plus facile de toutes à manier, 
nous la recommandons spécialement aux commençants. 

Kleinenberg met en garde contre l'emploi de la solution de colo- 



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LIQUIDES ADDITIONNELS ET CONSERVATEURS 279 

phane dans Talcool absolu. Cette solution fournit des préparations 
qui sont d'abord extrêmement belles, mais qui sont bientôt ruinées 
par la formation de cristaux ou d*un précipité amorphe. 

Comme je Tai dit plus haut, cette solution me parait être de toute 
confiance pour la durée; je n'ai pas eu une seule préparation dété- 
riorée. 

Pour la faire, j'ajoute peu à peu des morceaux de colophane à de 
l'essence de térébenthine tenue dans une éluve, et je filtre deux fois, 
toujours à Tétuve. Il faut en tout une quinzaine de jours. 

404. Térébenthine de Venise. — Vosseler {Zeit. /. wiss. Mik., 
VI, 3, 1889, p. 292) préconise cette substance comme ayant des 
avantages considérables vis-à-vis du baume et du damar. On prend 
de la térébenthine de Venise commerciale, on la met dans un verre 
cylindrique haut avec un volume égal d'alcool à 96 p. 100 ; on laisse 
le tout en un lieu chaud pendant trois à quatre semaines, et l'on 
décante. 

Vosseler dit qu'on peut monter dans ce médium sans passer par un 
agent éclaircissant. L'indice de réfraction est inférieur à celui du 
baume. Les teintures s'y conservent bien. 

Ce médium est également recommandé par Sucuannek {ibid,<, VII, 
4, 1891, p. 463). Cet auteur recommande de le préparer avec des 
parties égales de térébenthine de Venise et alcool absolu neutre 
(préparé en traitant l'alcool absolu du commerce par le sulfate de 
cuivre calciné et la chaux vive, n** 88). Le mélange doit être fréquem- 
ment agité, et être maintenu à l'étuve pendant un jour ou deux jus- 
qu'à ce qu'il soit devenu limpide et d'une consistance suffisante. 

405. Vernis copal. — J*ai vu de fort belles préparations montées dans ce 
milieu. Je l'ai essayé moi-même et n'ai pas réussi. 

406. Styrax etliquidambar. — Voyez entre autres Van IIeurck {Bull, 
Soc, Belg. Mie, 1883, p. 134-136 ; /ourn. Boy. Mie, Soc, 1883, p. 741); 
Joum. Roy, Mie, Soc, June 1884; F. Kitton (Journ. Boy. Mie Soc, 1884, 
p. 318) ; A.-B. AUBERT {Amer, Mon. Mie. Journ., 1885, p. 86; Journ, Boy. 
Mie. Soe,, 1885, p. 744), et Fol, Lehrbuch, p. 141. 

L'indice de réfraction de ces résines est extrêmement élevé (1,585, celui 
du baume de Canada étant de 1,540). Or, c'est précisément ce qui ne doit 
pas être pour les préparations histologiques. De plus, le styrax a une cou- 
leur brune très foncée. Il convient, semblet-il, de laisser ces milieux aux 
diatomistes. 

407. Huile de ricin. — Grenacher, qui Ta employée pour monter des 
coupes d'yeux de Céphalopodes, explique (A 6Aa;t^/.d. naturforsch. Gesellsch , 



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280 CHAPITRE XIX 

Halle a. S., Bd XVI ; Zeil. f, wiss. MiL, 1885, p. 244) que l'huile de ricin a 
un indice de réfraction de 1,49 (bien inférieur à celui du baume de Canada, 
1,54). Elle rend donc les objets beaucoup moins transparents que le baume 
et doit donner une augmentation considérable de visibilité pour les éléments 
les plus réfringents des tissus. L'huile de ricin étant soluble dans Talcool, 
on peut y porter directement les objets à la sortie de Talcool absolu. Je Tai 
essayée, et je n*ai pas eu de bons résultats. 

408. Résine sandaraque (Lavdowsky, cité d'après Bef, Handbook 
Med. Se. y Supp,, p. 438). — Résine Sandaraque, 30 gr. ; alcool absolu, 50 gr. 
On peut l'employer sans passer par une essence. 

409. Vernis photographique, employé par Weigert pour monter de 
grandes coupes sans verre à couvrir, voyez Zeit. f, wiss. Mik., IV, 2, 1887, 
p. 209. 



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CHAPITRE XX 

LUTS ET VERNIS 



410. Choix d'un lut ou d'un vernis. — Les luis servent à maîn- 
fenîr solidement en place les cellules et les verres à couvrir, et à 
empêcher le contact entre le liquide d'inclusion et Tair; on leur 
demande surtout une grande puissance d'adhésion au verre. Les 
vernis servent à fermer encore plus hermétiquement les bordures, et 
à proléger le lut lui-même contre Tinfluence désintégrante de Tair et 
contre les liquides employés avec les objectifs à immersion. 

Avec Garpenter nous ferons observer que les luis ne doivent jamais 
contenir aucun mélange de particules solides ; car les luis qui en 
contiennent peuvent avoir beaucoup d*adhésion au début, mais 
deviennent toujours poreux tôt ou lard, et laissent sortir le liquide 
d'inclusion et entrer Tair. 

Behrens (Zeit. f. wiss. Mik., II, 1888, p. 84) a fait des expé- 
riences suivies sur la solidité des luts usuels, et il est arrivé à la con- 
clusion que les luts qui montrent le plus de ténacité sont ceux qui 
sèchent le plus lentement ; les luis qui sèchent vile ont le défaut de 
devenir cassants. 11 est donc bon d'éviter les luts et les vernis dont le 
menstrue est un corps très volatil, comme le chloroforme, Téther, 
Talcool ou la benzine. Nous devons dire cependant que nous pensons 
qu'on fera bien de ne pas prendre celte généralisation trop à la 
lettre ; car l'un des meilleurs luis qui nous soient connus est certaine- 
ment le mastic de Bell, dont le menstrue parait être, en partie du 
moins, l'éther. 

Dans le tableau suivant nous donnons les résultats des expériences d'Au- 
BERT (Amer, Mon, Mie. Joum., 1885, p. 22T ;Joum, Boy. Mie. 5oc., 1886, 
p. 173) sur la puissance d'adhésion de divers mastics : 

Mastic au caoutchouc, de Miller 1000 

Mastic de Bell 735 



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282 CHAPITRE XX 

Baume de Canada 664 

Mastic de Lovell (Joum, Roy. Mie. Soc.^ 1883, p. 780 ... 626 

Styrax d'Amérique 575 

Mastic de Kin^ 532 

« Gold size » 395 

Glu marine (en solution) 304 

« Zinc white cernent » 241 

Le c gold size > employé aurait donné des résultats plus satisfaisants s*il 
avait été convenablement durci. 

A consulter aussi. — Aubert, The MicroscopSy XI, 1891, p. 150 ; 
Journ. Roy. Mie. Soc.^ 1891, p. 692 ; Beck, The Microscope, XI, 
1891, p. 338, 368, et Journ. Roy. Mie. Soe., 1892, p. 293; et la 
dernière éd. des Tabellen de Behrens (Bruhn, Braunschweig, 1892). 

411. Manière de luter les préparations faites dans les 
milieux liquides. — La manière la plus sûre de fermer une prépa- 
ration montée, par exemple, dans la glycérine, est la suivante. Avec 
une paire d'emporte-pièce d*acier nous découpons des anneaux de 
papier d'environ un millimètre de largeur. On choisit un de ces 
anneaux, d'une dimension correspondant à celle du verre à couvrir 
einplo3'é ; il est bon que Tanneau ait un diamètre d'un millimètre de 
moins que celui du verre à couvrir. On pose l'anneau, humecté avec 
un peu du liquide d'inclusion, sur le porte-objet ; on remplit de 
liquide d'inclusion la cellule ainsi formée ; on y introduit l'objet ; on 
pose le verre à couvrir, qui doit dépasser d'un demi-millimètre 
l'anneau de papier ; on remplit de gelée à la glycérine la rigole circu- 
laire formée par le débordement du verre à couvrir ; et aussitôt que 
la gelée s'est solidifiée on applique avec une tournelte une bordure 
de lut ou de vernis. 

Il va sans dire qu'on ne peut pas toujours employer des cellules de 
papier; mais, suivant nous, il est essentiel d'employer toujours la 
bordure préliminaire de gelée à la glycérine. 

412. Lut à la gélatine (Marsh, Seetion Cutting, p. 104). — On 
fait ramollir dans l'eau 18 grammes de gélatine, on fait fondre, ou 
ajoute 3 gouttes de créosote, et l'on conserve dans un flacon bouché. 
Pour s'en servir, on la fait fondre. 

Après avoir appliqué une bordure de cette gélaline, on peut, ou 
bien appliquer une bordure d'un autre lut ou vernis, ou bien procé- 
der ainsi : on attend que la gélatine se soit solidifiée ; puis on la 
badigeonne avec une solution à 2 p. 100 de bichromate de potasse 



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LUTS ET VERNIS 283 

dans Teau. Gela doit se faire à la lumière du jour ; sous Tinfluence de 
la lumière, la gélatine passe à Tétat insoluble. On finit la préparation 
avec une couche d'un lut ou d'un vernis quelconque. Nous recom- 
mandons toutefois le mastic de Bell. 

413. Mastio de Bell (Bell's microscopicaJ Cernent). — Com- 
position inconnue. Parait être une solution de gomme-laque dans 
Talcool et Téther, avec peut-être un peu de baume de Canada. On se 
le procure chez J. Bell and C°, chemists, 338, Oxford street, London, 
et chez les opticiens, 

Ce mastic a la consistance d'un vernis ; il coule librement du pin- 
ceau, et sèche vite. On peut l'allonger avec l'éther ou le chloroforme. 
Il n'est pas allaqué par l'essence de cèdre employée pour les objectifs 
à immersion homogène. C'est la préparation que nous employons 
le plus, soit comme lut, soit comme vernis. Après une expérience de 
plus de vingt ans, nous pouvons assurer que ce mastic est d'une très 
grande durée, et nous le recommandons particulièrement. 

414. Bitume de Judée. — Se trouve dans le commerce. Cette 
substance est soluble dans l'essence de térébenthine, la benzine, 1c 
naphte et d'autres menstrues. Il faut éviter d'employer les espèces 
brutes et presque toujours inférieures que l'on trouve chez les dro- 
guistes ; le mieux est de ne se servir que des dissolutions toutes faites 
que Ton trouve chez les opticiens. D'après le Micrographie DicHo- 
nary, ces préparations consisteraient en du bitume de Judée dissous 
dans de l'huile de lin bouillante, ou dans l'essence de térébenthine, 
ou dans un mélange des deux. D'après Fol, la présence d'un pou 
d'huile de lin est en tout cas nécessaire pour assurer une ténacité per- 
manente dans le vernis. Kitton {Mo7i. Mie. Journ., 1874, p. 34) 
recommande le bitume dissous dans la benzine avec addition d'une 
faible proportion de gold-size. 

Pourvu qu'il soit de bonne qualité, le bitume de Judée est certaine- 
ment un excellent mastic. 

415. Vernis noir Brunswick ( « Brunswick Black » ). — Se 
trouve chez les opticiens. Pour la manière de le préparer, voyez Beali^ 
{How to work, etc., p. 49). 

Ce vernis est soluble dans l'essence de térébenthine. Il est agréable 
à manier et sèche bien. Il est particulièrement propre à faire des 
cellules avec la tournette. 

416. Noir Brunswick et gold-size (Eulbnstein, dans Bealk, 



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284 CHAPITRE XX 

toc. cit.). — Mélange à parties égales de noir Brunswick et de gold- 
size, avec une faible quantité de baume de Canada. 

417. Gold-Size. — Se trouve dans le commerce et chez les opti- 
ciens. Nous recommandons de n'employer que le gold-size des opti- 
ciens ; et nous supprimons la formule pour la préparation, très 
compliquée, de ce mastic, étant convaincu que c'est là une prépara- 
tion qu'il convient de laisser aux gens du métier. Soluble dans 
Tessence de térébenthine. Excellent pour faire des cellules à la tour- 
nette. Contrairement à Tavis de Behrens {Zett. f. wiss. Mik.,, 1885, 
p. 55), nous trouvons que le gold-size est un excellent lut, et très 
durable, pourvu qu'il soit de première qualité, 

418 . Glu marine ( <r Marine glue > ). — Se trouve dans le 
commerce, et (en Angleterre du moins) chez les opticiens. D'après 
Carpknter, la meilleure sorte est connue sous la marque GK4. On 
trouvera des formules pour la préparer, dans Cooley's Cyclopœdia. 

La glu marine s'emploie pour fabriquer les grandes cellules de 
verre ; elle est absolument indispensable pour cet objet, les autres 
ciments, du moins autant que nous les connaissons, ne possédant pas 
la ténacité nécessaire. Pour s*en servir, on en coupe de petits mor- 
ceaux avec un scalpel et on les fait fondre sur place sur le porte-objet 
en chauffant celui-ci au moment d'appliquer la cellule. On enlève le 
surplus de mastic avec de la potasse caustique. 

La glu marine est soluble dans Télher, le naphte, la potasse caus- 
tique. 

419. Mastic à la gutta-percha (Harting). — Voyez Beale, 
loc. cit. 

4 20. Mastic au caoutchouc. — Voyez Beale, ibid. 

421.— Térébenthine de Venise (Parker, Journ. Roy. Mie. Soc.^ 
1882, p. 724 ; Csokor. Arch. f. mik. Anat., 1882, p. 353). — On fait 
dissoudre de la térébenthine de Venise dans Talcool en quantité 
suffisante pour faire une solution qui se laisse filtrer; on filtre, et on 
évapore aux trois quarts sur un bain de sable. On doit obtenir une 
masse qui ne cède pas au doigt; en en laissant tomber une goutte 
dans Teau froide, elle doit se solidifier en une larme très dure, à 
fracture vitreuse. 

Pour s'en servir, on emploie un fil de cuivre courbé à angle droit, 



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LUTS ET VERMS 285 

de manière à avoir un bras de la longueur du côté des verres à cou - 
vrir(qui doivent être carrés) qu'on emploie. Onchauiïe le fil de cuivre 
et on le plonge dans la masse de térébenthine ; on le retire, et on 
applique sur le bord du verre à couvrir la térébenthine fondue qu'il 
emporte. La térébenthine se durcit immédiatement, et la préparation 
est définitivement achevée aussitôt qu'on a ainsi luté les quatre côtés 
du verre à couvrir. 

Ce mastic s'applique spécialement à la fermeture des préparations 
à la glycérine ; il est d'un emploi très commode et très sûr, et possède 
une grande ténacité. 

On peut se servir de la térébenthine ordinaire du commerce ; et il 
n'est pas nécessaire de la dissoudre dans Talcool, 

422. Colophane et cire. (Krônig, Arch. f, mik. Anal., 1886, 
p. 657; Joum. Roy. Mie, Soc.j 1887, p. 344;. — Colophane, 7 à 9 
parties ; cire fondue, 2 parties. On ajoute la colophane par petits mor- 
ceaux à la cire, on filtre et laisse refroidir. Pour l'emploi, on fait 
fondre la masse en mettant le récipient qui la contient dans de l'eau 
chaude. Ce mastic résiste à l'action de l'eau, de la glycérine et de la 
potasse caustique. 

423. Baume et paraffine (Apathy, Zeù, /". iviss, Mik,, VI, 2, 
1881), p. 171). — Parties égales de baume du Canada et de paraffine 
dure (fondant à 60^ C). Chauffer ensemble jusqu'à ce que la masse 
prenne une teinte dorée et ne dégage plus de vapeurs de térében- 
thine. Au refroidissement la masse devient dure; pour l'emploi on 
chaufi'e et on l'applique avec un agitateur de verre ou une spatule de 
laiton. Pour les préparations à la glycérine, il suffit d'une seule appli- 
cation. Ce mastic ne s'introduit jamais dans le liquide de la prépara- 
tion et ne se fendille pas en séchant. 

Voyez aussi la méthode (plus compliquée) de Julien, dans Joum. 
Roy. Mie. Soe., 1893, p. 867. 

424. Paraffine simple. — On fait des bordures temporaires ou 
préliminaires avec la paraffine en l'appliquant avec une aiguille cour- 
bée, comme nous venons de le dire pour la térébenthine, n^ 421. 

425. Baume de Canada. Damar. — On emploie quelquefois ces deux 
résines pour fermer les préparalions dans les liquides. LÀ meilleure manière 
de les employer est de faire une cellule avec le baume ou le damar, en se 
servant de la tournette, de déposer au milieu de cette cellule Tobjet dans 
une goutte du liquide d^inclusion; et de poser le verre à couvrir qu*on fait 



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2S6 CHAPITRE XX 

adhérer à la cellule par une légère pression. Après une expérience assez 
prolongée de cette méthode, nous devons dire que ni le baume ni le damar 
ne méritent confiance comme luts ; avec le temps ils fmissent toujours par 
s*imbiber du liquide de la préparation, deviennent poreux et perdent leur 
ténacité. 

426. Vernis à, Fambre. — D*après Behrens {Zeiû. f.toiss, Mik.j 
1888, p. S4), ce vernis constituerait un mastic d'une très grande 
durée, et serait peut-être supérieur à tous les autres sous ce rapport. 

Behrens n'indique pas la composition de son vernis, qu'il s'éiail 
procuré chez E. Pfannenschmidt, à Dantzig. Nous trouvons dans 
Cooley's Cyclopmdia la formule suivante : On fait fondre 6 parties 
d'ambre, et on ajoute 8 parties d'huile de lin dégraissée chaude ; on 
fait bouillir jusqu'à ce que la masse devienne filante ; on laisse un peu 
refroidir et on ajoute 16 parties, ou une quantité suffisante d'essence de 
térébenthine. Ce vernis est très dur, et Tun des plus durables des ver- 
nis à l'huile. 

427. Vernis à Fambre et au copal (Heydenreicq, Zeit, f. wiss, 
Mik,, 188S, p. 338). — Heydenreich recommande comme étant d'une 
solidité à toute épreuve un mélange de vernis copal et vernis à l'ambre. 
Comme la préparation de ce mélange est extrêmement longue et 
compliquée, nous pensons que peu d'anatomistes voudront ^e donner 
la peine de l'entreprendre ; d'autant plus, que l'on peut se procurer 
le mélange préparé d'après la formule de Heydenreich chez Ludwig 
Marx, à Saint-Pétersbourg, Moskowskaja Sastawa, n® 110; ou à 
Vienne, Gaden, n° 79 ; ou à Mayence, Roemerthal, n^l. On trouvera 
des instructions très détaillées pour le préparer soi-même, loc, cit. 

428. Gomme-laque (Beale, loc. cit,). — Solution épaisse de gomme- 
I.'ique dans Falcool. Nous croyons que cette solution ne mérite pas grande 
confiance comme lut. Le Mie. hict. recommande d'ajouter XX gouttes 
d'huile de ricin par 30 ce. de la solution. Comme vernis, la gomme-laque 
sert à protéger les bordures contre l'essence de cèdre employée avec les 
objectifs à immersion homogène. 

Pour une méthode un peu compliquée pour la préparation de gomme- 
laque chimiquement pure (ce qui offre de sérieux avantages), voyez Witt, 
dans Zeit. f. wiss. MiL, 111, 1886, p. 199. 

4SI9. Cire à cacheter. — Solution très épaisse (ayant la consistance 
d*un mastic) de cire à cacheter dans l'alcool. Nous conseillons de ne pas 
l'employer comme lut, mais seulement comme vernis, et nous pensons que 
môme pour cela elle n'est pas recommandable. Avec le temps elle devient 
cassante et s'écaille. 



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L€TS ET VERNIS 287 

430. Baume de tolu (Garnoy, Biologie cellulaire, p. 129). 

Baume de tolu 2 parties. 

Baume de Canada 1 — 

Gomme-laque en sol. sat. dans le chloroforme. 2 — 

On ajoute assez de chloroforme pour porter le mélange jusqu'à con- 
sistance sirupeuse. D'après Carnoy, ce mélange est le meilleur de tous i 
les luts. 

431. Mastic blanc de Ziegler. — Composition inconnue. Se 
trouve chez les fournisseurs de microscopie en Allemagne et en France. 
Ce mastic est très employé en Allemagne. 

422. Mastio au blanc de zinc (Stieda, Arch, f, mik. Anal., 1866^ 
p. 435). — On hroie de Toxyde de zinc avec de la térébenthine, et Ton 
ajoute, en remuant, pour 1 partie de Toxyde, 8 parties d'une solution siru- 
peuse de résine damar dans Tessence de térébenthine. On obtient un mastic 
blanc qui ressemble à celui de Ziegler. Pour avoir un mastic rouge, on 
prend au lieu de zinc deux fois autant de cinabre. Ce mastic peut être 
«lUongé avec de l'essence de térébenthine, de Téther ou du chloroforme. 
Nous devons ajouter que plusieurs auteurs se sont occupés récemment du 
c zinc white cernent >, et que tous sont d'accord pour trouver que ces com- 
positions ne valent rien comme luts ; tout au plus peuvent-elles être utiles 
comme vernis. 

433. Aspinall's Enamel. — C'est un vernis breveté, à demander 
rhez les fournisseurs d'articles anglais. Stanley Kent {Joum. Roy. 
Mie. Soc., 1890, p. 82i) le trouve très commode pour faire des cel- 
lules ou des bordures. 



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DEUXIÈME PARTIE 

MÉTHODES SPÉCIALES ET EXEMPLES 



Dans celte deuxième par lie ^ nous donnons les détails de certaines 
méthodes spéciales quCy dans Cintérét de la clarté de Vexposition, 
nous n'avons pu admettre dans notre première partie. Nous y avons 
ajouté une série de paragraphes contenant un résumé des méthodes 
qui ont été employées par les anatomistes pour V étude d'objets dif- 
ficiles. Nous prions l'étudiant de bien vouloir considérer ces para- 
graphes à titre de renseignements historiques , et non à titre de 
modèles à copier. Comme renseignements historiques^ ils doivent 
lui être utiles y en lui enseignant ce qui a été déjà fait dans telle ou 
telle direction ; cette connaissance est une condition essentielle de 
tout perfectionnement dans les méthodes. Vouloir s'en servir à titre 
de modèles à copier, et s'en tenir là^ serait faire preuve d'un esprit 
conservateur antiscientifique ^ et aboutirait à fermer la porte à tout 
progrès. Ajoutons que^ si dans les études faciles — dans cette ana- 
tomie microscopique qui est presque de Vanatomie macroscopique 
— on peut se servir de méthodes simples et peu variées^ il en est 
tout autrement dans les recherches vraiment délicates. Là^ il ne 
saurait être question de copier les méthodes imaginées par les autres 
ou par soi-méîne ; car — c'est une vérité incontestable — chaque 
objet demande un traitement différent. On n'est histologiste qu'au- 
tant qu'on a acquis le don de deviner la diversité du traitement 
approprié à chaque objet d'étude; et l'on n'acquiert ce don que par 
l'étude patiente et minutieuse de la nature des objets auxquels on a 
affaire. 



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CHAPITRE XXI 

INJECTIONS. MASSES A LA GÉLATINE 



434. Introduction. — Les masses à injection sont composées 
d'une matière colorée dite masse colorante^ et d'un corps incolore 
propre à donner la consistance voulue, qu'on appelle le véhicule. 

Nous pensons que pour Tétude de Tangiologie des Vertébrés l'étu- 
diant fera bien de suivre de près les instructions magistrales de 
Robin et de Ranvier. Pour les injections dlnvertébrés (et même pour 
les Vertébre's s'il s'agit de démontrer en même temps que la distribu- 
tion des vaisseaux les fins détails de tissus environnants) les masses à 
la glycérine sont souvent à préférer, et nous recommandons particu- 
lièrement les formules de Beale au bleu de Prusse. L'emploi de masses 
à la glycérine a cependant un inconvénient lorsqu'il s'agit de l'injec- 
tion de pièces tout à fait fraîches, nous voulons dire de celles dans les- 
quelles la rigidité cadavérique ne s'est pas encore établie; c'est que ces 
masses excitent la contraction des artères, ce qui fait naturellement 
obstacle à l'introduction de la masse. Cet inconvénient se laisse sou- 
vent écarter par l'emploi du nitrile d'amyle comme vaso-dilatateur 
(paragraphe suivant). 

435. Nitrite d'amyle comme vaso-dilatateur. — D'après 
OviATT et Sargent {si Louis Med. Journ., 1886, p. 207 ; Journ. Roy. 
Mie. Soc., 1887, p. 341), il suffit souvent d'aneslhésier le sujet par un 
mélange d'éther et de nitrite, et de l'asphyxier ensuite avec du nitrite 
pur. Puis ils recommandent qu'après que la mort a été amenée par 
l'exhibition du nitrile, on fasse une injection préalable d'un peu de 
nitrite dans de la solution physiologique de sel avant de pousser la 
masse colorée. Et en tout cas il est bon d'ajouter un peu de nitrite à 
la masse d'injection au moment de s'en servir. L'effet dilatateur de 
ce réactif est très grand. 



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INJECTIONS. MASSES A LA GÉLATINE 291 



FORMULES DE ROBIN 

436. Véhloule à la gélatine (Robïn, Traité du Mie, et des Injec- 
tions, p. 30). — On prend de la colle de Paris, on la laisse ramollir 
dans Teau, et on la fait dissoudre au bain-marie dans 7, 8, 9 ou même 
10 parties d*eau. Selon Robin, c'est une erreur commune d'employer 
des solutions trop concentrées de gélatine. Ce véhicule peut mainte- 
nant être combiné avec la masse colorante au carmin, n**438, avec la 
masse de ferrocyanure de cuivre, n** 439, avec, le bleu de Prusse, 
n® 440, avec le cadmium, n° 441, avec le vert de Scheele, n''44â, avec 
des couleurs à Taniline insolubles dans Teau, mais qui se laissent 
mêler au véhicule après avoir été' dissoutes dans un peu d'alcool (dans 
ce dernier cas, il faut prendre la glycérine au lieu d'alcool pour la 
conservation des pièces injectées). 

Si Ton désire conserver ce véhicule pendant quelque temps, il faut 
prendre des précautions pour prévenir le développement de moisis- 
sures. Ni le camphre ni l'acide phénique ne suffisent. On peut couvrir 
la gélatine d'une couche d'alcool ; la gélatine devient opaque, mais 
retrouve sa transparence aussitôt que l'alcool a été chassé par la cha- 
leur. Ou bien on peut suspendre au bouchon du flacon qui la contient 
une éponge imbibée d'alcool et de quelques gouttes d'essence de téré- 
benthine, en veillant à ce que l'éponge ne touche pas la gélatine. 

D'après HoYER(/?^o/. CentralbL, 1882, p. 20-21), Thydrate de chlo- 
ral sert à conserver toutes ces masses. Il faut en ajouter plusieurs 
centièmes, au moins 2 p. 100. 

437. Véhicule à la gélatine glycérlnée .(I^obin, loc, cit., 
p. 32). — On fait dissoudre au bain-marie 80 grammes de colle de 
Paris dans 300 ce. d'eau contenant de Tacide arsénieux en dissolution, 
on ajoute 150 grammes de glycérine et quelques gouttes d'acide phé- 
nique. A combiner avec l'une des six masses colorantes des six for- 
mules qui vont suivre. 

Ce véhicule se conserve indéfiniment. 

438. Masse au carmin (Robin, loc. cit., p. 33). — On broie dans 
un mortier 3 grammes de carmin avec un péuii''ca'u et assez d'ammo- 
niaque pour dissoudre le carmin. On ajoute 80 grammes de glycé- 
rine, et l'on filtre. 

On mêle ensemble 8 grammes d'acide acétique et 43 grammes de 
glycérine, et l'qn ajoute le mélange peu à peu au carmin, jusqu'à ce 



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292 CHAPITRE XXI 

qu'on ait obtenu une réaction faiblement acide, ce dont on s'assure à 
l'aide d'an morceau de papier tournesol humecté et tenu au-dessus du 
mélange. 

On combine 1 partie de cette masse colorante avec 3 ou 4 parties 
du véhicule numéro 436 ou du véhicule numéro 437, ou du véhicule 
à la glycérine el alcool, ci-après, numéro 473. 

439. Masse au ferrocyanure de cuivre (Robin, loc. cii.^ p. 34). 

(1) — Ferrocyanure de potassium (sol. concentrée) ... 20 ce. 

Glycérine 50 — 

(2) — Sulfate de cuivre (sol. concentrée) 35 ce. 

Glycérine 50 — 

On mêle peu à peu, et en agitant, les solutions (1) et (2). Au moment 
de s'en servir on combine le mélange avec 3 volumes de l'un des 
véhicules, numéros 436, 437 ou 473. 

440. Bleu de Prusse (Robin, loc. cit., p. 35). — On prend : 

{{ — Salfocyanure de potassium (sol. sat.) 90 ce. 

Glycérine 50 — 

(2) — Perchlorure de fer liquide, à 30*^ 3 gr. 

Glycérine 50 — 

On môle peu à peu les deux solutions, et l'on combine le mélange 
avec 3 volumes de l'un des véhicules, numéros 436, 437 ou 473. 

441. Cadmium (Robin, loc, cit., p. 36). — Prenez : 

(1) — Solution saturée de sulfate de cadmiun 40 ce. 

Glycérine 50 gr. 

(2) — Solution saturée de sulfure de sodium 30 ce. 

Glycérine 50 gr. 

Mêlez, en agitant, (1) et (2), et combinez avec 3 volumes de Tun des 
véhicules, numéros 436, 437 ou 473. 

442. Vert de Scheele (Robin, loc. cit., p. 37). — Prenez : 

(1) — Arséniate de potasse fsol. sat.) 80 ce. 

Glycérine 50 gr. 

(2) — Sulfate de cuivre (sol. sat.) 40 ce. 

Glycérine 50 gr. 

Mêlez les deux solutions (1) et (3), et combinez avec 3 volumes de 
l'un des véhicules, numéros 436, 437 ou 473. 



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INJECTIONS. MASSES A LA GÉLATINE 293 

443. Couleurs à l'aniline (Robin, loc. cit., p. 37). — On peut em- 
ployer des couleurs à Taniline comme matière colorante, à coadition de 
choisir des couleurs qui ne soient pas solubles à Teau, et d'éviter l'emploi 
de Talcool dans le traitement ultérieur des pièces injectées. Robin recom- 
mande de dissoudre dans un peu d'alcool le bleu d'aniline, le violet d'ani- 
line ou le jaune d'aniline, et de les combiner avec l'un des véhicules que 
nous avons cités. Les pièces peuvent être conservées dans la glycérine. Nous 
croyons que l'on n'a pas jusqu'ici trouvé le moyen d'employer les couleurs 
d'aniline d'une manière satistaisante pour les injections. 



MASSES AU CARMIN 

444. Masse au carmin et à la gélatine (Ranvier, Traité 
technique, p. ii6). — On prend 8 grammes de gélatine de Paris qu'on 
laisse ramollir dans l'eau pendant une demi-heure à une heure ; on la 
lave à Teau distillée, on 'la laisse égoutter et on fait fondre au bain- 
marie. On ajoute peu à peu, et en remuant constamment, une solution 
de carmin préparée en broyant 2^%8 de carmin avec un peu d'eau 
distillée et assez d'ammoniaque pour donner une solution transpa- 
rente. 

On doit maintenant avoir environ 15 ce. de solution ammonia- 
cale de carmin dans la gélatine. Il s'agit alors de rendre cette 
solution aussi complètement neutre que possible. C'est un point très 
important; car, pour peu que la solution soit ammoniacale, elle 
diffuse dans les tissus ; et si au contraire il y a un excès d'acide, le car- 
min se précipite en granulations qui rendent l'injection opaque par 
places, et peuvent même boucher les petits vaisseaux. Voici comment 
on peut obtenir la neutralisation complète de la masse. On maintient 
la gélatine carminée dans le bain-marie, et l'on ajoute, goutte à 
goutte, en remuant avec une baguette de verre, un mélange de 
1 partie d'acide acétique cristallisable avec 2 parties d'eau. C'est par 
l'odeur que l'on reconnaît le moment où il faut cesser d'ajouter de 
l'acide acétique. Le mélange carminé exhale d'abord une forte odeur 
d'ammoniaque; à mesure que l'on ajoute de l'acide acétique, cette 
odeur diminue, et il arrive un moment où elle est transformée en une 
odeur aigre. C'est le moment où il faut s'arrêter. Pour y arriver plus 
facilement, il est bon d'étendre, vers la fin de l'opération, la solution 
d'acide acétique avec de l'eau. Si, en examinant la liqueur au micros- 
cope, on reconnaît la présence de granulations, il faut considérer la 
masse comme perdue. 

Ranvier trouve qu'il n'y a pas d'autre moyen certain d'arriver à la 
neutralisation parfaite. Il ne faut pas avoir confiance dans certaines 



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294 CHAPITRE XXI . 

-formules d'injections dans lesquelles les auteurs ont indiqué des 
proportions d'ammoniaque et d'acide acétique qui doivent se neutra- 
liser. Les solutions d'ammoniaque que l'on a dans les laboratoires 
présentent en effet des richesses très diverses. La méthode de titrage 
de l'acide acétique et de l'ammoniaque dont on se sert, proposée par 
Frey, est également illusoire, parce qu'il arrive très souvent que la 
gélatine du commerce est acide, ce qui peut conduire à dépasser le 
point de neutralisation. 

La masse ayant été neutralisée, on la filtre sur de la flanelle 
neuve. 

445. Masse an carmin et à la gélatine (Ville, Gaz. hebd, d. 
Sciences méd. de Montpellier^ fév. 1882 ; à part, Delahaye et Lecrosnier, 
Paris, 1882). — Ville trouve, comme Ranvier, que le procédé de titrage 
recommandé par Frey est défectueux, non pas tant à cause de l'acidité des 
gélatines du commerce que pour un autre motif. En effet, lorsqu'on traite le 
carmin par Tammoniaque, une certaine partie de l'ammoniaque se fixe sur 
le carmin pour donner une combinaison transparente rouge pourpre; et il 
reste un excès d'ammoniaque ; c'est la neutralisation de cet excès qu'il faut 
atteindre. Or, d'après la méthode de Frey, il faudrait employer une quantité 
d'acide suffisante pour neutraliser toute la proportion d'ammoniaque 
qu'on a ajoutée au carmin. Iln'est donc pas étonnant qu'on dépasse le 
point de neutralisation et qu'on obtienne une masse granuleuse. 

Quant à l'acidité de la gélatine du commerce, on peut d'une manière 
bien simple se mettre à l'abri de cette cause d'erreur. Voici comment on 
y arrive: — au lieu de plonger la gélatine dans un bain d'eau, on la place 
dans un entonnoir effilé assez grand, ou mieux, dans un entonnoir à 
robinet. On dispose le tout sous une fontaine et on règle le filet d*eau 
de manière que la gélatine soit bien immergée. On lui fait subir un lavage 
prolongé (une heure environ) qui lui enlève les traces d'acide mécani- 
quement retenu. Ville a constaté que des gélatines franchement acides 
perdent bien vite cette réaction quand on les soumet à ce traitement. 

Quant à la neutralisation de la masse. Ville trouve que le critère de la 
neutralisation donné par Ranvier — l'odeur aigre qui succède à l'odeur 
ammoniacale — est peu sûr à réaliser dans la pratique. Car, après une 
série d'essais, le sens olfactif s'émousse, et cela juste au moment où il 
faudrait qu'il intervint avec le plus de finesse en vue de la neutralisation 
partielle déjà accomplie, ce qui rend l'investigation très difficile. 

Il est bien préférable, selon Ville, de se servir de papier de tournesol 
sensibilisé, ou dichroïque, qui, comme on le sait, peut être indistincte- 
ment appliqué à la recherche des acides ou des bases. 

Pour préparer ce papier, on acidulé légèrement, par un excès d'acide 
sulfurique, la teinture obtenue par décoction de pain de tournesoL On 
neutralise ainsi l'excès d'alcali ou de carbonate alcalin que renferme tou- 
jours cette décoction et qui diminue la sensibilité du réactif. On agite à 
chaud avec un excès de carbonate de baryte précipité, et on filtre. 

Cette solution sensible de tournesol est exposée à l'air dans de larges 
vases, jusqu'à ce que sa couleur bleue intense ait fait place à une teinte 



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IISJEGTIONS. MASSES A LA GÉLATINE 205 

rougeâtre. On immerge dans cette solution des bandes de papier blanc non 
collé, que Ton fait sécher ensuite à l'ombre, sur des fils tendus, en ayant 
bien soin d'éviter la présence des vapeurs ammoniacales. 

Si cette opération paraît trop longue, on peut se contenter d'ajouter à 
la teinture de tournesol des laboratoires de l'acide sulfurique très dilué, 
goutte à goutte jusqu'à la coloration rouge. Alors, par l'addition successive 
de traces d'alcali et d'acide sulfurique en solutions très étendues, on cher- 
chera à obtenir la teinte rougeâtre ou dichroïque. La teinture de tournesol 
ainsi sensibilisée sert à préparer le papier, en opérant comme dans le pre- 
mier cas. 

Ce papier de tournesol sensibilisé permet de déceler des traces infinité- 
simales de vapeurs ammoniacales; Ville a constaté qu'il donne une réaction 
très nette et très rapide alors que le sens olfactif le mieux doué était depuis 
longtemps impuissant à percevoir la moindre odeur ammoniacale. 

On emploie ce papier, comme le papier réactif ordinaire, en le mouillant 
d'eau distillée, et en l'approchant aussi près que possible de la masse à 
injection maintenue au bain-marie. Il bleuit d'abord très vite et très nette- 
ment ; mais, à mesure qu'on ajoute de nouvelles quantités d'acide, cette 
réaction s'affaiblit, et bientôt le changement de couleur ne se fait que d'une 
façon très lente. C'est à ce moment qu'il faut cesser l'addition d'acide ; 
l'opération est terminée. 

On peut aussi préparer du papier sensibilisé d'une grande délicatesse 
avec d'autres réactifs, le réactif de Nessler, l'hématoxyline en solution 
alcoolique, et, surtout, une solution faite ainsi qu'il suit : — on prend de 
la liqueur orange numéro 3 (liqueur qui se trouve dans le commerce, 
et qui est employée pour la reconnaissance des acides); on y ajoute une 
trace d'acide sulfurique dilué ; la liqueur change d'aspect et prend une 
coloration groseille. 

On peut faciliter la préparation de la masse à injection en tenant une 
provision d'acide acétique et d'ammoniaque de concentration connue. 
Avec l'acide acétique on n'aura pas de difficulté ; il suffit de conserver de 
l'acide cristallisable dans un fiacon bien bouché. Mais il n'en est pas de 
même pour la solution ammoniacale. Il ne suffit pas de la maintenir dans 
un vase hermétiquement fermé, car les transvasements à l'air libre, surtout 
s'ils étaient répétés, feraient varier d'une manière notable la richesse de la 
solution. Ville a imaginé un appareil qui permet de conserver la solution 
d'ammoniaque dans un vase hermétiquement clos, et d'en soutirer à volonté 
une quantité connue sans que l'air ait accès sur le reste de la solution. Nous 
ne pouvons donner ici la description de cet appareil, qui serait longue et ne 
serait pas compréhensible sans les figures destinées à l'expliquer ; on trou- 
vera la description et la planche des figures dans le mémoire original de 
Ville. 

Sauf les différences que nous avons mentionnées, Ville prépare la masse 
à injection selon les prescriptions de Ranvier. 

446. Masse au carmin et â la gélatine (Hoyer, BioL Cen- 
tralb.y 1882, p. 21). — A une solution concentrée de gélatine on 
ajoute une quantité correspondante de solution ammoniacale de car- 
min neutralisée; on fait digérer le mélange au bain-marie jusqu'à ce 



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296 CHAPITRE XXI 

que sa couleur rouge violet commence à passer à une nuance rouge 
clair; on ajoute 5 à 10 p. 100 de glyce'rine; et au moins 2 p. 100 d'hy- 
drate de chloral (en solution forte), on filtre à travers de la flanelle, 
et Ton conserve la masse dans une capsule couverte par un globe de 
verre. Elle se maintient sans altération pendant des mois. 

447. Masse au carmin et âla gélatine {Fol ^Zeit. wiss, ZooL 
1883, p. 492, et Lehrb., p. 13). — On prend 1 kilogramme de géla- 
tine fine ' qu*on laisse ramollir pendant deux ou trois heures dans 
une faible quantité d'eau. On la fait fondre, et on ajoute 1 litre de 
solution ammoniacale concentrée de carmin (solution forte d'ammo- 
niaque, 1 partie; eau, 3 ou 4 parties; carmin, à saturation; filtrer, 
pour enlever l'excès de carmin qui doit se trouver dans la solution). 
On agite continuellement pendant que l'on verse le carmin. On neu- 
tralise h peu près (il n'est pas nécessaire que la neutralisation soit 
complète, pourvu qu'on ne la dépasse pas, ce qui précipiterait le car- 
min) avec de l'acide acétique. On laisse la masse se solidifier, et on la 
découpe en morceaux qu'on enveloppe dans du tulle ou dans un filet 
fin. On pétrit la masse ainsi enveloppée avec la main dans de l'eau 
contenant 0,1 p. 100 d'acide acétique; par la pression la masse est 
exprimée à travers les mailles du filet sous forme de vermicelles. On 
lave ces vermicelles pendant plusieurs heures sur un tamis à travers 
lequel on fait passer un courant d'eau. On les fait fondre et on verse 
la masse fondue en une couche mince sur du papier parchemin imbibé 
de paraffine. On met les feuilles de papier sécher dans un endroit 
sec. Lorsque la masse est sèche, elle se laisse séparer du papier sous 
forme de feuilles qu'on découpe en bandes avec des ciseaux, et qu'on 
met dans un flacon pour les conserver. Pour s'en servir, il n'y a 
qu'à ramollir dans l'eau pendant quelques minutes la quantité 
voulue, et la faire fondre au bain-marie dans 10 à 20 parties 
d'eau. 

Les avantages de cette méthode de préparation sont : que la masse 
se conserve indéfiniment, ce qui, selon Fol, ne serait pas le cas avec 
la masse au chloral de Hoyer; et que sa préparation est facile, vu 
qu'elle exige moins que les autres masses la neutralisation exacte de 

la solution dé carmin. 
On peut simplifier ce procédé de la manière suivante, sans que les 

résultats en soient de beaucoup inférieurs. On prend de la gélatine en 

Fol recommande la gélatine photographique qu'on se procure à la Simeon's 
(ielatine-fabrlky NVinterlhur (Suisse) ; il est probable que la gélatine prologra- 
phique de Coignet, à Paris, donnerait le même résultat. 



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INJECTIONS. MASSES A LA GÉLATINE 297 

lames (ou mieux de la gélatine photographique molle). On laisse 
macérer ces feuilles pendant deux jours dans une quantité suffisante 
de la solution de carmin que nous avons décrite. On les rince et on 
les met pendant quelques heures dans de Teau acidulée par Tacide 
acétique. Puis on les lave pendant plusieurs heures sur un tamis avec 
de Teau courante; on les sèche sur du papier parchemin, et on con- 
serve comme nous l'avons dit. 

448. Antres masses au carmin et à la gélatine. •— Gerlacu 
{Arch. f. mik. Anat., 1865, p. 148, et le Traité de Ranvier, p. 118). — 
Thiersch {Arch. /*. mxL AnaL, 1865, p. 148). — Carter (Beale, How to 
worL, etc., p. 113). — Davies (Prcp. and Mounting of Mie. Objects, 
p. 138). 

masses bleues 

449. Bleu de Prusse de Robin. — Voyez numéro 440. 

450. Bleu de Prusse de Ranvier {Traité, p. 119). — On prend 
1 partie de gélatine solide et 2S parties de solution saturée de blieu 
de Prusse (préparée comme nous le dirons tout à l'heure). Laisser 
ramollir la gélatine une demi-heure à une heure dans Teau ; la laver 
à Teau distillée et la faire fondre dans une éprouvette au bain-marie. 
Mettre la solution de bleu de Prusse dans une autre éprouvette 
plongée dans le même bain-marie, pour la maintenir à la même tem- 
pérature que la gélatine. Verser la gélatine peu à peu dans le bleu 
de. Prusse; maintenir le mélange dans le bain-marie et remuer 
continuellement avec un agitateur de verre jusqu'à ce que le 
précipité grumeleux qui s'est formé au premier moment ait disparu. 
On constate que le bleu est parfaitement dissous lorsque la baguette 
de verre retirée du liquide ne présente pas de granulations bleues à 
sa surface. Filtrer sur de la flanelle neuve, et maintenir Tinjection 
au bain-marie à la température de 40^, jusqu'à ce qu'on en remplisse 
la seringue. 

Il y a des gélatines avec lesquelles il se produit un précipité persis- 
tant; il faut les rejeter absolument; mais il faut savoir que le préci- 
pité qui se forme toujours, même avec la meilleure gélatine, disparait 
quand on continue de chauffer. 

La solution de bleu de Prusse se prépare ainsi : 

On prend une solution concentrée de sulfate de protoxyde de fer 
dans Teau distillée, et on la verse lentement dans une solution con- 
centrée de prussiate jaune de potasse : il se précipite du bleu de 



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■ JIVPH n 



298 CHAPITRE XXI 

Prusse insoluble. A la fln de Topération il doit rester un excès de 
prussiate de potasse dans la liqueur, ce dont on s*assure en en pre- 
nant une petite portion et en constatant qu'une nouvelle goutte de 
sulfate de fer y donne encore un précipité. On filtre sur une chausse 
de feutre. Au-dessous de celle-ci est disposé un entonnoir de verre 
avec un filtre en papier. Le liquide coule d*abord clair et jaunâtre 
dans l'entonnoir inférieur. On ajoute par petites quantités de Teau 
distillée dans la chausse, et Ton continue à laisser filtrer; peu à peu 
le liquide sort de la chausse légèrement teinté en bleu, mais au-des- 
I sous du second filtre il ne présente pas cette coloration. On continue 

f ainsi pendant plusieurs jours à ajouter de Teau distillée dans la 

chausse, jusqu'à ce que le liquide bleuisse au-dessous du second 
entonnoir, dans le flacon disposé pour cela. A ce moment, le bleu de 
Prusse est devenu soluble. Pour le recueillir, il faut retourner la 
chausse et l'agiter dans l'eau distillée. Le bleu s'y dissout, si la 
quantité d'eau est suffisante. 

La solution ainsi obtenue peut être conservée telle quelle pour les 
injections, mais, comme il est plus commode d'avoir une provision de 
bleu de Prusse soluble à l'état solide, il est utile de l'évaporer à 
l'étuve et de conserver le résidu solide dans des flacons. Pour s'en ser- 
vir on le fait dissoudre à saturation dans l'eau distillée; pour les 
injections il est toujours nécessaire que la solution soit saturée. 

On peut injecter cette solution telle quelle ; jamais elle ne transsude 
à travers les parois des vaisseaux. On peut aussi mélanger ce bleu de 
Prusse avec la glycérine au quart. 

Ranvier a trouvé que les injections au bleu de Prusse soluble sont 
les seules qui lui aient donné de très bons résultats. 

451. Bien de Berlin soluble (Brucke, Arch. /*. mik. Anàt., 1865, 
p. 87). — On verse dans une solulion concenlrce (10 p. 100 ou plus) de 
ferrocyanure de polassium une quantité de solulion diluée de perchlorure 
de fer telle que le poids du perchlorure qu'elle contient soit le 1/8 ou le 
1/10 de celui du ferrocyanure. On met le précipité sur une chausse, et on 
le lave avec l'eau mère jusqu'à ce qu'il ne.s'écoule plus qu'un liquide jaune; 
puis on le lave, toujours sur la chausse, avec de l'eau distillée jusqu'à ce 
que le liquide filtré passe bleu; alors on sèche le précipité, on le comprime 
dans une presse entre des feuilles de papier buvard, on brise en morceaux 
la masse comprimée, et on sèche les morceaux à l'air. 

Ou bien en emploie le procédé suivant, qui a l'avantage d'être moins 
coûteux : 

On fait une solution de ferrocyanure de potassium contenant 217 grammes 
de sel par litre d'eau, et l'on ajoute 2 volumes de solution saturée de sulfate 
de soude. On fait aussi une solution de 1 partie de chlorure de fer sec du 
commerce dans 10 parties d'eau, et on ajoute également 2 volumes de solu- 



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INJECTIONS. MASSES A LÀ GÉLATINE 299 

lion saturée de sulfate de soude. Ou ajoute, en remuant, 1 volume de la 
solution de chlorure à 1 volume de la solution de ferrocyanure. On met sur 
une chausse le précipité qui se forme, on le lave et on traite pour le reste 
comme ci-dessus. 

Pour se servir de ce bleu soluble, on en combine la solution saturée avec 
assez de gélatine pour former une gelée après refroidissement. Chauffer à 
60® environ, et injecter avec une seringue chauffée ; il n'est pas nécessaire 
de chauffer le sujet. Il vaut mieux, selon Brûcke, éviter la glycérine pour 
monter les pièces, la glycérine ayant pour effet de faire pâlir la couleur 
(nous pensons cependant que la glycérine doit suffire à conserver la cou- 
leur, si elle est acidulée par Tacide acétique (1 p. 100 environ). 

452, Bleu de Prusse (Thiersch, Arch. f. mik. Anal., 1865, 
p. 148). — On prend : 

1** Une solution saturée de sulfate de fer; 

2® Une solution saturée de prussiate rouge (ferrîcyanure) de potas- 
sium; 

3** Une solution saturée d*acide oxalique; 

4° Une solution de 1 partie de gélatine dans 2 parties d'eau. 

On môle 12 ce. de la solution de sulfate de fer avec 30 grammes de 
la solution de gélatine, à une température de 25^ R. 

Puis on môle, à la même température, 24 ce. de la solution de 
ferricyanure avec 60 grammes de la solution de gélatine, et Ton 
ajoute 24 ce. de la solution d'acide oxalique. On agite bien, puis on 
ajoute le mélange de gélatine et de sulfate de fer. On maintient le 
tout à la température de 20*^ à 23° R., en remuant toujours, jusqu'à 

ce que tout le bleu de Prusse soit précipité. On chauffe alors à ^ 

l(y R., et Ton flltre sur de la aanelle. 



453. Masse au bleu de Berlin soluble (Hoyer, Arch. f. mik. 
Anat., 1876, p. 649). — Hoyer recommande de précipiter du bleu de 
Berlin, et de le mettre avec un peu d'eau dans un dialyseur. On change 
Teau extérieure jusqu'à ce que le bleu de Prusse commence à dialyser 
à travers le parchemin. On peut alors, après avoir allongé le bleu de 
Prusse avec de l'eau, le filtrer sur du papier, opération qui devient 
facile après la dialyse. 

On peut injecter la solution telle quelle, ou la combiner à la géla- 
tine. 

A cet effet, il convient de mêler d'abord une petite quantité d'une solu- 
tion très diluée et chauffée de bleu de Berlin avec une petite quantité d'une 
solution modérément diluée de gélatine ; on obtient ainsi une solution 
parfaitement claire et homogène qu'on peut alors additionner de solution 
de gélatine plus concentrée et de solution de bleu de Berlin plus concentrée. 









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1 



300 



CHAPITRE XXI 



On procède ainsi jusqu'à ce qu'on ait obtenu une masse saturée de bleu de 
Berlin, mais parfaitement homogène et transparente. Hoyer a toujours 
trouvé qu'en mêlant la gélatine et le bleu de Berlin sans cette précaution on 
obtit^iit une masse granuleuse ou grumeleuse. Par l'addition d'hydrate de 
chloral (n® 415), cette masse peut être conservée sans altération pendant 
loti g temps. 

454. Masse au bleu de Berlin (Fol, Zeit. /*. wiss. ZooL, 1883, 
p. 404; Lehrh.^ p. 14). — Fol recommande de faire une masse en 
gélatinisant le bleu de Berlin soluble du commerce, ou bien celui de 
Brûcke. Ce bleu ne se conservant pas très bien, le bleu de Prusse de 
Thierach (n** 452) lui est préférable sous ce rapport. On peut injecter 
la mrisse telle quelle, ou bien on peut la laisser solidifier et l'envelop- 
per dans du tulle ou un filet fin et la comprimer en vermicelles sous 
Feau, comme nous Tavons dit ci-dessus (n<* 447), laver ces vermicelles, 
les mettre sécher sur du papier parchemin, et les conserver dans des 
flacons. Pour s'en servir, on les laisse ramollir dans Teau et on les 
fait fondre avec une addition d'acide oxalique suffisante pour per- 
mettre d'obtenir la solution complète. (On ne peut pas faire fondre 
les vermicelles avant de les sécher, parce qu'ils ne fondent pas assez 
bien sans l'addition d'acide oxalique.) 

455. Bleu de Prusse soluble de Guignet. — Voyez Journ. de 
miavgr.y 1889, p. 94. 

AUTRES COULEURS 

456. Masse Jaune au cadmium (Robin). — Voyez numéro 441 . 

457. Masse Jaune au chromate de plomb (Toierscd, Arch. f. 
Mik. Anal,, 1865, p. 149). — On prend : 

I ' Une solution de 1 partie de gélatine dans 2 parties d'eau ; 

^' Cne solution de 1 partie de chromate neutre de potasse dans 
1 1 parties d'eau ; 

3' Une solution de 1 partie d'azotate de plomb dans 11 parties d'eau. 

On mêle 4 parties de la solution de gélatine avec i parties de la 
solution de plomb. Dans un autre récipient on mêle 4 parties de la 
solution de gélatine avec 1 partie de la solution de chromate de 
potasse. On chauffe à 25** R. et l'on mélange les deux solutions ainsi 
obtenues, en remuant constamment, jusqu'à ce que tout le chromate 
de plomb se soit précipité ; puis on chauffe à 70** R. et on filtre à 
travers de la flanelle. 



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INJECTIONS. MASSES A LA GÉLATINE 301 

Cette masse est très belle. Fol fait observer qu'il faut toujours la 
préparer au moment de s'en servir, car le chromate de potasse 
employé fait bientôt passer la gélatine à l'état insoluble. 

458. Masse jaune au chromate de plomb (Hoyer, Arch. f, mik. 
Anat., 1867, p. 136). — On prend : 

1 volume d'une solution de l partie de gélatine dans 4 parties d'eau; 
1 volume de solution saturée de bichromate de potasse ; 

I volume de solution saturée d'acétate neutre de plomb. 

On ajoute la solution de bichromate à la solution de gélatine. On chauffe 
presque à ébullition, et Ton ajoute la solution d'acétate de plomb, préala- 
blement chauffée. On laisse refroidir à la température du sang et Ton injecte 
de suite. 

On peut varier la préparation de la manière suivante : on mêle la solu- 
tion de plomb à une partie de la solution de gélatine, et la solution de 
bichromate à une autre partie ; on chauffe ce dernier mélange, et Ton y 
ajoute graduellement le premier en remuant constamment. 

II ne faut jamais mêler les solutions à une température basse, parce qu'il 
se forme alors un précipité à granulations grumeleuses. De plus, en ce cas, 
on obtient un précipité jaune vif; tandis qu'en mêlant l'acétate à une 
solution chaude de bichromate on obtient un précipité d'une belle couleur 
rouge orange. 

On peut garder en provision les solutions d'acétate et de bichromate, 
ce qui permet de préparer très rapidement la masse au moment de s'en 
servir. 

Cette masse est presque transparente, pénètre bien, même dans les lym- 
phatiques les plus fins, et, ayant une couleur beaucoup plus intense que la 
masse de Thiersch, rend les vaisseaux beaucoup plus distincts. Elle est aussi 
plus facile à manier que la masse de Thiersch, parce qu'elle se solidifie 
moins rapidement. Elle donne de bonnes images soit à la lumière transmise, 
soit à l'éclairage direct. 

459. Masse janae au chromate de plomb (Fol, Lehrh.^ p. 15). — 
On fait une solution de 60 parties d'acétate de plomb dans 100 ce. d'eau, et 
une solution de 25 parties de bichromate de potasse dans la même quan- 
tité d'eau. On mêle les deux solutions avec précaution dans un verre 
cylindrique ; il se précipite du chromate de plomb. On laisse ce précipité 
déposer, on décante, on lave le précipité à l'eau distillée, et on l'ajoute sans 
tarder à une solution de gélatine. Il ne faut pas laisser le précipité 
demeurer longtemps dans l'eau, car il s'y produirait alors des granulations 
grossières. 

Cette masse est moins belle que celle de Thiersch, mais se conserve 
mieux. 

460. Masse Jaune au nitrate d'argent (Ho yer, BioL Centralh. 
1882, p. 21). — On mêle à chaud un volume de solution concentrée 
de gélatine et 1 volume d'une solution de nitrate d'argent à 4 p. 100 ; 
on chaufTe et on ajoute une faible quantité d'une solution aqueuse 



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302 CHAPITRE XXI 

d'acide pyrogallique. L'argent se réduit en peu de secondes, et la 
masse prend une coloration brune ; elle paraît aussi brune dans les 
grands vaisseaux, mais jaune dans les capillaires. En ajoutant de la 
glycérine et de Thydrate de chloral (n^ 446), on peut la conserver 
pendamt- longtemps. Les pièces injectées peuvent être traitées par 
l'alcool, Tacide acétique, Tacide chromique, ou les bichromates, 
sans que l'injection en soit aflectée. 

461. Masses vertes (Hoyer, toc. cit,^ p. 22). — On obtient de 
bonnes masses vertes en combinant une masse bleue et une masse 
jaune. 

462. Masse au vert de Seheele (Robin). — Voyez numéro 442. 

463. Masse verte (TmERScn, Arch. f. mik. Anal., 1865, p. 149). 
— Combiner en diverses proportions la masse bleue numéro 452 
et la masse jaune numéro 457. 

464. Masse blanche au carbonate de plomb (Hartig, Fret, 
Le Microscope^ p. 190). — On fait dissoudre 125 grammes d'acétate 
de plomb dans une quantité d'eau, telle que le tout pèse 500 grammes. 

Et on fait dissoudre 95 grammes de carbonate de soude dans une 
quantité d'eau telle que le tout pèse 500 grammes. 

On mêle ces deux solutions à volumes égaux, et l'on ajoute deux 
volumes de solution de gélatine. 

465. Masse blanche au sulfate de baryte (Frey, ibid,), — 
On met dans un verre cylindrique 125 à 185 grammes de solution 
saturée de chlorate de baryte. On ajoute lentement, goutte à goutte, 
de l'acide sulfurique. On laisse de'poser pendant douze heures le pré- 
cipité qui se forme, et l'on décante. On prend le résidu mucilagineux 
formé par le précipité et on le combine à parties égales avec une 
solution concentrée de gélatine. 

Celte masse est très fine. Les pièces injectées peuvent être conser- 
vées dans l'acide chromique. 

466. Masse blanche au chlorure d'argent (Teichmann ; Frey, loc, 
cit., p. 191). — On fait dissoudre 3 parties de nitrate d'argent dans une 
solution de gélatine, et Ton ajoute 1 partie de chlorure de sodium. 

Cette masse est très fine, et n'est pas décomposée par l'acide chromique. 
Malheureusement elle noircit facilement. 



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INJECTIONS. MASSES A LA GÉLATINE 303 

467. Masse brune (Fol, Zeit, f. wiss, Zool., 1883, p. 494, et 
Lehrb., p. 16). — On fait fondre 44 grammes de sel de cuisine dans 
!âOO ce. d*eau ; on ajoute 50 grammes de gélatine, on la laisse ramol- 
lir et on la fait fondre. A la masse fondue on ajoute graduellement, 
en remuant constamment, une solution de 30 grammes de nitrate 
d'argent dans 100 ce. d'eau. (Si l'on désire avoir une masse extrê- 
mement fine, il faut allonger les deux solutions de deux ou trois 
volumes d'eau.) On laisse la masse se prendre, on l'enveloppe de 
tulle et on la traite comme nous l'avons dit pour la masse au carmin, 
numéro 447. On traite les vermicelles, à la lumière du jour, avec un 
mélange de solution saturée d'oxalate de potasse, 300 ce, et de 
solution de sulfate de fer, 100 ce, jusqu'à ce qu'ils paraissent entiè- 
rement noircis. On les lave, on les sèche, et, si on le désire, on les 
refond et on les conserve comme nous l'avons dit au numéro 447. 

Cette masse est d'un brun sèpia à la lumière transmise. Si l'on 
préfère un ton noir gris, on n'a qu'à employer dans la première 
solution â5 grammes de bromure de potassium, au lieu du sel de 
cuisine. 

468. Masse acajou (Robin). — Voyez numéro 439. 

469. Masse â la gélatine pour imprégnations (Ranher, 
Traité, p. 123). 

Solution concentrée de gélatine ... 2, 3 ou 4 parties. 
Solution de nitrate d'argent à 1 p. 100. ... 1 — 

470. Métagélatine (Fol, Lehrb,, p. 17). — La nécessité de faire 
à chaud les injections ordinaires à la gélatine complique beaucoup 
les manipulations et peut souvent compromettre la réussite de l'opé- 
ration. Dans le but d'éviter cette complication, on a proposé des 
masses mucilagineuses qui se laissent injecter à froid et coaguler 
ensuite dans les vaisseaux. Telles sont les masses au blanc d'œuf et 
à la gomme arabique. Ces masses ont l'inconvénient que le véhicule 
ne se prête pas bien à la préparation de la masse colorante ; pour 
celte raison Fol propose de leur substituer la mélagélaline. 

Si on laisse cuire une solution de gélatine additionnée d'une faible 
quantité d'ammoniaque pendant plusieurs heures, elle passe à la fin 
à un état où elle n'est plus susceptible de se coaguler par le simple 
refroidissement : c'est la métagélatine. A cette solution, liquide à 
froid, de métagélatine, on peut ajouter des masses colorantes au bleu 
de Berlin, au jaune de chrome, ou autres. Ou bien, on peut cuire la 



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304 



CHAPITRE XXI 



masse brune numéro 467 jusqu'à ce que la gélatine ait passé à l'état de 
mélagélatine. On peut ajouter à la masse de Talcool dilué ce qui lui 
donne une consistance plus liquide, et permet d'injecter les capil- 
laires les plus fins. Après injection, on met les pièces dans l'alcool 
fort ou dans l'acide chromique; dans ces liquides la masse ne tarde 
pas à se coaguler. 

D'après Fol, ces masses laissent peu à désirer sous le rapport de la 
commodité des manipulations. 



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ICI 



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CHAPITRE XXII 
INJECTIONS. AUTRES MASSES 



471. Masse au blano d'œuf (Joseph, Ber. natw^. Sect. 
Schles. Ges., 4879, p. 36-40 ; Journ, Roy. Mie. Soc, 1882, p. 274). 
— A du blanc d'œuf filtré on ajoute 4 à 5 p. 100 de solution de 
carmin. Cette masse reste liquide à froid ; elle se coagule par Tacide 
nitrique dilué, Tacide chromique ou Tacide osmique, tout en restant 
transparente; les réactifs Taltèrent peu. Utile pour Invertébrés. 

472. Masse â la gomme arabique (Bjeloussow, Arch. f. 
Anat. u. Phys.y 1885, p. 379). — On fait une solution sirupeuse de 
gomme arabique, et une solution saturée de borax dans Teau. On 
môle ces solutions en des proportions telles qu'il se trouve dans le 
mélange une partie de borax pour deux de gomme arabique. On 
obtient une masse gélatineuse, presque transparente, et presque 
insoluble dans Teau. On la broie avec de Teau distillée, qu*on ajoute 
peu à peu ; puis on la force à passer à travers un linge fin. On répète 
ces opérations jusqu'à ce qu'on obtienne une masse liquide ne conte- 
nant plus de grumeaux gélatineux en suspension. (Si l'opération a 
réussi, la masse doit se coaguler en présence de Talcool, en se dila- 
tant au double de son volume.) On combine la masse avec la matière 
colorante que Ton veut, à l'exception toutefois du cadmium et du 
cobalt ; le carmin est peut-être le plus à recommander pour les injec- 
tions fines. Après injection, on met les pièces dans l'alcool ; la masse 
s'y prend immédiatement, en augmentant de volume comme nous 
l'avons dit, ce qui fait que les vaisseaux se montrent toujours large- 
ment distendus. 

Chez les animaux à sang froid, on peut pratiquer l'injection sur le 
vivant. Les pièces se conservent bien dans l'alcool. La glycérine les 

ANAT. HICROSC* 20 



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306 



CHAPITRE XXII 



rend très transparentes. La masse ne s'écoule pas des vaisseaux 
coupés. Désire-t-on éloigner la masse d'une partie de la préparation, 
on ie fait facilement à Taide d'acide acétique dilué, qui la dissout. 
Cette masse est très facile à préparer et commode à manier. 

MASSES GLYCÉRIQUES A INJECTER A FROID* 

473. Masse de carmin à la glycérine (Robin, Traité du Mie, 
p. 33). — On fait le mélange suivant pour servir de véhicule : 

Glycérine 2 parties. 

Alcool i — 

Eau i — 

On combine 2 ou 3 volumes de ce véhicule avec 1 volume de la 
masse colorante au carmin numéro 438. 

474. Masse de carmin â la glycérine (Bbale; Ranvier, 
Traité, p. 119). — On fait dissoudre 2S centigrammes de carmin 
dans V ou VI gouttes d^ammoniaque et l'on ajoute 15 grammes de 
glycérine. Puis on ajoute encore graduellement 15 grammes de gly- 
cérine acidulée avec VllI à X gouttes d'acide acétique. On ajoute 
enfin un mélange de 15 grammes de glycérine, 3^,5 d'alcool et 
1U^,5 d'eau. 

Ranvier dit avoir essayé ce liquide et avoir eu de mauvais résul- 
tais. Nous devons dire que nous l'avons essayé, et que nous avons 
eu des résultats assez satisfaisants pour que nous puissions le recom- 
mander comme étant très commode, quoiqu'il ne donne sans doute 
pas des résultats qui puissent prétendre à la beauté esthétique. Il 
faut avoir soin de ne pas trop neutraliser avec l'acide acétique. 

475. Bleu de Prusse â la glycérine (Robin, Traité, p. 35). — 
A â volumes du véhicule glycérique numéro 473, on ajoute 1 volume 
de la masse colorante au bleu de Prusse, numéro 440. 

1 Les masses à la glycérine sont importantes parce que, sMnjectant à froid, 
elEes sont très commodes à employer. Et il nous semble qu'on ne peut pas nier 
qu'elles donnent de bons résultats. Nous avertissons qu'elles ont toutes un défaut 
lorsqu'il s'agit de l'injection des pièces fraîches, c'est-à-dire dans lesquelles la 
rigidité cadavérique ne s'est pas encore établie. C'est que la glycérine provoque 
la contraction des artérioles. Ces contractions sont souvent si violentes qu'il 
titi faut rien de moins qu'une masse très expérimentée pour vaincre la résis- 
tance qu'elles opposent au passagede la masse. Nous avons indiqué au numéro 435 
une manière de remédier à cet inconvénient. 



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INJECTIONS. AUTRES MASSES 307 

476. Bleu de Prusse â la glycérine (Ranvier, Traité, p. 120). 
— Trois volumes de solution saturée de bleu de Prusse dans Teau 
(n° 450) et un volume de glycérine. 

477. Bleu de Prusse â la glycérine (Bbale, How to work, etc., 
4* éd., p. 93). — On fait dissoudre 75 centigrammes de ferrocyanure 
de potassium dans un mélange de 6*', 5 de glycérine avec 22^', 5 
d'eau. On fait aussi un mélange de Ip',75 de teinture de perchlo- 
rure de fer avec S»' ,5 de glycérine et 22»' ,5 d'eau. On ajoute très 
graduellement ce dernier mélange à la solution de ferrocyanure, en 
agitant constamment et vigoureusement dans un flacon. On ajoute 
enfin, graduellement, en agitant to\jjours, un mélange de 28 grammes 
d'alcool avec 66 grammes d'eau. 

Les pièces injectées doivent être conservées dans la glycérine aci- 
dulée avec environ 1 p. 100 d'acide acétique ; ou bien dans le baume 
de Canada. 

Cette masse n'est pas très belle dans les capillaires, mais elle j| 

pénètre bien, elle est facile à préparer, et, d'après notre expérience, ^ 

nous pouvons la recommander comme étant très commode et très .| 

utile. Nous lui préférons toutefois la suivante. \ \ 

478. Bleu de Prusse â la glycérine pour injections très 
fines (Beale, /. c, p. 296). — On fait dissoudre 18 centigrammes de 
ferrocyanure de potassium dans 28 grammes de glycérine de Price. 
On fait aussi un mélange de 28 grammes de glycérine de Price, et de 
X gouttes de teinture de perchlorure de fer. On ajoute ce mélange, 
goutte à goutte, lentement, en agitant constamment et vigoureuse- 
ment, dans un flacon à la solution de ferrocyanure de potassium. On 
ajoute 28 ce. d'eau avec III gouttes d'acide chlorbydrique concentré ; 
on peut ajouter aussi, si on le désire, 7 grammes d'alcool. 

Nous trouvons cette formule vraiment excellente. Nous possédons 
un peu de ce liquide préparé il y a plus de cinq ans, qui a encore 
l'apparence d'une solution parfaite. Cette formule nous paraît préfé- 
rable à la précédente sous tous les rapports, si ce n'est que la prépa- 
ration en est plus coûteuse. 

479. Bleu de Turnbull (Formule de Beale, modifiée d'après 
celle de Ricuardson ; Beale, loc. cit., p. 94). — On fait une solution 
de 30 centigrammes de sulfate de fer dans 28 grammes de glycérine. 
On fait aussi une solution de 60 centigrammes de ferricyanure 
(prussiate rouge) de potassium dans un peu d'eau , et on la mêle à 



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308 CHAPITRE XXU 

28 grammes de glycérine. On ajoute graduellement la solution de 
fer à la solution de ferricyanure, en agitant. Puis on ajoute, graduel- 
lement, en agitant, un mélange de 4 grammes d'alcool et 28 ce. 
d*eau. 

Ce liquide a une couleur plus vive que le liquide au bleu de Prusse, 
et sa couleur passe pour être plus permanente. 

480. Licpiide acajoa à la glycérine (Robin, Traité, p. 34). — Un 
volume de la masse colorante numéro 439 avec deux volumes du véhicule 
numéro 473. 

481. liicpiide au cadminm et à la glycérine (Robin, loc. cit., 
p. 36). — Un volume de la masse colorante numéro 441 et deux volumes 
du véhicule numéro 473. 

482. Liquide an vert de Scheele et à la glycérine (Robin, loc. 
cit., p. 37). — Un volume de la masse colorante numéro 442 et deux volumes 
du véhicule numéro 473. 



MASSES AQUEUSES 

483. Bleu de Berlin (Muller, Arch, f. mik. Anat., 1865, p. 150) . 
— On précipite une solution concentrée de bleu de Berlin soluble 
(voy. numéros 450, 451), en ajoutant de Talcool à 90^ On obtient un 
précipité extrêmement fin, et Ton a un liquide parfaitement neutre. 
La préparation est on ne peut plus simple. 

484. Bleu de Prusse (Ranvier, Traité, p. 120). — La solution 
saturée dans Teau du bleu de Prusse soluble, numéro 450, peut être 
injectée telle quelle ; jamais elle ne transsude à travers les parois des 
vaisseaux. 

485. Bleu de Berlin (Mayer, Mitlh. ZooL Stat. Neapel, 1888, 
p. 307). — On additionne un demi-litre d*eau de 10 ce. de teinture de 
perchlorure de fer, et on l'ajoute à une solution de 20 grammes de 
prussiate jaune de potasse dans un demi-litre d'eau. On laisse déposer 
pendant 12 heures, on décante, on prend le dépôt et le lave sur un 
filtre avec de Teau distillée jusqu'à ce que l'eau de lavage devienne 
d'un bleu foncé, puis on fait dissoudre dans environ un litre d'eau. 

486. Vanadate d'ammoniaque (Letëlliër, Bull. Soc. Linn. 
Normandie, 1888, p. 171, ou Journ. Roy. Mie. Soc., 1889, p. loi). 

487. Encre de Chine (Taguchi, Arch. f. mik. Anal., 1888, p. 566). 



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INJECTIONS. AUTRES MASSES 309 

— Encre de Chine, ou encre japonaise, bien broyée sur une pierre à | 
aiguiser flne jusqu^à ce qu'une goutte placée sur du papier buvard ne 

coule pas ni ne forme un anneau gris autour d'elle. Injecter jusqu'à 
ce que la préparation paraisse noire, et la jeter dans un liquide dur- 
cissant (pas dans l'eau). Je pense que ce procédé sera souvent fort 
commode pour l'injection d'Invertébrés. 

i 

488. Carmin (Emery, Mitth, Zool. Stat. Neapel, 1881, p. 21). I 

— On prend une solution ammoniacale de carmin à 10 p. 100, à | 
laquelle on ajoute de l'acide acétique jusqu'à ce qu'elle passe à une j 
couleur rouge de sang. On la décante et on l'injecte telle quelle. Les 

pièces injectées sont mises dans de l'alcool fort, qui fixe le carmin. 
Pour injections de Poissons. 

489. Injection rouge (Brucke, Arch, f. mik, Anai., 1886, p. 91). -- 
Injection d'une solution concentrée de ferrocyanure de potassium suivie 
par l'injection d'une solution concentrée de sulfate de cuivre (qui ne doit 
pas contenir de fer). Laisser Içs pièces vingt-quatre heures avant de les 
préparer. Il n'y a pas d'inconvénient à cela, ces liquides étant de puissants 
antiseptiques. 

MASSES AU COLLODION 

490. Masses à la celloldine (Scuiefferdecker, Arch, f. Anal, u. 
Phys.y 1882, p. 201). — Ces masses trouvent leur emploi principal pour les 
préparations par corrosion ; mais elles donnent aussi de bons résultats pour 
les injections ordinaires. Elles ont surtout l'avantage de conserver très bien 
la forme des vaisseaux. 

Les seringues doivent être bien nettoyées de toute graisse. On remplit la 
canule d'éther. Il faut pousser l'injection rapidement, car la masse se prend 
vite parle contact des tissus aqueux. On nettoie les seringues et les canules 
avec de l'élher. 

Pour faire la corrosion des pièces injectées, on les jette dans de l'acide 
chlorhydrique, et on les y laisse, en renouvelant de temps à autre l'acide si 
cela parait nécessaire, jusqu'à ce que les tissus soient détruits. On lave sous 
un robinet d'eau pendant plusieui*s semaines et l'on monte dans la glycé- 
rine ou dans le liquide de Galberla. 

1. Celloïdine à V asphalte, — On pulvérise de l'asphalte dans un mortier, 
et on le laisse macérer avec de l'éther dans un récipient bien fermé, pen- 
dant vingt-ijualre heures. Puis on décante la solution et l'on y fait dis- 
soudre de la celloïdine en petits morceaux jusqu'à consistance d'huile. C'est 
la meilleure de ces masses. 

2. Celloïdine à la vésuvine. — On fait une solution concentrée de vésu- 
vine dans l'alcool absolu, et l'on y fait dissoudre de la celloïdine. La cou- 
leur n'est pas durable. 

3. Celloïdine bleu foncé, — A une solution de celloïdine dans un mélange 



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310 CHAPITRE XXII 

à parties égales d'éther et d*alcool absolu on ajoute du bleu de Berlin 
pulvérisé. 

4. Celloïdine rouge foncé. — Comme le mélange précédent, le cinabre 
pulvérisé étant employé à la place du bleu de Berlin. Ces deux couleurs 
doivent être broyées dans un mortier avec un peu d*alcool absolu, de 
manière à former une pâte que Ton ajoute à la solution de celloïdine. Il 
faut éviter d'employer une trop grande quantité de ces couleurs, sous peine 
de voir la masse devenir fragile. On peut passer la masse à travers une 
chausse de flanelle saturée d*éther. 



AUTRES MASSES 

491. Asphalte à la benzine (Rudge, Arch. /*. mik. Anal,, 1877, 
p. 70). — On verse de la benzine sur de Tasphaltc, dont il faut prendre une 
quantité considérable, et on laisse reposer plusieurs jours. Avant dinjecler, 
on ajoute 1/3 à 1/2 volume de benzine et Ton filtre. On peut aussi 
employer le chloroforme ou Tessence de térébenthine comme dissolvant. 

Pour l'injection des canalicules du cartilage par piqûre, ou autrement. 

492. Gomme-laque (Hoyer, Arch. /". mik. AnaL, 1876, p. 645). — 
On met une certaine quantité de gomme-laque dans un flacon à large gou- 
lot et Ton ajoute assez d'alcool à 80 p. 100 environ pour la couvrir. On laisse 
pendant vingt-quatre heures et Ton chauffe au bain-marie jusqu'à dissolu- 
lion complète. Après refroidissement, on allonge avec de Falcool, si cela 
(tarait nécessaire, et Ton passe à travers de la mousseline. On colore la 
masse avec des couleurs à Taniline en solution alcoolique concentrée, ou 
avec des matières colorantes granuleuses suspendues dans Falcool. 

Celte masse n'est pas attaquée par Tacide chlorhydrique, par suite elle 
est applicable aux préparations par voie de corrosion. 

493. Autres masses. Couleurs à Thuile. Térébenthine. Cire à 
cacheter. — Voyez Robin, Trailéy p. 23. — Empois d'amidon (Pansch). 
— Pour cette masse, d'un emploi plutôt macroscopique, voyez Arch. f. 
Anal. u. Entw., 1877, p. 480-2; 1881, p. 76; 1880, p. 232, 371 ; 1882, 
p. 60; 1883, p. 265. — Masses à l'huile de lin (Teiciimann). — Voyez 
S. B, Math. Kl. Krakau Akad., VII, p. 108, io8; et Journ. Roy. Mie. 
Soc.y 1882, p. 125 et 716. — Axonge. Blanc de baleine. — Voyez 
Robin, Trailé, p. 23. — Cire et huile. — Voyez Griesbacu, Arch. f. 
mik. Anal., 1882, p. 824-7. 

494. Injections naturelles (Robin, Traité, p. 6). — Pour conserver 
les organes injectés naturellement par stase sanguine. Robin conseille de les 
jeter dans un liquide composé de : 

Perchlorure de fer liquide 10 parties. 

Eau 100 — 

Retterer {Jowm. de VAnat., XXX, 1894, p. 336) emploie la solu- 
tion de Miiller, et y laisse les objets pendant vingt-quatre heures, fait 
des coupes à la paraffine et colore dans le mélange Ehriich-Bioudi. 



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CHAPITRE XXIII 

MACÉRATIONS ET CORROSIONS. DIGESTION 

DÉCALCIFICATION, DÉSILICIFIG ATION ET DËPIGMENT ATION 



495. Procédés de macération. — Pour faciliter la dissociation 
des éléaients histologiques, il y a souvent utilité à traiter les tissus 
par des agents c macérateurs >. Ce sont des réactifs qui ont la 
propriété de ramollir et môme de détruire entièrement certains 
éléments — généralement les substances intercellulaires — tout en 
maintenant Tintégrité des formes des éléments qu*on désire isoler 
pour l'étude. Les tissus ayant été exposés à Taction d'un agent 
macérateur approprié, on achève la dissociation par des moyens 
mécaniques. On dilacère avec des aiguilles ; ou Ton agite les pièces 
dans une éprouvette avec un peu de liquide ; ou bien on met en 
œuvre le procédé de désagrégation par chocs répétés. A cette fln, on 
met sur un porte-objet la portion de tissu à dissocier, dans une goutte 
de liquide, et on le couvre d'une lamelle soutenue par quatre petits 
pieds formés de boulettes de cire molle ou d'un mélange de cire et de 
térébenthine. En frappant à petits coups secs sur la lamelle, on 
amène à la longue, quelquefois même assez rapidement, la désagré- 
gation des tissus. Cette méthode, si simple en apparence, est souvent 
plus efficace qu'aucune autre. 

496. Sérum iodé. — ,Nous avons donné la préparation de ce 
réactif au numéro 353. Voici les instructions de Ranvier sur la 
manière de l'employer pour les macérations. 

On prend un fragment de tissu d'un volume inférieur à celui d'un 
pois, et on le place dans un flacon bien bouché avec 4 ou S ce. de 
sérum faiblement iodé ; généralement dès le lendemain on peut pra- 



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312 CHAPITRE XXIII 

tiquer la dissociation par l'un des moyens indiqués plus haut. Si le 
tissu n*est pas encore suflQsaininent macéré, il faut prolonger son 
séjour dans le sérum ; mais on remarquera que, dès le second jour, 
le sérum est tout à fait décoloré, c'est-à-dire que le tissu a absorbé 
tout riode qu*il contenait, et, si on laissait les choses en cet état, la 
putréfaction ne tarderait pas à survenir. Pour l'empêcher, on ajoute 
quelques gouttes de sérum fortement iodé (voy. numéro 383) jusqu'à 
ce que le liquide ait repris une légère coloration brune. Le séjour du 
tissu dans le sérum peut ainsi être prolongé pendant plusieurs 
semaines, si Ton ajoute du sérum iodé chaque fois que le liquide se 
décolore. C'est l'addition successive de nouvelles quantités d'iode qui 
constitue la clef de cette méthode de macération. 

497. Sérum iodé artificiel (Frey). Voyez numéro 354. — Ranvier 
trouve que cette formule ne fournit pas un sérum utile pour les 
macérations. 

498. Alcool dilué. — On peut se servir de diverses concentrations 
d'alcool, depuis un mélange de 1 partie d'alcool avec 3 d'eau 
(Thin, pour l'isolation des fibrilles nerveuses de la rétine), jusqu'à 
l'alcool à 80 p. 100. Mais le plus utile de ces alcools est sans contre- 
dit Valcool au tiers de Ranvier {Traité, p. 77). C'est un mélange de 
1 partie d'alcool à 36° (90 p. 100) et de 2 parties d'eau. Ce mélange 
macère plus rapidement que le sérum iodé. La plupart des épithé- 
liuras s'y macèrent bien en vingt-quatre heures. 

De l'avis de tous les observateurs, Talcool au tiers est un macéra- 
teur doux de premier ordre. List (Zeit. f. toiss. Mik,,, 1888, p. 811) 
trouve qu'il ne doit être employé qu'avec précaution pour l'isolation 
de cellules glandulaires, à cause des gonflements qu'il y produit ; 
et il pense que le liquide de Millier ou l'acide osmique est préférable 
pour ce genre d'objets. 

499. Chlorure de sodium. — La solution à 10 p. 100 de chlorure 
de sodium est un agent de macération très employé et très efficace. 

500. Chlorure de sodium et alcool (Molescuott et Piso Bormb, 
Moleschott's Untersuchungen z. NaturL^ XI, p. 99-107 ; Ranvier, 
Traité, p. 242). 

Chlorure de sodium à 10 p. 100 5 volumes. 

Aicool absolu 1 — 

Ce mélange fut particulièrement recommandé par les auteui*s cités 



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MACÉRATIONS ET CORROSIONS, DIGESTION 313 

en premier lieu pour Télude des cellules à cils vibratiles. Ranvier 
le trouve inférieur à Talcool au tiers. 

501. Hydrate de chloral. — En solution pas trop forte, de 2 à 
8 p. 100 environ, Thydrate de chloral est un macérateur doux très 
recommandable parce qu'il conserve on ne peut mieux les éléiiients 
délicats. Lavdowsky {Arch. /*. mik. Anat., 1876, p. 389) le recom- 
mande beaucoup pour les glandes salivaires. Hickson le recommande 
pour la rétine des Arthropodes (Quart, Journ, Mie, Se, 1888, p. 244). 

502. Potasse caustique ou soude caustique (Ranvier, Traité^ 
p. 7^. — Ces alcalis servent à procurer très rapidement des préparations ^ 
fugitives qui ne se laissent conserver que très peu de temps. On les emploie 
en solutions fortes, de 35 à bO p. 100 (Molesciiott) ; à ces degrés de concen- 
tration ils ne modifîent que légèrement les cellules, tandis qu'à des doses 
faibles ils détruisent tous les éléments. On emploie cependant des solutions 
faibles pour dissocier les éléments des ongles, des poils et de Tépiderme. 
Les solutions fortes s'emploient en les faisant agir sur le tissu étalé sur le 
porte-objet. 

503. Salive artificielle (Galdebla, Arch, f, mik, Anat., 1875, p. 449). 
— Après avoir essayé plusieurs réactifs dans le but d'obtenir la dissociation 
du tissu musculaire et nerveux embryonnaire d'Âmphibiens et d'Ophidiens, 
Galberla trouva que les meilleurs résultats furent donnés par le mélange de 
salive et de liquide de Miiller employé par Czeiny. Cela le conduisit à ima- 
giner la salive artificielle dont nous allons donner la formule. (Nous sup- 
primons la première îles deux formules données par Galberla, la deuxième 
étant beaucoup moins compliquée et donnant des résultats tout aussi bons.) 

Chlorure de potassium gr. 4 

Chlorure de sodium — 3 

Phosphate de soude 0—2 

Chlorure de calcium — 2 

On fait dissoudre ces ingrédients dans 100 parties d*eau. Puis on fait 
passer de l'acide carbonique à travers la solution jusqu'à saturation. On 
ajoute à cette solution un demi-volume de solution de MùUer (ou de solu- 
tion de chromate d'amnioniaque à 2,5 p. 100) et un volume d'eau. 

On fait macérer les embryons dans ce mélange pendant un ou deux jours. 
On achève la dissociation par la dilacération et l'agitation dans un flacon, 
et l'on monte les pièces dans l'acétate de potasse. 

Galberla a toujours eu les meilleurs résultats alors qu'il saturait le 
mélange d'acide carbonique au moment même de s'en servir. 

504. Mélange de Landois (Landois, Arch. /*. mik, Anat., 1888, 
p. 448). 

Solution saturée de chromate neutre d'ammoniaque. 5 parties. 

Solution saturée de phosphate de potasse 5 — 

Solution saturée de sulfate de soude 5 — 

Eau distillée 100 — 



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314 CHAPITRE XXIII 

GiBRKE, d'après qui nous citons cette formule, recommande parti- 
culièrement ce liquide pour toutes sortes de macérations, mais surtout 
pour le système nerveux central, pour lequel il lui donne la préfé- 
rence sur tous les autres. liquides macérateurs. Il s'emploie de la 
même manière que l'acide chromique ; de petits fragments du tissu à 
dissocier sont mis à macérer pendant un à trois, ou même quatre et 
cinq jours dans le liquide, puis mis pendant vingt-quatre heures dans 
du carmin ammoniacal allongé d'un volume du liquide macérateur, 
Nansen {Zeit. f. wiss. Mik,, V, 2, 1888, p. 242) le recommande éga- 
lement pour le même objet. 

505. Permanganate de potasse. — C'est un agent macérateur 
très énergique. Son action ressemble à celle de l'acide osmique, si ce 
n'est que nous doutons qu'il puisse fournir des préparations perma- 
nentes conservant les caractères des cellules. Rollett {Stricker's 
Handb.j p. 1108) le recommande, soit seul, soit combiné à l'alun, 
comme le meilleur réactif pour la dissociation des fibres de la cornée. 

506. Bichromate de potasse. — Solution à 0,2 p. 100 environ. 
La solution de Mûller s'emploie à la même concentration. 

507. Acide chromique. — S'emploie généralement à des doses 
beaucoup plus faibles^ 0,02 p. 100 environ, c 11 est bon pour la plu- 
part des tissus de l'organisme, et en particulier pour les cellules ner-^ 
veuses. Il en faut prendre 10 ce. pour un fragment d'environ 8 milli- 
mètres de côté. Au bout de vingt-quatre heures de séjour dans ce 
liquide, le tissu nerveux se dissocie avec facilité. » (Ranvier, Traité, 
p. 78.) 

508. Mélange de Brock [Intern. Monatschr.^ 1, 1884, p. 349). 
— Parties égales de bichromate de potasse à 10 p. 100 et du liquide 
viscéral de l'animal (système nerveux de Mollusques). 

509. Mélanges de Mœbius {Zeit. f. wiss, Mik., III, 8, 1886, 
p. 402). — A. Une partie d'eau de mer avec 4 à 6 parties de solution 
de bichromate de potasse à 0,S p. 100. 

B. Acide chromique, 0,25 p. 100; acide osmique, 0,1 p. 100; acide 
acétique, 0,1 p. 100 dans l'eau de mer. Pour les Lamellibranches. 
Macérer pendant plusieurs jours. 

510. Mélange de Gage [Zeit. f. wiss. Mik., IX, 1, 1892, p. 87 et 



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MACÉRATIONS ET CORROSIONS^ DIGESTION 315 

88). — Alcool à 9S p. 100, 250 parties ; eau, 750 ; acide picrique I. 
Surtout pour les épithéliums et le tissu musculaire. 

511. Acide osmique. — S'emploie en solutions d'une concentra- 
tion de 0,1 p. 100 ou moins, qu'on laisse agir selon les cas depuis 
quelques minutes jusqu'à quinze jours (écorce du cerveau du Bœuf) 
(Rindfleisch). 

512. Liquide des Hertwigr (Hertwig, Nervens. u, Sinnesorg. 
d. Medusen^ p. 4). 

Acide osmique à 0,05 p. 100 1 partie. 

Acide acétique à 0,2 p. 100 1 — 

Pour les Méduses, On les traite avec ce mélange pendant deux ou 
trois minutes, selon leur grosseur ; puis on les lave à l'acide acétique 
à 0,1 p. 100 souvent renouvelé jusqu'à ce qu'on ait éloigné les der- 
nières traces d'osmium. On les laisse ensuite pendant un jour dans 
l'acide acétique de la même concentration, on les lave à l'eau, et on 
colore au carmin de Beale, qui a pour effet de prévenir le noircisse- 
ment des pièces par l'osmium. On conserve les pièces dans la glycé- 
rine. 

Pour les Actinies, la formule doit être modifiée [Jen, Zeitschr,, 
1879, p. 457) : 

Acide osmique 0,04 p. 100 dans l'eau de mer . 1 parlie. 
Acide acétique 0,2 p. 100 1 — 

et l'acide acétique doit être pris plus concentré pour le lavage, à 
savoir, 0,2 p. 100. Si la macération se montre complète, on colore 
avec le picro-carmin ; sinon, avec le carmin de Beale. 
Ces méthodes sont très importantes pour l'étude des Cœlentérés. 

513. Acide acétique et glycérine (Bêla IIaller, MorphoL Jahrh,^ 
XI, p. 321). 

Acide acétique cristallisable i partie. 

Glycérine 1 — 

Eau 2 — 

Ce mélange est particulièrement recommandé par IIaller pour la macé- 
ration des centres nerveux des Mollusques (Rhipidoglosses). On obtient une 
macération suffisante en trente à quarante minutes, et cela sans que les 
éléments aient souffert le ratatinement produit par les autres agents macé- 
rateurs. 



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316 



CHAPITRE XXIII 



514. Acide nitrique. — S'emploie à une concentration de 
20 p. 100 pour la macération du tissu musculaire. Après une mace'ra- 
tion de vingt-quatre heures dans ce liquide, on parvient en général à 
dissocier les fibres musculaires en agitant une portion du tissu avec 
de Teau dans une éprouvette. Les préparations peuvent être conser- 
vées longtempsdans une forte solution d*alun (Hopkins, Zeit. f, wiss. 
Mtk., IX, I, 1892, p. 86), à laquelle on peut peut ajouter 2 p. 100 
d*hydrate de choral {Ref, Hand. Med. Sci.y Supp., p. 436). La macé- 
ration est grandement activée par la chaleur. 

515. Acide nitrique et chlorate de potasse (Kuiine : dans 
Ranvier, Traité^ p. 79). — On fait dans un verre de montre un 
mélange de chlorate de potasse avec 4 fois son volume d'acide 
nitrique ; on y enfouit un fragment de tissu musculaire frais ; après 
une demi-heure on le retire et on Tagite dans un tube avec de Teau. 



516. Acide sulfurique (Ranvier, Traité, p. 78). — « Concentré 
et à chaud, ce réactif peut être employé pour isoler les cellules des 
parties cornées, des poils, des ongles, etc. Pour isoler les fibres du 
cristallin, Max Scuultze place cet organe dans 30 grammes d'eau 
additionnée de 4 ou 8 gouttes d'acide sulfurique concentré. Au bout 
de vingt-quatre heures de macération, il suffit d'agiter un fragment 
du cristallin dans le liquide pour le voir se décomposer en ses élé- 
ments constituants. » 

Odenius a trouvé ce réactif (moins de 1 p. 100, pendant une ou 
deux semaines) excellent pour l'étude des terminaisons nerveuses 
dans les Poils tactiles. 

517. Acide oxalique. — On a employé avec fruit la macération, pro- 
longée pendant plusieurs jours, dans une solution concentrée de cet acide, 
pour rélude des terminaisons nerveuses. 

518. Mélange méthylique (Scuiefferdecker, Arch. f. mik. 
Anat., XXVIII, 1886, p. 305). — Glycérine, 10 parties ; alcool méthy- 
lique, 1 partie; eau distillée, 20 parties. Pour la rétine surtout. Les 
tissus doivent être parfaitement frais, et doivent macérer pendant 
plusieurs jours. 

519. Lysol (Reinke, Anat, Anz,, VIII, 1892, n« 16, p. 882; ZeiL 
/. tviss. Mik., X, 2, 1893, p. 224). — Solution de lysol à 10 
p. 100 dans l'eau distillée ou dans l'eau additionnée d'alcool et de 
glycérine. ( Le lysol est un produit industriel consistant en une solu- 



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MACÉRATIONS ET CORROSIONS, DIGESTION 317 

tion de crésol dans du savon neutre, employé comme antiseptique.) 
Celte substance aurait surtout, d'après Reinke, la propriété d'exercer 
une action macératrice extrêmement rapide. Des queues de zoo- 
spermes de Rat se résolvent en fibrilles en quelques minutes. Les 
cellules corticales des cheveux se flbrillent en quelques minutes. Les 
cellules épithéliales de la Salamandre se dissocient momentanément. 
La chromatine des noyaux est détruite, mettant en évidence le cary o- 
plasme réticulé. Reinke a fondé sur celte réaction des conclusions 
concernant la structure des noyaux qui vont loin [Arch. f, mik. Anat.^ 
43, 3, 1894, p. 398 et seq.). 



LIQUIDES DIGESTIFS ARTIFICIELS 

520. Liquide digestif de Beale (Beale, Arch, of Medicine, 
I, p. 269-316). — On exprime sur des lames de verre Je contenu des 
glandes stomacales du Porc, et on Ty fait sécher rapidement. On le 
réduit en poudre et on le conserve dans des flacons bouchés. 8 déci- 
grammes de la poudre suffisent à digérer entièrement 100 grammes 
de blanc d*œuf coagulé. 

Pour s'en servir, on fait une solution dans l'eau et l'on filtre. On 
combine cette solution avec de la glycérine (acidulée au besoin avec 
une trace d'acide chlorhydrique), et l'on fait digérer le tissu pendant 
quelques heures à une température de 37**,5 G. 

521. Liquide de Brûcke (nous empruntons la formule à Garnoy, 
Biologie Cell., p. 94). 

Extrait glycérine d'estomac de porr. .... 1 volume. 

Acide chlorhydrique à 0.2 p. 10) 3 — 

Thymol quelques cristaux. 

622. Liquide de Bickfalvi (Bcckfalvi, Centralb. f. d. Med. 
Wiss., 1883, p. 833; ZooL Jahresb. f. 1883, p. 25). — On mêle 
1 gramme de muqueuse stomacale desséchée avec 20 ce. d'acide 
chlorhydrique à 0,5 p. 100, et on le met dans un incubateur pendant 
trois à quatre heures. On filtre. On fait macérer le tissu dans le 
liquide pendant une demi-heure à une heure au plus. 

623. Liquide de Kusko^w [Arch, f. mik, Anat,, XXX, p. 32; 
Zeil. f. iviss. Mik,, IV, 3, 1887, p. 384). — Une partie de pepsine dis- 
soute dans 200 parties de solution d'acide oxalique à 3 p. 100. La solu- 
tion doit être fraîchement préparée et les objets (coupes de ligamen- 



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ii|l!ïl !^li 



318 CHAPITRE xxm 

tum nuclae durci) doivent y rester à la température ordinaire de 
dix à quarante minutes. 

524. Liquide de Schiefferdecker {Ibid,, III, 4, 1886, p. 483). -- 
Pancréatine dissoute à saturation à froid dans l'eau et filtrée. Des 
portions d'épiderme doivent y être macérées pendant trois à quatre 
heures à une température de 31^ C. environ. 

526. Trypsine deKtUine {Unters. a. d. Phys, Inst. Unw. Heidel- 
berg, I, 2, 1877, p. 219). — Très compliqué, et d'après Rawitz {Leit- 
faden^ i89S, p. 10) ne donnant pas de très bons résultats. 

526. Méthodes de Gedoelst. — Voyez La Cellule, III, 1887, 
p. 117, et V, 1889, p. 126. 

CORROSION 

527. Potasse caustique. Soude caustique. Acide nitrique. 

— Un moyen très efficace pour séparer les parties molles des parties 
du squelette qu'on désire étudier à part (appendices des Arthropodes, 
spicules d'Épongés ou d*Êchinodermes, etc.) consiste à les faire 
bouillir ou macérer pendant un temps prolongé, dans une solution 
concentrée d'un de ces réactifs. 

528. Eau de Javelle. Eau de Labarraque. — Noll {ZooL 
Anzeig., 1882, p. 528) recommande Teau de Javelle (solution d'hypo- 
chlorite de potasse) pour la corrosion des parties molles des Eponges. 
On en ajoute quelques gouttes à une portion d'épongé sur le porte- 
objet. Les parties molles sont détruites au bout de vingt à trente 
minutes. On traite la préparation avec de Tacide acétique, pour éloi- 
gner les précipités qui peuvent s*étre formés, et l'on passe par des 
alcools successifs à Tessence de girofle et au baume. 

Looss (Zoo/. Aiizeig,, 1885, p. 333) trouve queTeau de Javelle ou 
bien Teau de Labarraque (solution d'hypochlorite de soude) suffit à 
dissoudre complètement la chitine en peu de temps à l'aide de la 
chaleur. A cet effet, il faut employer les solutions commerciales con- 
centrées et bouillantes. 

Si Ton prend des solutions allongées avec 4 à 6 volumes d'eau, et 
que Ton y fasse macérer des organes chitineux pendant vingt-quatre 
heures ou plus selon leur grosseur, la chitine n'est pas dissoute, mais 
devient transparente, molle, et perméable par les solutions colo- 



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MACÉRATIONS ET CORROSIONS, DIGESTION 319 

rantes, aqueuses aussi bien qu'alcooliques. Les structures les plus 
délicates, telles que les terminaisons nerveuses, ne sont pas altérées 
par ce traitement, selon Looss. On peut avantageusement traiter de 
cette manière les Nématodes et leurs œufs (objet dont la résistance 
est bien connue). 

On a prétendu que Teau de Javelle peut être appliquée à la prépa- 
ration de pièces calcaires. Nons sommes convaincus que pour peu 
que le calcaire soit délicat, il doit s'y dissoudre. 

529. Méthode de préparation par corrosion (Altmann, Arch. f, 
mik. Anal. y 1879, p. 471). — Les corps gras, et surtout les corps gras qui 
ont été durcis par Tosmium, résislent beaucoup plus longtemps que les 
autres éléments des tissus à l'action de l'eau de Javelle. Si donc on intro- 
duit un corps gras dans les tissus, par injection ou par imbibition, qu'on 
le durcisse par Tacide osmique, et qu'on soumette ensuite les tissus à 
la corrosion par l'eau de Javelle, on obtient, après destruction des tissus, 
une reproduction en graisse noircie des espaces dans lesquels on l'avait 
introduite. 

On comprendra facilement l'application de ce principe aux injections. On 
injecte de l'huile d'olive ; on durcit l'huile en jetant la pièce dans l'acide 
osmique à 1 p. 100 ; on traite ensuite la pièce par l'eau de Javelle ; et les 
parties molles ayant étant détruites, on lave la préparation à la glycérine et 
on la monte dans le même milieu. Nous renvoyons à l'article cité pour les 
détails du mode opératoire pour la préparation d'injections de l'iris, de la 
choroïde, de la peau, du mésentère, des corpuscules de la cornée, etc., de 
la Grenouille et d'autres animaux. Le procédé se montre surtout d'un bon 
secours pour l'injection d'organes très pigmentés. 

On trouvera un excellent abrégé de ce travail avec planche dans Journ. 
Roy. Mie. Soc. y 1879, p. 610. 



DÉCALCIFICATION 

530. Emploi des décalcifiants. — Pour avoir les meilleurs 
résultats il est important de n'employer que du matériel qui a été 
bien fixé et durci secundum artem^ et il ne faut pas avoir trop de 
confiance en les réactifs qui sont réputés durcir et décalcifier en 
même temps du matériel frais (Fish, Réf. Handb. Med. Sci. Supp. 
p. 425). 

531. Réactifs décalcifiants. — Nous empruntons le résumé 
suivant à l'article de Busch sur la Technique de l'Histologie du Tissu 
Osseux dans Arch. f. mik. AnaL, 1877, p. 481. 

Le réactif le plus employé pour la décalcification est V acide chlor- 
hydrique. Son action est très rapide, même quand on le prend très 
dilué, mais il a l'inconvénient de causer des gonflements très sérieux 



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320 CHAPITRE XXIII 

dans les tissus. Pour parer à cet inconvénient, on peut le combiner à 
l'alcool, ou à Tacide chromique. Ou bien on peut prendre une solu- 
tion à 3 p. d 00 et y faire dissoudre 10 à 15 p. d 00 de sel de cuisine. 
Ou bien (Waldeyer) on peut employer une solution de 10 p. 100 
avec 0,1 p. 100 de chlorure de palladium. 

V acide chromique est également très employé. Il a les deux incon- 
vénients d'avoir une action très lente et de ratatiner fortement les tis- 
sus. Pour celte raison on ne doit jamais l'employer en solutions de 
plus de 1 p. 100, et pour des structures délicates on doit prendre des 
solutions beaucoup plus faibles. 

U acide phosphorique a été recommandé pour des os jeunes. 

Les acides acétique^ lactique et pyroligneux ont une action assez 
énergique, mais ils causent des gonflements sérieux. 

V acide picrique a une action très lente, et n'est propre que pour 
de très petits objets. 

Vacide nitrique est, selon Buscn, préférable à tous ces réactifs. 11 
agit d'une manière efficace, ne produit pas de gonflements, et n*altère 
pas les éléments des tissus. 

532. Acide nitrique (Busch, toc. cit.). — On allonge 1 volume 
d'acide nitrique pur, de la densité de 1,âo, avec 10 volumes d'eau. 
C'est cette concentration qu'on emploie pour les os volumineux 
et durs; pour les os jeunes, il est bon de l'allonger encore jusqu'à 
1 p. 100. 

On procède ainsi : on met les os d'abord pendant trois jours dans 
l'alcool à 95^ ; puis on les met dans l'acide nitrique, qui doit être 
renouvelé tous les jours, pendant huit à dix jours. U faut les sortir 
de l'acide aussitôt que la décalcification est complète, autrement ils 
seront jaunis. On les lave pendant une heure ou deux dans un courant 
d'eau et on les met dans l'alcool à 95° qu'on renouvelle après quelques 
jours. 

Les os jeunes et fœtaux doivent être mis en premier lieu dans une 
solution contenant 1 p. 100 de bichromate de potasse et 0,1 p. 100 
d'acide chromique ; on les décalcifie ensuite avec de l'acide nitrique 
de 1 à 2 p. 100, auquel on peut ajouter un peu d'acide chromique 
(0,1 p. 100) ou de chromate de potasse (1 p. 100). En les mettant 
ensuite dans l'alcool on obtient la coloration verte connue, 

533. Acide nitrique et alcool. — 3 p. 100 d'acide nitrique dans 
l'alcool à 70°. Il faut laisser macérer dans ce liquide pendant quelques 
jours à quelques semaines. Nous ne savons qui a recommandé ce 



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MACÉRATIONS ET CORROSIONS, DIGESTION 321 

mélange. C'est uq réactif important. En eflet, Tacide nitrique exerce 
facilement, même dans les solutions faibles, une action gélatinisante 
sur le tissu osseux : l'addition d'alcool {ou d'alun) sert à ralentir 
cette action. (Fisn, dans Réf. Handb. Med, Sci.j Supp., p. 245.) 

534. Acide nitrique et alun (Gage, cité d'après Fisu, loc. cit.). 
— Solution saturée d'alun allongée de moitié d'eau et additionnée de 
5 p. 100 d'acide nitrique. Changer tous les deux ou trois jours. Pour 
le tissu dentaire ce mélange donnerait de meilleurs résultats que le 
mélange alcoolique. 

535. Acide chromo-nitrique. — 1^ Mélange de Marsh. 

Acide chromique cristallisé 1 partie. 

Acide nitrique 2 — 

Eau 225 — 

Faire macérer pendant trois à quatre semaines dans cette solution, 
souvent renouvelée. 

S'' Mélange de Fol [Lehrb., p. 112). 

Solution d'acide chromique à 1 p. 100 . . 70 volumes. 

Acide nitrique 3 — 

Eau 200 — 

S'' FiSH {Journ. of Morphol., X, 1, 1895, p. 234,) prend simple- 
ment le liquide de Perenyi (n^ SI). 

536. Acide chromique. — Pur, cet acide s'emploie à des con* 
cenlrations de 0,1 à 1 p. 100. Il est bon de prendre les solutions faibles 
d*abord, et d'en augmenter peu à peu la concentration. 11 faut faire 
macérer les os pendant deux à trois semaines. 

537. Acide chromo-chlorhydrique (Bayerl, Ai^ih. f. mik. 
ilna/., 1885, p.38). 

Solution d'acide chromique à 3 p. 100 .... 1 partie. 
Acide chlorhydrique àlp.lOO 1 — 

Pour le cartilage en voie d'ossification. 

538. Acide chlorhydrique. — Pur, on peut le prendre d'une 
concentration de 50 p. 100 ; il a alors une action extrêmement rapide 
(Ranvied). 

anat. uicr08c. 21 



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322 CHAPITRE XXIII 

539. Acide picrique. — Solution saturée. 

Nous avertissons que Vacide picro-sulfurique doit être évité pour 
les décalcifications, parce qu'il donne lieu à la formation de sulfate de 
chaux. On peut employer cependant Tacide picro-nitrique, ou l'acide 
picro-chlorhydrique. 

640. Phloroglucine (ândeer, CentralhL f. d. med. Wiss., n. 12, 33, 
p. 193, 579; Intern. Monatsch., I, p. 350; Zeil. f. wiss. Mik., 1885, 
p. 375, 539). — Andeer recommande un mélange de phloroglucine avec 
de l'acide chlorhydrique. Il prend pour des os de Batraciens, 5 à 10 p. 100 
d'acide; pour des Ghéloniens et des Oiseaux, 10 à 20 p. 100 ; pour des Mam- 
mifères, 20 à 40 p. 100. Dans ces mélanges les os sont décalcifiés en peu 
d'heures. Ils y deviennent si tendres qu'il est nécessaire de les durcir par la 
suite. 

Haug [Zeit. f. wiss. J/iA;., YIII, 1, 1891, p. 8) explique que la phloro- 
glucine n'agit pas en elle-même comme dissolvant des sels calcaires; 
son rôle dans les mélanges est de protéger de telle façon les éléments 
des tissus contre l'action des acides minéraux que ceux-ci peuvent 
être employés à des doses plus fortes qu'on ne pourrait le faire sans 
cette adjonction. Haug recommande la marche suivante : 

1 gramme de phloroglucine est ajouté à 10 ce. d'acide nitrique 
pur (pas fumant, densité 1,4). On chauffe très graduellement tout 
en agitant doucement. Il se forme une solution (vraisemblablement 
de nitrate de phloroglucine). On allonge cette solution de 100 ce. 
d'eau et on ajoute 10 ce. d'acide nitrique. On obtient ainsi une solu- 
tion contenant 20 p. 100 d'acide, ce qui est la bonne dose. (On peut 
allonger d'eau jusqu'à avoir en tout 300 ce, si l'on ajoute en 
même temps la proportion voulue d'acide, mais il ne faut pas dépas- 
ser ce point sous peine de voir diminuer l'action protectrice de la 
phloroglucine.) 

La marche de la décalcification dans ce mélange est extrêmement 
rapide et doit être surveillée. Des os fœtaux ou jeunes deviennent tout 
à fait tendres en une demi-heure ; de petits morceaux d'os vieux et 
durs (tels que le fémur, le temporal) le deviennent en quelques 
heures. Les dents demandent plus de temps. Si l'on est pressé, on peut 
employer pour ce tissu une solution contenant 38 à 45 p. 100 d'acide 
nitrique. 

Après décalcification on lave pendant deux jours à Teau courante. 

On peut également faire la solution avec de l'acide chlorhydrique 
au heu d'acide nitrique. On prend alors 30 p. 100 d'acide, et l'on 
ajoute 0,5 p. 100 de chlorure de sodium. 

Veut-on une décalcification lente, on peut prendre ou bien une 



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MACÉRATIONS ET CORROSIONS, DIGESTION 323 

solation contenant seulement 2 à S p. 100 d'acide nitrique ; qvl bien 
un mélange contenant une partie de phloroglucine, 5 d'acide nitrique, 
70 d'alcool, et 30 d'eau distillée. 



DÉSILICIFICATION 

541. Acide àuorhydrique (Mayeb, Zool. Anzeig.^ 1881, p. 593). — 
On met les objets à désilicifîer dans un récipient de verre enduit de paraf- 
fine. On ajoute de Tacide fluorhydrique goutte à goutte, en veillant 
soigneusemeut à ne pas s'exposer à ses vapeurs. De petits fragments 
d*éponges siliceuses peuvent être désilicifiés en quelques heures, une 
Wagnerella borealis en quelques minutes. Les tissus ne sont pas endom- 
magés. 

Nous pensons que personne n'entreprendra cette opération si dangereuse 
à moins de nécessité absolue. Des éponges siliceuses peuvent très bien être 
coupées au microtome sans désilicidcation ; les spicules se brisent devant 
le couteau. 



dépigmentation; blancuiment 

642. Emploi du chlore (Mayer, MiUh. Zool. StaL Neapel, 1881, 
p. 8). — On met les objets à décolorer dans l'alcool de 70 à 90**. 
On ajoute assez de fragments de chlorate de potasse pour couvrir 
le fond du flacon. On ajoute avec une pipette quelques gouttes 
d'acide chlorhydrique; il se dégage bientôt du chlore, reconnaissable 
à sa couleur verte ; on agite alors le mélange et l'on chauffe si 
le dégagement de chlore n'est pas suffisamment énergique. La 
plupart des objets peuvent cependant être décolorés en une demi- 
journée sans l'application de la chaleur. Les tissus ne souffrent nulle- 
ment. 

Au lieu d'acide chlorhydrique, on peut employer l'acide nitrique; 
en ce cas Tagent décolorant est l'oxygène au lieu du chlore. 

La méthode de décoloration par le chlore fut imaginée pour blan- 
chir des préparations qui ont été noircies par l'action excessive de 
l'osmium ; on peut l'appliquer à la décoloration d'organes pigmentés 
(yeux d'Insectes, etc.). 

643. Emploi du chlore (Marsh, Section Cutting, p. 89). — Marsh 
fait dégager du chlore dans un flacon en traitant des cristaux de chlo- 
rate de potasse avec de l'acide chlorhydrique fort, et conduit le gaz à 
travers un tube de verre courbé deux fois à angle droit jusqu'au fond 
d'un autre flacon contenant les objets à décolorer. 



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^ j- H .-ff^'îwri^ 



3H CHAPITRE XXIII 

544. Eau de chlore (Sargent, Journ, Hoy, Mie, Soc, 1883, p. 151). 

Chlorate de potasse 1 gr. 5 

Eau 28 ce. 

Acide chlorhydrique X gouttes. 

Faire macérer dans cette solution pendant un ou deux jours. Nous faisons 
observer que ce procédé n'est applicable qu'à la préparation de parties de 
squelette, les tissus mous étant détruits par ce traitement, qui ne revient 
guère à autre chose qu'à un blanchiment par Teau de Javelle. 

545. L'acide nitrique est connu pour avoir une action plus ou 
moins dissolvante sur les pigments animaux. Il faut le prendre plutôt 
fort, 5 à 10 p. 100, ou plus. 

548, Chloroforme. — D'après Sazepin, le chloroforme sert à 
éclaircir la chitine fortement pigmentée ; en ajoutant après quelque 
temps une goutte d'acide nitrique concentré, on arrive à une décolo- 
ration complète. (Voyez au chapitre des Arthropodes.) 

547. Mélange de Grenadier pour yeux d'Arthropodes et 
autres (Grenacuer, Abh. nat. Ges. Uall-a-S,^ Bd. XVI ; Zeit. f. wiss. 
Mik., 1885, p. -244). 

Glycérine 1 partie. 

Alcool à 80 degrés 2 — 

EL pour 100 volumes de ce mélange, 1 à 3 d'acide chlorhydrique. 

Le pigment se dissout dans ce liquide et forme une teinture qui, en 
douze à vingt-quatre heures, produit la coloration des noyaux de la 

piT[>aration. 

548. Créosote (Pouchet, Journ. de VAnat.^ 1876, p. 8 et suiv.). 
— D'après le mémoire que nous citons, il parait que la plupart des 
pigments animaux granuleux sont solubles dans la créosote. 

549. Eau oxygénée (peroxyde d'hydrogène) (Pouchet, Précis 
de iM. DuvAL, p. Î234). — L'eau oxygénée est un décolorant assez 
énergique. Pouchet conseille de faire macérer les pièces dans la 
glycérine additionnée d'eau oxygénée (5 ou 6 gouttes pour un verre 
de inoatre de glycérine). 

On peut souvent se procurer de Teau oxygénée chez les coiffeurs, 
qui s'en servent comme teinture pour les cheveux, et en vendent sous 
le nom d* « Auréoline », etc. 



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Qoo^^ 



MACÉRATIONS ET CORROSIONS, DIGESTION 325 

Nous avons indiqué au numéro 40 le procédé d'OvERTON pour le 
blanchiment de tissus noircis par Tosmium. 

550. Peroxyde de sodium (Carazzi, Zool, Anz,, 444, d894, 
p. 138). — Le peroxyde de sodium, Na'O*, est une poudre jaunâtre qui 
au contact de Teau pure dégage de l'oxygène et donne à Teau une 
réaction alcaline. Avec Teau acidifiée cette alcalinité du liquide ne 
se produit pas. Carazzi recommande de mettre une solution d'acide 
tartrique ou acétique à 10 p. 100 dans un récipient convenable, puis de 
mettre sur le fond du récipient une petite quantité de peroxyde, puis 
d'ajouter avec précaution de l'alcool (à 70 p. 100) à la surface du 
liquide, et de mettre dans cet alcool les objets (préalablement imbibés 
eux-mêmes d'alcool). L'oxygène se dégage du fond du liquide, monte 
et se dissout dans l'alcool, blanchissant les objets qui s'y trouvent. 

Il ne faut pas employer d'acides minéraux, et il ne faut pas ajouter 
de grandes quantités de peroxyde à une petite quantité de liquide, la 
réaction dans ces conditions étant très violente. 

551. Acide sulfureux. — M. le professeur Gilson me fait observer 
que l'anhydride sulfureux (SO*) en solution alcoolique est un réactif 
très commode pour décolorer les pièces fixées par le bichromate. 11 
suffit de quelques gouttes. 



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F^-W^IWI 



CHAPITRE XXIV 

MÉTHODES EMBRYOLOGIQUES 



552. Méthodes générales. — Il n*existe pour ainsi dire pas de 
méthodes embryologiques spéciales, et la plupart des méthodes 
générales qui ont été exposées dans la première partie de cet ouvrage 
sont applicables à Tétude des embryons. Nous croyons cependant 
devoir donner avec quelques détails les modes de préparation et 
d'étude d'un certain nombre d'embryons, pour que ces exemples 
puissent servir de guide au débutant dans les recherches qu'il entre- 
prendra. 

Pour un assez grand nombre d'œufs d'animaux, surtout parmi les 
Invertébrés, on peut suivre, à l'état vivant, le développement sous le 
champ même du microscope, en examinant les œufs par transparence 
ou à la lumière directe. Tels sont, par exemple, les œufs de certains 
Poissons osseux, de l'Épinoche, de la Perche, du Macropode et de 
plusieurs espèces pélagiques, les œufs du Chironomus, de VAsellus 
aquaticus, des Ascidies, du Planorbe, de beaucoup de Cœlentérés, etc. 
On devra, autant que possible, suivre les phases du développement 
sur les œufs vivants et dessiner les différents stades, afin d'avoir 
des points de repère lorsqu'on étudiera les œufs par la méthode des 
coupes. 

Pour examiner les œufs des animaux aquatiques, il suffit de les 
placer sur une lame de verre dans une goutte d'eau douce ou d'eau 
de mer, suivant l'habitat de l'animal, et de les recouvrir d'une lamelle 
munie à ses angles de petites boulettes de cire à modeler, ce qui per- 
met d'exercer une pression modérée comprimant légèrement les œufs 
et les maintenant en place. Souvent de simples petits morceaux de 
papier, d'épaisseur variable, interposés entre le porte-objet et la 
lamelle, suffisent pour empêcher les œufs d'être écrasés. Ce dispositif 



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MÉTHODES EMBRYOLOGIQUES 327 

permet de faire tourner les œufs et d'examiner leurs différentes faces, 
en imprimant de légers mouvements à la lamelle. Il a aussi le grand 
avantage de pouvoir faire arriver au contact des œufs différents réac- 
tifs dont on règle Faction à Taide d'une petite bande de papier à 
filtrer placée sur le bord de la lamelle, du côté opposé à celui par 
lequel on fait arriver le réactif. On peut, de cette manière, obtenir 
des préparations permanentes d'objets délicats en les soumettant suc- 
cessivement aux réactifs durcissants, colorants, etc. 

Lorsque les œufs sont un peu volumineux, on les placera sur une 
lame portant une excavation ; s'ils sont très résistants, l'emploi des 
compresseurs pourra rendre de grands services. 

Certains œufs d'Insectes et d'Arachnides, qui sont complètement 
opaques quand on les examine soit à la lumière transmise, soit à la 
lumière directe, deviennent transparents si on les place dans une 
goutte d'huile ; en ayant soin de laisser leur surface simplement 
imprégnée d*huile, ils continuent à se développer normalement. 
(Méthode du professeur Balbiani.) 

Les petits artifices que nous venons d'indiquer brièvement ne per- 
mettent en général d'étudier que les formes extérieures des embryons, 
à moins que ceux-ci ne soient très petits et très transparents, auquel 
cas on obtient des coupes optiques en faisant varier la mise au point 
du microscope. Mais il faut presque toujours en arriver à la méthode 
des coupes, à laquelle on doit les progrès rapides de l'embryogénie 
depuis quelques années. De même que pour les autres tissus, les œufs 
et les embryons ne peuvent être coupés qu'après avoir été convena- 
blement fixés et durcis. 

553. Fixation et durcissement. — Gomme en histologie, la 
fixation est un point des plus importants de la technique embryolo- 
gique. Nous avons déjà indiqué, dans les chapitres ii, m, iv et v, les 
meilleurs agents fixateurs pour les embryons ; nous n'aurons donc 
plus qu'à mentionner dans ce chapitre quelques formules spéciales. 
Nous ferons cependant observer que le choix de la méthode de fixa- 
tion doit dépendre de la nature et du volume de l'embryon ainsi que 
du genre de recherche qu'on se propose. C'est ainsi que l'acide 
osmique, seul ou associé à d'autres agents, fixe très bien les petits 
embryons, tandis qu'il ne vaut rien pour les objets plus volumineux. 
L'acide osmique a une tendance à diminuer le volume des éléments 
cellulaires, aussi fait-il nettement apparaître les fentes qui séparent 
les feuillets blastodermiques, les cavités et les canaux en voie de 
formation ; il noircit fortement les matières grasses et par conséquent 



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328 CHAPITRE XXIV 

les éléments vitellins, la myéline, etc. ; cet agent fixateur rendra donc 
de grands services pour Tétude du développement du système ner- 
veux. 

L'acide chromique est indispensable pour l'étude de la forme exté- 
rieure des embryons ; il accuse très bien les creux et les saillies en 
conservant admirablement les rapports des parties, mais il a le grand 
inconvénient d'altérer le plus souvent les éléments cellulaires et 
d'empêcher leur coloration ultérieure. 

Les liquides fixateurs qui ont pour base Tacide picrique, à Tin- 
versé de l'acide osmique, gonflent légèrement les éléments et tendent 
à effacer les espaces qui peuvent exister entre eux ; malgré cela, 
Tacide picrique et principalement le liquide de Kleinenberg sont 
parmi les meilleurs fixateurs ceux qu'emploient de préférence les 
embryologistes. 

Voici une formule de Rabl {Zeit, f. wiss. Mik., XI, 2, 1894, p. 168), 
que cet auteur a expérimentée longuement avec succès, pour des 
Vertébrés surtout, mais qu'il recommande également pour d'autres 
objets : 

Sublimé plalinique» 

Chlorure de platine, 1 p. 100 1 volume. 

Sublimé, solution saturée aqueuse 1 — 

Eau distillée 1 — 

Pour bien des blastodermes et embryons jeunes (Poissons, Amphi- 
biens. Oiseaux, Mammifères). Les embryons de Téléostéens avancés 
demandent à être fixés dans le mélange à chaude pour éviter la rupture 
de muscles et le ratatinement de la chorda. Le sublimé picrique de 
Rabl a été donné au n* 68. Rabl le recommande surtout pour des 
embryons plutôt âgés, embryons de Poulet à partir du troisième ou 
quatrième jour, et pour d'autres embryons de semblables dimensions. 
Pour les deux, fixation de douze à quarante-huit heures, lavage deux 
heures dans l'eau. 

Le durcissement des embryons se fait comme celui des petits ani- 
maux et des tissus délicats. On devra préférer la coloration en masse 
à Taide d'un agent bien pénétrant tel que le carmin de Grenacher ou 
le carmin aluné acide ou par l'hémalun ou l'hémacalcium de Mayer. 
Gomme masse à inclusion, nous avons toujours obtenu d'excellents 
résultats avec le collodion durci ensuite dans le chloroforme suivant la 
méthode de Viallanes, ou mieux avec la paraffine. Gette dernière per- 
met la confection de coupes plus minces et plus égales, et l'emploi 
de l'admirable microtome à bascule de la Société des instruments de 



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MÉTHODES EMBRYOLOGIQUES 329 

Cambridge {Rocking microtome) qui nous paraît être actuellement 
rinstrument le plus pratique pour les embryologistes, puisqu'il per- 
met, en quelques minutes, de débiter un embryon en un grand 
nombre de coupes, toutes d'e'gale épaisseur, et rigoureusement dispo- 
sées en série continue. 

554. Reconstruction de Tembryon au moyen des coupes. — 

Lorsqu'on veut, au moyen d'une série de coupes, reconstruire un 
embryon pour bien se rendre compte de sa configuration, de la forme 
de ses viscères, suivre le trajet d'un vaisseau, etc., on a recours à la 
méthode exposée par Fol dans son Traité d'anatomie microscopique 
comparée {Lehrbuch dei* vergl, mikr. Anatomie, p. 35). 

On commence par faire un dessin de Tembryon à couper, ou par 
le photographier à un grossissement donné. L'embryon étant débité 
suivant un plan normal à celui du dessin, en coupes transversales 
d'égale épaisseur et disposées en série, on dessine ou on photographie 
les coupes au même grossissement que la vue d'ensemble de l'em- 
bryon. On trace ensuite sur le dessin d'ensemble une série de traits 
parallèles qui correspondent aux coupes, distants d'un millimètre, si 
c'est de dixième de millimètre en dixième de millimètre que l'on a 
recueilli les coupes et si le dessin a été grossi dix fois. 

Puis, sur une plaque de verre, plus grande que le dessin d'ensemble, 
recouverte d'une couche de gélatine sèche, on trace une série de traits 
parallèles très rapprochés, avec un certain nombre d'encres colorées, 
employées dans le même ordre et assez variées pour que la même 
nuance ne revienne qu'à une certaine distance. Perpendiculairement 
à ces traits, on coupe la plaque de verre au diamant, en deux parties 
inégales. 

Une de ces parties est alors appliquée sur le dessin de l'une des 
coupes transversales, l'autre est placée sur le dessin d'ensemble de 
façon que son bord coupé au diamant recouvre le trait correspondant 
à la coupe transversale en question : on a soin que sur les deux pla- 
ques les limites extrêmes des deux dessins correspondent aux traits 
colorés de même nuance; si, par exemple, le bord du dessin d'en- 
semble correspond sur la plaque à un trait rouge en haut et à un 
trait bleu en bas, il faut qu'il en soit de même pour la plaque appli- 
quée sur le dessin de la coupe. 

On calque, sur la plaque appliquée sur le dessin de la coupe, le 
contour des organes internes ; en rapprochant ensuite cette demi- 
plaque de l'autre moitié qui est sur le dessin principal, on pourra 
facilement marquer sur le trait du dessin'principal qui correspond à la 



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330 



CHAPITRE XXIV 



coupe une série de points correspondant aux limites des contours des 
organes internes. 

Quand on aura fait la même opération pour une série de coupes 
transversales, il n'y aura plus qu'à réunir ces points par des lignes 
pour avoir dans le dessin principal le tracé des organes internes vus 
du même côté. 

Lorsqu'on veut se faire une idée exacte d'un organe de forme très 
compliquée, on colle les dessins ou les photographies des coupes 
faits au même grossissement, chacun sur un carton, dont l'épaisseur 
est proportionnelle à l'épaisseur de la coupe et au grossissement de la 
photographie ou du dessin, puis on découpe chaque carton en enle- 
vant toutes les cavités, tant du cœlome que des organes ; enfin on 
colle les découpures les unes sur les autres. On obtient ainsi une 
représentation dans l'espace de la portion de l'embryon qu'on 
veut étudier. 

Des reconstructions peu compliquées peuvent se faire par le pro- 
cédé très simple de Schaffer {Zeit. f. wiss. Mik.^ VIT, 3, 1890, 
p. 342). On fait les dessins sur papier à décalquer et on les superpose 
contre une vitre pour les regarder par transparence. 

Pour des méthodes plus compliquées et rarement nécessaires, con- 
sulter BoRN, Die Plattenniodellirmethode, dans Arch. f. mik. Anat.^ 
1883, p. 891 ; Strasser, Zeit. f. wiss. Mik., III, 2, 1886, p. 179, et 
IV, 2 et 3, p. 168 et 330 ; Kastschenko, ibid., 1887, IV, 2 et 3, p. 
235-6 et 353, et V, 2, 1888, p. 173 (on trouvera des résumés de tous 
ces mémoires dans le Joum. Roy. Mie. Soc. des années en question). 

555. Fécondations artificielles. — On éprouve souvent de 
grandes difficultés à se procurer les mêmes phases du développement 
de certains animaux ; aussi, chaque fois qu'on étudie l'embryogénie 
d'animaux à fécondation extérieure, est-il avantageux de pratiquer la 
fécondation artificielle. 

Cette opération se réalise aisément pour les Amphibiens anoures, 
les Poissons osseux, les Cyclostomes, les Échinodermes, beaucoup de 
Vers et de Cœlentérés. 

Pour les Amphibiens, on ouvre la femelle et le mâle, on prend 
dans les utérus de la femelle les œufs qu'on place dans un verre de 
montre ou dans un cristallisoir; on les arrose avec de l'eau dans 
laquelle on a dilacéré le testicule du mâle ou mieux les canaux défé- 
rents. 

Les femelles des Poissons osseux laissent facilement échapper leurs 
œufs lorsqu'on pratique une légère pression sur Tabdomen ; il en est 



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MÉTHODES EMBRYOLOGIQUES 331 

de même des màlesdont on obtient la semence en exerçant une pres- 
sion semblable ; mais quelquefois on devra sacrifier le mâle (Ëpinôche) 
pour prendre les testicules et les dilacérer dans l'eau. Les spermato- 
zoïdes des Poissons, surtout ceux des Salmonidés, perdant rapidement 
leur vitalité au contact de Teau, on mettra la laitance sur les œufs 
extraits du corps de la femelle et on versera ensuite sur le tout une 
petite quantité d*eau ; après quelques minutes on place les œufs dans 
un appareil à incubation recevant de Teau courante. 

La fécondation artificielle chez les Invertébrés ne présente aucune 
difficulté, lorsqu'on a à sa disposition des animaux renfermant des 
produits sexuels arrivés à maturité. Il suffit de dilacérer dans un peu 
d'eau (eau douce ou eau de mer) un fragment de testicule et d'ovaire, 
et de mélanger les deux liquides. L'opération peut se faire sur la 
platine du microscope et on peut suivre la pénétration du spermato- 
zoïde dans l'œuf, comme l'ont fait Fol, Hertwig, Selenka et d'autres 
chez les Échinodermes. 

MAMMIFÈRES 

556. Lapin. Recherche des ovules. — Nous prendrons comme 
type l'embryon du Lapin. Pour observer les premiers développements 
du Lapin, il faut rechercher les ovules dans les trompes, un certain 
nombre d'heures après l'accouplement. La déhiscence des follicules 
se fait environ dix heures après le premier coït. 

Une même Lapine peut servir à faire deux observations différentes à quel- 
ques heures ou à quelques jours d'intervalle. Pour cela, on pratique sur la 
ligne médiane ou sur le côté de Tabdomen une incision longitudinale de 8 
à 10 centimètres ; tandis qu'un aide empêche les intestins de sortir, on 
place une première ligature à la base de la corne utérine, au-dessus du col, 
puis on comprend dans une seconde ligature tout le mésométrium et le 
mésovarium. On détache alors, avec des ciseaux, Tovaire, la trompe et la 
corne utérine. Il n'y a plus qu'à refermer Tabdomen par quelques points de 
suture comprenant d'abord la couche musculaire, puis la peau. Les Lapines 
supportent très bien cette opération, qui n'entrave nullement le développe- 
ment des ovules du côté opposé. Lorsqu'on veut observer ces derniers, on 
sacrifie l'animal, à moins qu'on ne lui fasse subir une seconde laparotomie 
si on désire le garder pour des vivisections ultérieures. 

La trompe et la corne utérine étant extraites de l'animal, il faut 
les laisser refroidir pendant quelque temps et attendre que les con- 
tractions musculaires aient cessé. Puis, à l'aide de petits ciseaux ou 
d'un bon scalpel, on débarrasse soigneusement toutes les circonvolu- 
tions du conduit génital de leur enveloppe péritonéale. 



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332 CHAPITRE XXIV 

Si les ovules sont encore contenus dans la trompe, c'est-à-dire 
jusqu'à la fin du troisième jour, on étend la trompe sur une longue 
lame de verre et on l'ouvre longitudinalement avec une paire de 
ciseaux fins et coupant bien. A l'aide d'aiguilles et de bruxelles on 
étend la muqueuse tubaire afin d'en effacer autant que possible les 
plis, et on examine l'organe avec une forte loupe, ou à l'aide d'un 
microscope à un très faible grossissement. Lorsqu'on a trouvé les 
ovules, on les enlève avec la pointe d'un scalpel, avec une aiguille à 
cataracte, ou à Taide d'une petite pipette, après avoir déposé sur 
chaque ovule une goutte de liquide indifférent. Les ovules peuvent 
être examinés à l'état frais, soit dans le liquide péritonéal de la 
Lapine, si l'animal a été sacrifié, ou dans l'humeur aqueuse de l'œil, 
soit dans du liquide amniotique, du sérum sanguin, du sérum artifi- 
ciel, ou du liquide de Kronecker. 

Quand on n'a pas réussi à trouver les ovules, à l'aide de verres 
grossissants, soit à la lumière directe, soit à la lumière transmise, on 
peut passer sur la muqueuse tubaire un petit scalpel qui enlève l'épi- 
thélium ; le produit du raclage de la muqueuse est délayé dans un 
peu de liquide indifférent, et on cherche les ovules à la lumière trans- 
mise. 

Une autre méthode, employée par Koelliker {Embryologie de 
Y Homme et des animaux sup., trad. Paris, 1882), consiste à injecter 
dans l'oviducte, à l'aide d'une petite seringue, de la liqueur de MDller 
ou de l'acide osmique dilué. Le liquide est reçu dans une série de 
verres de montre, qui, portés sur le microscope, montrent les œufs 
avec facilité. 

Les quatrième, cinquième et sixième jours après l'accouplement, les 
ovules de la Lapine sont libres dans les cornes utérines; ils sont bien 
visibles à l'œil nu, et on les extrait comme de la trompe. A partir du 
septième jour, les ovules se fixent dans l'utérus, mais ils ne con- 
tractent pas encore d'adhérence avec la muqueuse, de sorte qu'on 
peut les enlever en totalité. A cette époque on distingue, à l'aspect 
seul de la corne utérine, les endroits où se trouvent les œufs : ceux-ci 
forment une saillie delà grosseur d'un petit pois. On coupe transver- 
salement la corne utérine en autant de segments qu'il y a de renfle- 
ments ovulaires, en ayant soin que chacun de ceux-ci soit au milieu 
de chaque segment. On fixe, au moyen de deux épingles, le segment 
utérin au fond d'un petit cristallisoir garni d'une couche de cire ou 
d'une rondelle de liège ; la face mésométriale reposant sur le 
fond du vase, et le renflement ovulaire étant tourné vers l'obser- 



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MÉTHODES EMBRYOLOGIQUES 333 

valeur. On remplit alors le vase, soit de sérum, soit de liqueur de 
MUller, d'une solution d'acide osmique à 1 p. 1000, de liquide de 
Kleinenberg, d'une solution d'acide nitrique, ou d'une solution satu- 
rée d'acétate d'urane. Avec un petit scalpel on pratique à la surface 
du renflement ovulaire une petite incision longitudinale qui n'inté- 
resse que la tunique musculaire, puis avec deux petites pinces on 
dilacëre délicatement la muqueuse utérine sous-jacente. On aperçoit 
alors l'œuf, et, en continuant, on le met facilement en liberté dans le 
liquide. 

Lorsque les œufs sont greffés sur la muqueuse utérine, on ne peut 
plus les enlever en totalité ; l'embryon se trouvant toujours du côté 
de la face mésométriale, on ouvre le renflement ovulaire par une 
incision cruciale et on étend avec des épingles le lambeau de la 
muqueuse utérine, auquel l'embryon adhère, au fond du vase renfer- 
mant le liquide flxateur. En opérant ainsi dans du sérum de Kronec- 
ker, à la température du corps, Ed. van Beneden (Archives de Biologie^ 
t. V, fasc. III, 1885, p. 378) a pu observer la circulation de l'embryon 
vivant pendant des heures entières; dans ce cas, il faut avoir soin de 
ne pas trop étendre l'incision cruciale, afln de ne pas intéresser le 
sinus terminal. 

Rëtterer (C R. Soc. de Biologie, 1887, p. 99) recommande, pour 
les œufs du septième jour, d'ouvrir le segment utérin renfermant 
l'œuf suivant sa face mésométriale, parce qu'il n'existe pas encore 
d'adhérence de ce côté. A l'aide d'une pipette, il fait pénétrer du 
liquide de Kleinenberg entre l'œuf et la face libre de l'utérus et il 
arrive ainsi à décoller l'œuf qu'il isole sous la forme d'une vésicule 
close. 

557. Lapin, préparation. — La] préparation des ovules et des 
embryons varie suivant le genre d'observation qu'on se propose de 
faire. S'agit-il de conserver d'une manière durable des ovules aux 
différents stades de la fécondation ou de la segmentation. Ed. van 
Beneden {Archives de Biologie, I, fasc. 1, 1880, p. 149) recom- 
mande d'opérer de la manière suivante : l'œuf vivant est porté sur un 
porte-objet dans une goutte d'acide osmique à 1 p. 100, puis enlevé 
sur la pointe d'un scalpel et placé dans le liquide de MUller. Après une 
heure, le liquide est renouvelé et la préparation abandonnée pendant 
deux ou trois jours dans une chambre humide. On ajoute alors une 
gouttelette de glycérine très diluée, puis de la glycérine plus pure, 
enfln l'ovule peut être monté dans la glycérine formique. On peut 
remplacer le liquide de Millier par le bichromate d'ammoniaque ou 



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^'«•■^ 



334 CHAPITRE XXIV 

le liquide de Kleinenberg. Si l'on veut obtenir des préparations colo- 
rées, après avoir traité Tœuf par Tacide osmique, on le place dans 
l'alcool au tiers pendant une heure, on le lave avec soin, et on le 
soumet à Faction du carmin de Beale ou du picro- carmin. 

Pour faire apparaître nettement les contours des cellules blastoder- 
miques, on traite l'œuf par le nitrate d'argent. L'œuf vivant est porté 
directement dans une solution de nitrate d'argent à d/3 p. 100. 11 
y séjourne pendant une demi à deux minutes, suivant l'âge de la 
vésicule. Il est ensuite immergé dans de l'eau pure et exposé à la 
lumière. L'excès de la solution d'argent qui a pénétré dans l'intérieur 
de l'œuf ne peut être enlevé par le lavage, aussi les préparations 
noircissent rapidement et ne peuvent se conserver. 

A partir du quatrième jour, la vésicule blastodermique peut être 
ouverte au moyen d'aiguilles fines; on lave le blastoderme dans l'eau 
distillée, on le colore par le picro-carminate, le carmin, l'hématoxy- 
line, l'éosine ou des couleurs d'aniline et on monte soit dans la 
glycérine soit dans le baume. Ed. van Beneden a obtenu aussi de 
bonnes préparations au moyen de chlorure d'or* 

Pour les taches embryonnaires et les embryons plus avancés, 
KoELUKER recommande l'emploi de Tacide osmique. Il plonge Tœuf 
.dans une solution à S p. 1000, jusqu'à ce qu'il ait pris une teinte 
légèrement foncée, ce qui exige environ une heure, puis il le met 
dans l'alcool faible, et douze heures après dans l'alcool à 33^ Cartier. 
Si l'œuf adhère à la muqueuse utérine, il laisse le fragment de mu- 
queuse qui porte l'embryon, étendu, au moyen d'épingles, dans une 
solution d'acide osmique à 1 p. 1000 pendant quatre à six heures. On 
peut alors enlever facilement la vésicule blastodermique, et on l'im- 
merge encore pendant quelques heures dans une solution d'acide 
osmique à 8 p. 1000, avant de la mettre dans l'alcool. 

Lorsqu'on veut pratiquer des coupes du blastoderme ou de jeunes 
embryons, il faut fixer avec soin les objets, puis les durcir. Kûelliker 
donne la préférence à l'acide osmique. Ed. van Beneden traite les 
œufs par une solution d'acide chromique à 1 p. 400 pendant vingt- 
quatre heures. Ils sont ensuite lavés avec soin et placés dans l'alcool 
faible, puis dans l'alcool de plus en plus fort et enfin dans l'alcool 
absolu. L'avantage de l'acide chromique est de durcir la vésicule en 
maintenant une adhésion parfaite des cellules ectodermiques contre 
la zone pellucide. Le même auteur recommande aussi le liquide de 
Kleinenberg comme agent fixateur. Nous avons souvent employé ce 
liquide pour préparer des taches embryonnaires et des embryons de 
différents âges et nous avons toujours obtenu de très bonnes prépa- 



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MÉTHODES EMBRYOLOGIQUES 335 

rations. Le liquide de Flemming, préparé suivant la formule de Fol, 
nous a aussi bien réussi ; il en est de même du mélange diacide 
osmique et d*alcooI préconisé par Rânvier et Yignal. Gomme réactif 
colorant, nous employons le carmin borate ou Thémalun ; si Tem- 
bryon est un peu volumineux, le carmin aluné acide permet seul 
d'obtenir une bonne coloration en masse. 

Gomme mflsse à inclusion nous emplpyons la paraffine pure de 
Merck. Les coupes sont faites en série à Taide du microtome à bascule, 
à une épaisseur de 1/100 à 1/200 de millimètre et montées dans le 
baume de Canada. 

A consulter aussi Piersol {ZeiL f. wiss. ZooL^ XLVIl, 2, 1888, 
p. 185); Weyssb {Proc. Amer. Acad. Arts and Sc.j 1884, p. 28o, 
(vésicule blastodermique de Stis scrofa). 

oiseaux 

558. Poule, récolte des œufs. — L'œuf de la plupart des Oiseaux 
commence à se segmenter dans Toviducte; pour étudier les premières 
phasesdu développement, il faudra donc prendre Tœuf dans les voies 
génitales de la femelle : le grand développement du vitellus permet 
de manipuler facilement les œufs. Après la ponte, les œufs sont mis 
en incubation, soit sous la femelle, soit, ce qui est plus commode, 
dans un appareil spécial à température constante (couveuse, étuve 
d'Arsonval, etc.). La température doit être maintenue dans le voisi- 
nage de 38"^ G. Si Ton veut conduire le développement assez loin, il 
faut avoir soin de laisser refroidir chaque jour les œufs pendant 
quelques instants, de maintenir une certaine humidité dans la cou- 
veuse, et de les retourner. 

559. Examen superficiel. — Pour étudier Tœuf à Tétat frais, on 
le place au sortir de la couveuse dans une cuvette assez grande pour 
qu'il puisse être recouvert de liquide. On verse dans le vase une solu- 
tion contenant 0,75 p. 100 de chlorure de sodium, chauffée à 38<>. Puis 
on brise d'un coup sec la coquille à la grosse extrémité, et on agrandit 
l'ouverture vers la partie supérieure de l'œuf, à l'aide d'une pince 
ou de ciseaux. L'aire embryonnaire étant mise à découvert, on peut 
observer à la loupe l'embryon qui continue à vivre assez longtemps 
dans le liquide indifférent. Si l'on veut examiner l'embryon vivant 
par transparence, après avoir enlevé une partie de l'albumine, on sort 
l'œuf du liquide, et on applique à la surface du vitellus un anneau de 
papier gommé entourant l'aire embryonnaire ; au bout de quelques 



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336 CHAPITRE XXIV 

minutes, lorsque le papier adhère à la membrane vitelline, on incise 
circulairement le blastoderme en dehoi*s de Tanneau de papier. On 
enlève alors cet anneau, après avoir plongé de nouveau Tœuf dans îe 
liquide indifférent; le blastoderme se détache en même temps que la 
membrane vitelline et l'anneau de papier, et il peut ainsi être placé 
dans un verre de montre ou sur une lame de verre et être porté sur le 
microscope (Duval). 

560. Observation sur le vivant (Gerlacu, Nature, 1886, 
p. 497 ; Joum, Roy, Mie, Soe,, 1886, p. 359). — Enlever avec des 
ciseaux la coquille du petit bout de Tœuf ; sortir avec une pipette un 
peu d*albumine ; le blastoderme vient alors se présenter au-dessous 
de Touverture qu'on a pratiquée, et Ton remet Talbumine. Puis on 
enduit de gomme arabique les bords de la fenêtre, et sur la gomme 
on construit un petit mur circulaire avec de la ouate ; sur la ouate 
on pose un petit verre de montre qu'on y colle avec de la gomme. 
Lorsque la gomme est assez sèche, on achève de coller le verre de 
montre par le collodion et le vernis à l'ambre, puis on remet l'œuf 
dans la position normale dans Tincubateur. Par ce moyen on peut 
suivre, à travers la fenêtre, le développement de l'embryon jusqu'au 
cinquième jour, l'œuf étant remis pour chaque observation dans la 
position verticale. 

On trouvera des développements de cette méthode, avec figures 
d'appareils spéciaux, dans A^iat, Anz,, li, 1887, p. 583-609; voir 
aussi ZeiL f, wiss. Mik., IV, 3, 1887, p. 3691 

561. Fixation et durcissement des œufs d'Oiseaux. — Pen- 
dant les premières vingt-quatre heures de l'incubation, il est très dif- 
ficile de séparer le blastoderme du vitellus ; celui-ci doit être durci en 
entier, au moins superficiellement. 

Pour les œufs d'Oiseaux dont le développement est plus avancé, 
lorsque l'embryon est déjà apparent, on peut facilement séparer le 
blastoderme du vitellus, ce qui facilite singulièrement les manipula- 
tions. L'œuf ayant été ouvert dans une solution de sel marin, on sou- 
lève l'œuf, de manière que le blastoderme fasse saillie hors de l'eau; 
à l'aide d'une pipette ou d'un tube de verre, on fait tomber à la sur- 
face du blastoderme une petite quantité de liquide fixateur (acide 
osmique à 1 p. 100, mélange d'acide osmique et d'alcool, sérum iodé, 
liquide de Kleinenberg, acide nitrique à 10 p. 100, etc.). En mainte- 
nant le doigt à l'extrémité supérieure du tube ou de la pipette, tandis 
que l'extrémité inférieure demeure en contact avec le liquide qui 
recouvre le blastoderme, il reste ainsi au-dessus de l'aire embryon- 



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MÉTHODES EMBRYOLOGIQUES 337 

naire une quantité suffisante de liquide fixateur qu'on renouvelle au 
fur et à mesure qu'elle s'écoule, en débouchant de temps en temps 
l'extrémité supérieure du tube ou de la pipette. Au bout de quelques 
minutes, lorsqu'on juge la fixation suffisante (lorsque l'aire em* 
bryonnaire commence à noircir sous l'influence de l'acide osmique, 
par exemple), on immerge l'œuf dans la solution salée, et à l'aide de 
petits ciseaux, on pratique une incision circulaire autour de l'aire 
embryonnaire. 

Avec un peu de précaution, on fait alors flotter le blastoderme 
excisé et on le conduit dans un verre de montre, en ayant soin de le 
maintenir aussi bien étalé que possible. On peut ainsi le sortir du 
vase qui contenait l'œuf, et le transporter, soit sous le microscope, 
pour l'examiner directement, soit dans le réactif durcissant. Au préa» 
lable, on- enlève, à l'aide de pinces et de quelques secousses dans le 
liquide, le lambeau de membrane vitelline qui recouvre le blasto- 
derme. 

Pour prévenir le recoquillement des bords du blastoderme pendant 
le durcissement Romiti recommande de placer celui-ci sur la face 
convexe d'un verre de montre {DolL Soc. Cuit. Se. Med. Siena, 
III, 1885; Journ. Roy. Mie. Soc., VI, 1886, p. 870). 

La fixation par Tacide nitrique à 10 p. 100 présente l'avantage de 
faciliter beaucoup la séparation du blastoderme. On laisse agir 
l'acide pendant dix minutes, et l'on porte dans de la solution d'alun 
à 2 p. 100(HoFMANN, Zeil. f. wiss. Mik., X, 4, 1893, p. 483). 

Pour le durcissement, Foster et Balfour [Éléments dC embryologie) 
recommandent le liquide de Kleinenbcrg pendant cinq heures, puis 
l'alcool. On peut employer aussi l'acide chromique, une solution 
à 1/1000 pendant vingt-quatre heures, puis une solution plus forte 
à 3/1000 pendant encore vingt-quatre heures ; l'embryon est mis 
ensuite dans l'alcool à 70*», pendant un jour, dans l'alcool à 90** pen- 
dant deux jours, et enfin dans Talcoôl absolu. Si la préparation n'est 
pas absolument débarrassée d'acide chromique, il faut avoir soin 
de changer l'alcool jusqu'à ce que l'acide ait complètement dis- 
paru. 

Foster et Balfour ont employé aussi une solution d'acide osmique 
à 0,5 p. 100, dans laquelle on laisse l'embryon pendant deux heures 
et demie, à l'obscurité et dans un vase fermé. On met ensuite la pré- 
paration dans l'alcool absolu, en prenant soin d'enlever complètement 
l'acide par plusieurs lavages à l'alcool. 

Nous préférons l'emploi simultané de l'acide osmique et de l'al- 
cool, d'après la méthode de Ranvier et Vignal (n*> 39), ou du liquide 

ANAT. UICROSC. 22 



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•■',rpr -^ TîTt^r^^fÇfWïjrVWf'i' 



33«i 



CHAPITRE XXIV 



de Flemming, avec durcissement dans des alcools de plus en plus 
forts. 

La coloration et Tinclusion des embryons d'Oiseaux ne présentent 
rien de spécial. 

502. Méthode de Mathias Duval [Ann. des Se. nat. ZooL, 1883). 
— Dans les premiers stades du développement de l'œuf d'Oiseau, 
avanl l'apparition de la ligne primitive, il est difOcile d'orienter la 
cicalricule durcie, afin de pratiquer des coupes suivant une direction 
déterminée. M. Duval, se basant sur ce fait que dans l'œuf incubé 
Fembryon est presque toujours cour.hé sur le jaune, de telle sorte 
que Le gros bout de l'œuf est à sa gauche et le petit bout à sa droite, 
oriente le blastoderme de la manière suivante. Avec une petite bande 
de papier, large de 5 millimètres et longue de 50 millimètres, on fait 
une sorte de cuvette triangulaire sans fond. Celle-ci est appliquée à la 
surface du jaune, autour de la cicatricule, de façon que sa base 
réponde à la future région antérieure, et son sommet à la future 
région postérieure de l'embryon. C'est-à-dire que si le gros bout de 
rœuf est à la gauche de l'observateur , le triangle en papier aura son 
sommet dirigé vers l'observateur. 

Avec une pipette on remplit la cuvette en papier d'une solution 
d'acide osmique à 1 p. 300 ; au bout de quelques minutes, quand le 
fond de la cuvette commence à noircir, on dépose l'œuf dans une 
solution faible d'acide chromique : l'albumine est enlevée, et la pièce 
est mise dans une solution propre d'acide chromique, où elle durcit 
en quelques jours. Il reste sur la sphère vitelline une surface triangu- 
laire noire, comprenant la cicatricule et indiquant de quel côté se 
trouve la partie antérieure ; on détache avec un scalpel et de fins 
ciseaux cette portion triangulaire, dont on achève le durcissement 
par l'acide chromique et l'alcool. 

Duval conseille aussi d'activer le durcissement en plaçant l'œuf, 
apris l'action de l'acide osmique, dans une solution chromique qu'on 
porte à l'ébullition au bain-marie : après refroidissement, on enlève 
la région du triangle noir, qui est ensuite durcie plus complètement 
par l'acide chromique et l'alcool. 

La pièce durcie est montée dans le coUodion ; on pratique le collo- 
dionnage des surfaces de section, et les coupes sont colorées par une 
solution de picrocarmin étendue d'une forte proportion de glycé- 
rine, 

A consulter, la critique et modification de cette méthode par Kionka 
{i4/iii(. Hefte, X, p. 391 ; Zeit. f. wiss. MiL, XI, 2, 1894, p. 250 (coloration 



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MÉTHODES EMBRYOLOGIQUES 339 

par le carmin boracîque, en ajoutant à Talcool acidulé de lavage quelques 
gouttes de solution aqueuse d'orange G, qui colore le vitellus en jaune). 

563. Préparation de l'embryon tout entier. — Lorsque Tem- 
bryon a été fixé par Tacide picrique, Tacide osmique ou le sérum iodé, 
puis durci par l'alcool, on peut, jusque vers la cinquantième heure 
environ, en faire des préparations permanentes en surface. L'embryon 
est coloré par Tune des méthodes indiquées ci-dessus, puis monté 
dans la glycérine ou dans le baume, après déshydratation. A partir 
du troisième jour, l'embryon est trop volumineux pour pouvoir être 
commodément préparé ainsi en totalité. 

Cependant, avec beaucoup de patience, on y arrive, même après 
deux semaines d'incubation, en enlevant soigneusement la coquille 
morceau par -morceau, tout en laissant les membranes entières, 
voyez IIiROTA, Journ, Roy. Mie. Soc.^ 1898, p. 118. 

REPTILES 

564. — Les méthodes exposées pour les embryons des Oiseaux 
sont applicables à Tétude du développement des Reptiles ; pour les 
premiers stades du développement, le blastoderme sera durci en place 
sur le vitellus ; plus tard l'embryon sera isolé facilement et traité par 
le liquide de Kleinenberg et l'alcool (Strahl, Arch. f. Anat. u. Phys.j 
1881, p. 123). 

Voici le fixateur spécial de Perenii pour les embryons de Laceria 
{Zool. Anz., 274, 1888, p. 139, et 276, p. 196). 

Acide nitrique à 20 p. 100 3 parties 

Acide chromique à i p. 100 3 — 

Alcool absolu 4 — 

Laisser agir vingt minutes, laver à l'eau. 

A consulter aussi, outre la technique de Kupffer {Archiv f. Anal. 
u. Entwîck., 1882, p. 4), celle de C.-P. Sarasin {Semper's Arbeilen, 
1883, p. 159), et celle de Mitsukuri (/ourn. Roy. Mic.Soc. ,i»9i, p. 750). 

AMPHIBIENS 

565. Préliminaires. — Les œufs des Amphibiens, qu'on peut se 
procurer très aisément, sont cependant difficiles à préparer à cause 
de l'épaisse couche d*albumine qui les entoure. La transparence de 
cette enveloppe permet de suivre à la loupe ou au microscope les pre- 



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340 CHAPITRE XXIV 

mières phases de la segmentation et les différents stades du dévelop- 
pement de Tembryon ; il suffît pour cela d'éclairer Tœuf à Taîde d'une 
lentille qui concentre à sa surface les rayons solaires, ou les rayons 
émis par une lumière artificielle. 

Lorsqu'on veut soumettre les œufs à la méthode des coupes, il est 
indispensable de les dépouiller de leur enveloppe albumineuse. En 
plaçant des œufs de Grenouille ou de Crapaud dans une solution 
d'acide chromique à 1 p. 100 pendant deux ou trois jours et en les 
secouant vivement dans le liquide, on les débarrasse de leur albu- 
mine ; mais les œufs ainsi traités sont très cassants et ne donnent que 
de mauvaises coupes. Ils peuvent cependant être conservés dans la 
gélatine fondue et très concentrée pour l'étude des formes extérieures. 

Un procédé plus efficace a été décrit par Wditman {Atner. Natural.j 
XXII, 1888, p. 857) et BLOCiiiiANN {ZooL Anz., 1889, p. 269). Wuitman 
met les œufs, après fixation, dans une solution à 10 p. 100 d'hypo- 
chlorite de soude allongée de S à 6 volumes d'eau, et les y laisse jus- 
qu'à ce qu'on puisse les débarrasser de l'albumen par l'agitation. Pour 
les œufs de Necturus cela arrive en quelques minutes. Blocqmann 
prend de l'eau de Javelle allongée de 3 à 4 volumes d'eau et y secoue 
les œufs (fixés dans le mélange de Flemming) pendant quinze à trente 
minutes. 

666. Grenouille. Méthode de Morgan [Amer, Nat,, XXV, 1891, 
p. 759; Journ, Roy. Mie. Sod 1892, p. 284). — Pendant certaines 
périodes du développement des œufs de Grenouille il est très difficile 
de les débarrasser de la membrane albumineuse intérieure. Morgan 
procède comme suit. Chaque œuf est découpé de la masse albumineuse 
générale et mis pour une heure ou jusqu'à douze heures dans une 
solution saturée d'acide picrique dans de l'alcool à 35 p. 100 addition- 
née d'acide sulfurique dans la même proportion que dans le liquide 
de Kleinenberg. Puis on passe par des alcools successivement plus 
forts depuis 33 p. 100 jusqu'à 70 p. 100. Après que Tœuf a été environ 
deux jours dans l'alcool à 70 p. 100 la membrane intérieure com- 
mence à gonfler; le troisième ou quatrième jour, on peut la piquer 
avec une aiguille et en extraire l'œuf (Cf. aussi Wuitman, MethodSj etc., 
p. 156, et ScuuLTZE, Zeii. f. wiss. ZooL, V, 1887, p. 177). 

667. Grenouille. Méthode de 0. IIertwig [Jenaische Zeitschrift 
f.Natwwiss., XVI, 1883, p. 249). — Les œufs sont placés dans l'eau 
chaude presque bouillante (90 à 96° C.) pendant cinq à dix minutes. 
L'œuf est coagulé et en même temps durci, tandis que l'enveloppe 



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MÉTHODES EMBRYOLOGIQUES 3ii 

gélatineuse se sépare un peu de la surface de Tœuf et devient plus 
friable. On coupe l'enveloppe de Tœuf sous Teau et on en fait sortir le 
contenu. A Taide d'un tube de verre formant pipette on transporte lea 
œufs dans une solution d'acide osmique à iji p. 100 ou dans Talcoo] 
à 70®, 80° et 90**. L'acide chromique rend les œufs cassants ; ceux-ci 
ne doivent pas rester dans la solution plus de douze heures. Les œuf^i 
durcis dans l'acide chromique ne changent pas de forme et ne de- 
viennent pas mous quand on les met dans l'eau ; ceux qui ont été 
traités par l'alcool perdent leur dureté, gonflent, et changent souvent 
de forme quand on les met dans l'eau ou dans l'alcool faible. L'acide 
chromique détruit ou altère le pigment de l'œuf ; l'alcool au contraire 
le conserve, ce qui est très important pour l'étude des feuillets em- 
bryonnaires. 

On peut colorer les œufs par des teintures alcooliques ; mais lu 
coloration se fait mal pour les œufs durcis par l'acide chromique. 

A consulter aussi pour Rana, Wiutman, Meth., p. 156 (acide osmique 
à 0,S5 p. 100 vingt minutes; mélange chromo-platinique, vin^î- 
quatre heures; eau, deux heures ; alcool; carmin boracique), et 
pour la tératologie expérimentale de ces œufs, Roux, Anat. Anz., IX, 
no 8, p. 248 et n® 9, p. 265. 

568. AxolotL — Les œufs de l'Axolotl sont plus faciles à préparer 
que ceux des Batraciens anoures, parce que le vitellus est séparé de 
la couche albumineuse par un large espace rempli de liquide qui ne 
se coagule pas sous Faction des réactifs. Les œufs sont placés dans le 
liquide de Kleinekberg, ou celui de Mayer, pendant quelques heures ; 
puis, à l'aide de petits ciseaux ou d'aiguilles, on ouvre le chorlou 
interne et on fait échapper l'œuf à travers l'ouverture par une légen 
pression. On traite ensuite par l'alcool faible, puis par l'alcool de 
plus en plus fort. 

Une méthode qui nous a donné aussi de bons résultats est celle que 
Hertwig emploie pour la préparation des œufs de Grenouille (voir 
n® 567). Les œufs sont colorés en masse par le carmin boracique on 
le carmin aluné acide et inclus dans la paraffine ou la celloïdine, 
Quand ils sont inclus dans la celloïdine, on pratique le coUodionnag^ 
des coupes suivant la méthode de Duval. 

569. Triton. Méthode de W.-B. Scott et H. -F. Osborn {Quari, 
Journ, ofMic, Se. y 1870, p. 449), — La préparation des œufs de Triton 
présente de grandes difficultés. Avant de durcir Tœuf, il faut au préa- 
lable le débarrasser de sa couche d'albumine ; le vitellus étant trè^ï 



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342 CHAPITRE XXIV 

fluide et la membrane vitelline étant très délicate, cette opération 
doit être faite avec les plus grands soins. Il existe dans la couche d'al- 
bumine plusieurs membranes concentriques, et il faut inciser chacune 
d'elles avec des ciseaux fins avant de pouvoir extraire Tœuf ou l'em- 
bryon. Ceux-ci sont fixés, soit par l'acide osmique, soit par le bichro- 
mate de potasse ou le liquide de Muller ; mais le meilleur réactif est 
le liquide de Kleinenberg. On achève le durcissement par l'alcool 
et on colore par Thématoxyline de Kleinbnberg. 

570. Méthode de Hertwig {Jen. Zeitschr. f. Naturwiss., 1881-82, 
p. 291). — Les œufs sont mis dans un mélange à parties égales d'acide 
acétique à 2 p. 100 et d'acide chromique à 0,8 p. 100. Au bout de dix 
heures on coupe les membranes et on place les embryons dans 
l'alcool à 70°, 80^ et 90*^. Pour faire sortir les embryons de l'œuf, il 
suffit de couper avec de petits ciseaux l'une des extrémités du chorion 
interne et d'exercer sur ce dernier une légère pression à l'aide d'une 
aiguille. 

571. Sulfate de cuivre. —Nous empruntons à Fol {Lehrbuch, p. 106) 
la formule d'un mélange dû à Remak et modifié par Goette, qui rendrait 
des services pour le durcissement des œufs d'Amphibiens. 

Sulfate de cuivre ^ solution aqueuse à 2 p. 100. . 50 ce. 

Alcool à 25 p. 100 50 — 

VinaigFe de bois rectifié XXXV gouttes. 

572. Autres méthodes — A consulter aussi les procédés de Born 
{Arch. f. mik. Anat,, 43, 1894, p. 1); et de Rabl {ZeiL f. wiss. Mik., 
XI, 2, 1894, p. 165. (Nous avons déjà donné les procédés de fixation 
de ce savant.) 

POISSONS 

573. Poissons osseux. — L'œuf de beaucoup de Poissons osseux 
peut être étudié à Tétat vivant par transparence ; mais celui des 
Salmonidés doit être durci et dépouillé de sa membrane d'enveloppe, 
si Ton veut étudier les formes extérieures de Tembryon. Enfin tous 
les œufs doivent être fixés avec soin et durcis lorsqu'ils sont destinés 
à être mis en coupe. 

Pour l'étude de la forme extérieure de l'embryon, les œufs sont 
mis pendant quelques minutes dans de l'eau acidulée par l'acide acé- 
tique (1 à 2 p. 100), puis dans une solution d'acide chromique à 
1 p. 100. Au bout de trois jours, on enlève la capsule de l'œuf au 



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MÉTHODES EMBRYOLOGIQUES 343 

moyen de petites pinces fines, en ayant soin d*entamer la capsule du 
côté opposé au germe ou à l'embryon, pour ne pas les endommager. 
L'œuf dépouillé de sa membrane est mis dans Teau distillée pendant 
vingt*quatre heures, puis dans Talcool faible et finalement dans 
Talcool à 90o. Les embryons ainsi préparés ne sont pas déformés, et 
leurs éléments histologiques sont à peu. près bien conservés. Mais la 
masse vitelline devient rapidement très dure et très cassante, ce qui 
est un grave inconvénient pour la pratique des coupes. 

Les procédés suivants donnent d'excellents résultats au point de vue 
de la préparation des embryons destinés à être coupés. 

Les œufs sont placés pendant quelques minutes dans une solution 
d'acide osmique à 1 p. 100 ; lorsqu'ils ont pris une coloration brun 
clair, on les transporte dans un vase renfermant de la liqueur de 
MûLLER. Dans ce liquide chaque œuf est ouvert avec des ciseaux fins; 
le vitellus, qui se coagule immédiatement au contact de l'eau, se dis- 
sout au contraire dans le liquide de MUller ; le germe et la couche 
corticale peuvent être extraits de la capsule de l'œuf. Le germe ou 
l'embryon sont laissés dans de la liqueur de Mûller propre pendant 
quelques jours, puis lavés avec soin dans l'eau pendant vingt-quatre 
heures ; on les met ensuite dans l'alcool faible^ puis dans l'alcool 
fort. 

Un autre procédé, qui nous a toujours bien réussi, consiste à fixer 
les œufs dans le liquide de Kleinenberg additionné de 10 p. 100 
d'acide acétique. Au bout de dix minutes, les œufs sont ouverts dans 
de l'eau renfermant 10 p. 100 d'acide acétique qui dissout le vitellus. 
Les embryons extraits des œufs sont mis pendant quelques heures 
dans le liquide de Kleinenberg pur, puis dans l'alcool à 60^ à 70^ et 
à90^ 

Les embryons durcis sont colorés en masse par le carmin aluné 
acide, le carmin boracique ou Thématoxyline, et enrobés dans le 
collodion ou la paraffine. 

574. Méthode de Kollmann. — KoUmann recommande beaucoup pour 
flxer les œufs de Téléostéens un mélange contenant : 

Bichromate de potasse 5 p. 100 ' 

Acide chromique 2 — 

Acide nitrique concentré 2 — 

(Nous citons textuellement. Nous supposons qu'il faut entendre un mé- 
lange de 5 parties de bichromate, 2 d'acide chromique, 2 d*acide nitrique, 
et 91 d'eau; et non point un mélange à volumes égaux de solutions de ces 
substances aux titres indiqués.) Les œufs doivent y rester douze heures. On 
les lave à Teau pendant douze heures. On enlève alors le chorion, et on les 



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^'^'^p^™' ' 



344 



CHAPITRE XXIV 



met dans de Talcool, à 70 degrés. KoUmann fait observer qu'il est impor- 
tant que ces œufs soient fixés très rapidement. Voyez VArch, /*. Anat. u. 
PhyitioL, de His et Du Bois-Reymond, 1885, p. 296. 

575. Méthode de Kupffkr (Arch, f. Anat. u. EntwicL, 1884, p. 20).— 
KupfTer place les œufs dans une solution d'acide chromique à 1/3 p. 100, 
pendant vingt-quatre heures, puis pour deux heures dans Teau distillée. On 
enlève la capsule de Tœuf. Eau. Alcool. Coloration. Coupes. 

576. Méthode de Rabl (voir n® 553). — Méthode de Perenyi (voir 
no 51). 

577. Méthode cTAgassiz et Whitman {Proceed, of the American 
Acad, of arts and sciences, XX, 1884). — Les œufs sont placés 
dans un verre de montre, dans quelques gouttes d'eau de mer à 
laquelle on ajoute une quantité égale d*une solution d'acide osmique 
à 1 p. 100. Après cinq à six minutes, les œufs sont transportés dans 
le liquide de Merkel, modifié par Eisig (n*^ 53). On les y laisse pen- 
dant vingt-quatre heures ou plus. On peut alors séparer le blasto- 
derme du vitellus à Taide d'aiguilles. Pour les stades plus avancés 
du développement, les auteurs préfèrent Temploi du liquide de 
Perenyi. Voir aussi WmiMAN, Methods, etc., p. 152, et Journ.Roy. Mie. 
Soc, 1883, p. 912. 

678. Méthode de GoRONOwiTScn {Morph. Jahrb,, X, 1884, p. 381). 

— Pour obtenir des vues en surface, l'auteur met les œufs dans une 
solution d'acide nitrique à 5 p. 100 jusqu'à ce que l'embryon devienne 
visible à travers la membrane (au bout de trois minutes), puis il les 
place dans une solution d'alun à 5 p. 100. Au bout d'une heure le 
vitellus est transparent et l'embryon se détache sur lui en blanc. On 
coupe la membrane de Tœuf dans la solution d'alun et on la sépare 
de l'embryon. Si Ton veut conserver la préparation, on la monte 
dans la glycérine à 10 p. 100, à laquelle on ajoute une petite quantité 
de sublimé. 

579. Développement des nerfs crâniens des Plagiostomes. 

Méthode de Milnes Marsuall {Qimrt. Journ, ofMic. Se, 1881 , p. 72). 

— Les embryons sont placés pendant vingt-quatre heures dans une 
solution d'acide chromique à 1/4 p. 100, à laquelle on ajoute 
quelques gouttes d'acide osmique à 1 p. 100. Alcool, etc., comme 
d'habitude. 

580. Gyclostomes. Méthode de Calberla {Arch. f. mikr. Anat. y 



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MÉTHODES EMBRYOLOGIQUES 3&5 

III, p. 238). — Acide chromique à 1 p. 100 pendant huit à douze 
heures, puis alcool à 90^. Pour les embryons plus avancés, le liquide 
de Mgkkel. 

TUNICIERS 

581. Ascidies (Maurice et Sciiulgin, Ann. Se. Nai.^ Zool., XVII, 
1884). — Les embryons A'Amarœcium^ préalablement retirés de la 
cavité incubatrice de leur mère, sont colorés au carmin boracique, 
décolorés par l'acide chlorhydrique, puis lavés dans Talcool à 70^. 
Ensuite on les met pendant quinze à vingt heures dans une solution 
extrêmement faible de bleu de Lyon dans Talcool à 70^ additionnée 
de quelques gouttes d'acide acétique. Après coloration, éclaircir 
rapidement et inclure dans la parafûne. Ce procédé est surtout 
recommandable pour la facilité avec laquelle il permet de distinguer 
les trois feuillets de l'embryon. L'ectoderme prend une coloration 
beaucoup plus foncée que l'endoderme, ces deux feuillets paraissant 
surtout bleus, tandis que les cellules mésodermiques, à cause de leurs 
noyaux volumineux, semblent presque entièrement rouges. 

582. Distaplia (Davidoff, Mîtth. Zool. Stat, Neapel, IX, 1, 1889, 
p. 118). — Le meilleur fixateur pour les œufs est un mélange de 3 par- 
ties de solution saturée de sublimé avec 1 partie d'acide acétique cris- 
tallisable. Laisser agir unedemi-heure.ou une heure, passer par l'eau 
et les alcools. Un autre mélange presque aussi bon consiste en 3 par- 
ties de solution saturée d'acide picrique, et 1 d'acide acétique, qu'on 
laisse agir pendant trois à quatre heures et porte ensuite dans 
l'alcool kJO p 100. 

mollusques 

583. Céphalopodes (Ussow, Arch. de Biologie, II, 1881, p. 88â). 
— Les œufs (du Loligo vulgaris) sont placés, sans qu'on ait enlevé 
le chorion, dans une solution d'acide chromique à 2 p. 100, pendant 
deux minutes, puis l'œuf est mis dans un verre de montre rempli 
d'eau à laquelle on ajoute une goutte d'acide acétique. Au bout de 
deux minutes on peut enlever facilement le chorion. Le vitellus de 
nutrition se répand dans l'eau ; le vitellus de formation, ou le blas- 
toderme, qui a été seul durci par l'action rapide de Tacide chromique, 
reste seul et peut être coloré par le carmin et monté dans la glycé- 
rine. 



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346 CHAPITRE XXIY 

Watasé {Journ. of Morph., IV, 1891, p. 249 ; Journ. Roy, Mie. 
Soc. y 1892, p. lo2) fixe dans le liquide macérateur des Hertwig, 
(n^ 512), et aussitôt que le blastoderme est devenu opaque il Tenlève 
avec des ciseaux dans de la glycérine diluée. Le liquide de Perenyi 
donne de bonnes images superficielles de la segmentation. 

584. Hélix. — Nous avons obtenu de bonnes préparations d*em- 
bryons à! Hélix en opérant de la manière suivante : les œufs sont mis 
dans le liquide picro-nitrique (n^ 77) pendant quatre à six heures. Le 
carbonate de chaux qui incruste la membrane extérieure est dissous 
et Tenveloppe albumineuse de Tœuf est coagulée. On ouvre l'œuf 
avec des aiguilles; Talbumine se détache par fragments et on peut 
facilement extraire Tembryon. Celui-ci est traité successivement par 
l'alcool à 50^, 70® et 90<>, puis coloré par le carmin borate alcoolique 
ou rhématoxyline et monté dans la paraffine après avoir été déshy- 
draté et traité par l'essence de girofle ou l'huile de cèdre. 

585. Limace {Limax campestris). Méthode de Mark {BulL Mus. 
Comp. ZooL Hai^ard Coll., VI, 1881). — Les œufs sont traités par 
l'acide acétique à 1 à 2 p. 100 pendant quatre heures ou plus. On prend 
l'œuf entre le pouce et l'index de la main gauche, on introduit la 
pointe d'une paire de ciseaux fins à travers les deux membranes 
externes, et on pratique une ouverture suffisante pour que la mem- 
brane résistante de Talbumine s'échappe avec son contenu. On place 
l'œuf sur une lame de verre avec une goutte d'eau et on enlève les 
enveloppes extérieures. Des portions de l'enveloppe semi-fiuide res- 
tent attachées à la surface de la membrane résistante. Sous une loupe 
à disséquer on enfonce une aiguille à travers la membrane résistante 
et on maintient l'œuf, tandis qu'avec une autre aiguille on déchire la 
membrane pour faire sortir l'œuf avec l'albumen. On sépare l'œuf de 
l'albumen; on colore et on monte à la glycérine. 

Pour les stades plus avancés du développement et pour pratiquer 
des coupes, on traite par l'acide osmique au lieu d'employer l'acide 
acétique, et on durcit les enveloppes albumineuses en même temps 
que l'œuf. 

Voici les procédés recommandés par Henchman {Bull. Mus. Comp. 
Zool. HarmrdColl., XX, 1890, p. 171 ; Journ. Roy. Mie. Soc., 1891, 
p. 274) pour le traitement des embryons de L. maximus. On récolle 
une trentaine d'individus adultes et on les met dans un seau de fer- 
blanc muni d'un couvercle percé de trous. On les nourrit de choux en 
ayant soin de les tenir très proprement. On trouve les œufs en géné- 



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MÉTHODES EMBRYOLOGIQLES 3 H 

rai le malin, disposés par paquets. Dans un local chaud l'éclosion a 
lieu entre le vingt-deuxième et le vingt-septième jour. Il faut bien 
veiller à ce que les œufs ne se dessèchent pas. Fixation par Tacide 
chromique à 0,33 p. 100 ou par le liquide de Perenyi. Il vaut mieux 
n'enlever que l'enveloppe externe avant de mettre les œufs dans le 
liquide ; après un séjour de deux ou trois minutes dans le liquide, 
l'enveloppe interne peut être enlevée. Cependant si l'on emploie le 
liquide de Perenyi il est nécessaire d'éloigner les deux miembranes en 
premier lieu, sinon l'albumine sera coagulée d'une façon qui empêche 
de sortir les embryons. 

Voir aussi Schmidt, Studien zur Entwickelungsgesch, d. Pulmo-- 
naten, Dorpat, 1891 ; et Wasuburn, Amer. NaturaL^ XXVIII, 1894, 
p. 528, ou Joum, Roy, Mie. Soc, 1894, p. 531. 

686. Gliiton. Voir Metcalf, Stud. BioL Lab. John Ifopkins Univ., 
V, 1893, p. 251 ; Joum. Roy. Mie. Soc., 1894, p. 129. 

ARTHROPODES 

587. Fixation. — La grande majorité des auteurs très nombreux 
que nous avons consultés sont d'accord que les œufs des Arthropodes 
se fixent en général mieux par la chaleur que de toute autre façon. 
Si l'on désire éviter l'emploi de la chaleur, nous conseillons d'essayer 
l'acide picro-sulfurique (concentré) ou le liquide de Perenyi. 

588. Enlèvement des membranes. — Cette opération est sou- 
vent fort délicate et il se peut que ce soit indiqué de ne pas la tenter, 
mais de laisser les membranes en place et se contenter de les ramollir 
par l'eau de Javelle ou l'eau de Labarraque (Looss, List). Morgan 
{Ame7\ Natural, 1888, p. 357; Zeit. f. wiss. Mik., VI, I, 1889, p. 69) 
recommande pour les œufs de Pei'iplaneta l'eau de Labarraque allon- 
gée de 5 à 8 volumes d'eau et légèrement chauffée. Ce liquide ramol- 
lira suffisamment les membranes en trente à soixante minutes si on 
l'emploie avant fixation ; les œufs fixés demanderont plus de temps. 
Il va sans dire qu'on doit veiller à ce que le liquide ne pénètre pas 
dans l'œuf. 

SB9. 3féthode8 dellENKiNG. — Pour tout ce qui regarde cette branche 
de la technique, consulter le travail minutieux de ce spécialiste dans 
Zeil. f. wiss. J/iA., VIII, 2, 1891, p. 156. Le cadre de cet ouvrage 
ne nous permet de citer qu'un procédé qui est dit éviter la difficulté 



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348 CHAPITRE XXIV 

causée par la friabilité du vitellus, qui s'oppose beaucoup à la confec- 
tion des coupes. Après fixation et passage par les alcools, piquer le 
chorion avec une aiguille, et colorer au carmin boracique. Mettre pen- 
dant douze heuresdans un liquide composé de 20 ce. d*alcoolà70p. 100, 
une goutte d'acide chlorhydrique concentré, et la pointe d'un couteau 
de pepsine. On traite ensuite par l'alcool, l'essence de bergamote et 
la paraffine, et, à quelques exceptions près, parmi lesquelles les œufs 
de Bombyx mori^ les œufs se couperont sans se briser. 

590. Lépidoptères. Bobretzky [Zeit. f. toiss. Zool., XXXI, 1878, 
p. 198). — Les œufs (de Ptens cratœgiel de Porthesia chrysorrhwa) 
sont légèrement chauffés dans l'eau et placés pendant seize à vingt 
heures dans une solution d'acide chromique à 0,5 p. 100. Les mem- 
branes peuvent alors être enlevées et les œufs, mis pendant quelques 
heures dans l'alcool absolu, sont colorés par le carmin et coupés. 

691. Phryganides (Neophalax) et Blatte, Méthode de Patten 
{Quart. Journ, of Micr. Se, oct. 1884, p. 549). — Les œufs ou les 
larves sont placés dans de l'eau froide qu'on porte graduellement à 
80^ C. On cesse de chauffer quand les œufs sont durs et blancs. Après 
refroidissement, on les met dans Talcool à âO'^, auquel, au bout d'un 
ou deux jours, on ajoute 10 p. 100 d'alcool jusqu'à ce qu'on arrive à 
un alcool à 90^; on évite ainsi le ratatinement des tissus. Les teintures 
alcooliques peuvent seules traverser le chorion; celles qui donnent 
les meilleurs résultats sont l'hématoxyline de Kleinenberg et la tein- 
ture de cochenille de Mayer à 70 p. 100. Les œufs doivent rester dans 
l'hématoxyline pendant cinq à six jours; on les décolore graduelle- 
ment par l'alcool acidulé par l'acide chlorhydrique (une goutte d'acide 
chlorhydrique dans 20 grammes d'alcool), dans lequel les œufs 
doivent rester pendant plusieurs jours. On les transporte alors dans 
l'alcool pur, que l'on renouvelle une ou deux fois jusqu'à ce que les 
œufs aient repris leur couleur violette. On traite ensuite par l'alcool 
absolu, le benzol, une solution saturée de paraffine dans le benzol, et 
finalement on enrobe dans la paraffme pure. 

592. Aphidiens. Méthode de L. Wjll [Semper's Arheiten^ 1883, 
p. 223). — On pratique des coupes à travers le Puceron entier renfer- 
mant des œufs et des embryons. Pour cela, l'animal est mis dans de 
l'eau chaude à 70« C, puis dans Talcool faible et de plus en plus fort. 
Pour colorer en masse, il faut piquer avec une aiguille fine la cuticule 
du Puceron; le carmin au borax et l'hématoxyline sont les colorants 
qui réussissent le mieux. 



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MÉTHODES EMBRYOLOGIQUES 349 

693. Phalangides. Méthode de Balbiani. — Les œufs du Phalan- 
gium opilio sont entourés d'un chorion couvert de corpuscules jaunes 
qui les rend tout à fait opaques. Pour les éclaircir on les place dans 
une petite capsule de porcelaine renfermant de Teau à laquelle on 
ajoute quelques gouttes d'une dissolution de potasse; on chauiTe jus- 
qu'à ébullition. On met les œufs sur du papier à Gltrer et, en les frot- 
tant légèrement avec un pinceau, on enlève facilement le chorion. 
La membrane vitelline reste intacte et sa transparence permet de voir 
Tembryon. 

S94. Autres travaux à coasulter. — Blatlida, Wiieeleb, Joum. of 
Morph., III, 1889, p. 292; Joum. Roy, Mie, Soc, 1890, p. 230; Ciiolod- 
KOWSKV, Mem. Acad, Imp, SlPetcrsburg, XXXVI H, i891 ; Zeil,f, wiss. Mik,, 
IX, 1, 1892, p. 80; IIeymons, Zeil. f, wiss, ZooL, LUI, 1892, p. 434; Zeit. 
f, iviss. Mik., IX, 3, 1893, p. 3^3. Diplera, IIenking, op. cil,; Ritteb, Zeit. f. 
wiss. Zool., L, 1890, p. 408 ; Zeit. f. vnss. Mik., VUI, I, 1891, p. 87. Ara- 
neina, Kisiiinouye, ibid., IX, 2, 1892, p. 215 ; et dans les travaux plus anciens 
les suivants: -- Histolyse des tissus larvaires des Diptères, 
II. Viallanes {Ann. des Se. nat. Zool. 1883, p. 129 du lirao:e à pari). — 
Araignées, Balfour {Quart. Joum. ofmicr. Se., i880, p. 167). — Œufs 
d'Agelena, Locv (Bull. Mus. Comp. Zool., Camhridye, J/arcard Coll., XII, 
n» 3, 1880; Zeit. f. wiss. Mik., 1886, p. 2t2). — Ëcrevisse, REicnENUACii 
(Zeitseh. f. wiss. Zool., XXIX, 1877, p. 124). — Moiaa rectirostris, 
Grobuen (Arb. a. d. Zool. InH. der Univ. Wien, 1878, p. 208). — Amphi- 
podes (Orchestia); Ulianin (Zeit. f. wiss. Zool., XXXV, 1881, p, 4U). 



VERS 

595. Glepsine. 0. Whitman [Quart. Joum. of Mlc. Se., 1878, 
p. 216). 

Vues en surface des bandes germinalives. Les œufs traités par 
l'acide chromique pendant cinq à dix heures montrent bien la dis- 
position linéaire des cellules nerveuses. Pour voir la face interne, il 
est nécessaire de séparer les bandes germinatives du vitellus. Pour 
cela, Tembryon est placé à Tétat frais sur le porte-objet avec une 
goutte d'eau à laquelle on ajoute un peu d*acide acétique, avec l'ex- 
trémité d'une aiguille; à l'aide de deux aiguilles on brise l'œuf du 
côté dorsal, et on peut ainsi séparer le vitellus. On enlève une partie 
de Teau avec du papier buvard ; on ajoute quelques gouttes d'acide 
osmique sans déranger l'objet. Au bout d'une heure, on lave et on 
colore. 

596. Lombric (Lumbricus trapezoides). Kleinenberg [Quart. 
Joum. of Mie. Se., 1879, p. 207). — Les premiers stades du déve- 



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Lf-. - 



350 



CHAPITRE XXIV 



loppement peuvent être suivis sur Tœuf vivant, mais lorsque les con- 
tours des cellules cessent d'être visibles, on doit avoir recours aux 
réactifs. L'acide osmique employé à l'état de vapeur donne de bons 
résultats, mais le liquide picro-sulfurique (liqueur de Kleinenberg) 
vaut encore mieux. Lavage à l'alcool à 70° et 90°, puis coloration par 
l'hématoxyline. Déshydratation et coupes par la parafGne. 

WiLSON [Journ, of Morph., III, 1889, p. 445; Journ. Roy. Mie. 
Soc,^ 1890, p. 402) trouve que le liquide de Perenyi est le meilleur 
fixateur, étant en général supérieur même au mélange de Flemming. 

A consulter aussi pour les Chétopodes, von Wistinghausen, Mttth. 
a. d. ZooL Stat. Neapel, X, 1891, p. 41; Zeit. f. wiss. Mik., X, 4, 
1893, p.479(A^e7'ew). 

597. Planaires d'eau douce (Iuima, Zeitschrifl f. wiss. ZooL, 
XL, 1884, p. 359). — La capsule renfermant les œufs est ouverte, à 
l'aide de fines aiguilles, dans de l'acide nitrique dilué à 2 p. 100 sur 
le porte-objet. On imprime quelques secousses à la lame de verre 
pour détacher autant que possible les œufs des cellules vitellines. Les 
œufs se montrent à l'œil nu comme de petites masses blanches. Une 
lamelle supportée par de petits pieds de cire ou de petits morceaux 
de papier est placée sur les œufs. Après environ trente minutes, on 
remplace l'acide acétique par de l'alcool à 70*^. Au bout d'une heure 
on remplace l'alcool par de l'alcool à 90°, dans lequel les œufs restent 
deux heures. On substitue ensuite à l'alcool un mélange par parties 
égales d'eau et de glycérine, et finalement de la glycérine pure. Pour 
obtenir des coupes des embryons, qui sont trop petits pour être 
traités séparément, on durcit en masse le contenu de la capsule par 
l'acide chromique à 1 p. 100. 

598. Ténias (Ed. van Beneden, Arch. de Biologie^ II, 1881 , p. 187). 
— Les œufs sont soumis sur le porte-objet à l'action d'une solution 
d'acide osmique à 1 p. 100, puis traités pendant une heure environ 
par l'alcool au tiers, lavés ensuite à l'eau distillée et soumis pendant 
deux ou trois jours à l'action du picro-carmîn. On monte les œufs 
dans la glycérine picro-carminatée. Lorsqu'il s'est formé autour de 
l'embryon une membrane chitineuse, celle-ci ne permet plus aux 
réactifs de pénétrer. Avec un peu d'habitude, on parvient à enlever 
au moyen de papier à filtrer une quantité suffisante de liquide pour 
que le couvre-objet, exerçant sur les embryons une pression modérée, 
détermine la rupture de l'enveloppe chitineuse ; l'embryon peut alors 
subir l'action des réactifs. 



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MÉTHODES EMBRYOLOGIQUES 331 



ECniNODERMGS 

599. Gucumaria doliolum. Selenka (Zeilschr. f, wiss, ZooL, 
XXXV, p. 167). — Les embryons et les larves sont mis dans un verre 
de montre avec le moins d*eau possible, et traités par Tacide osmique 
ou mieux par une solution d*acide chromique à 1 ou 3 p. 100 addi- 
tionnée de quelques gouttes d'acide osmique à 1 p. 100. Au bout de 
trois à cinq minutes, on lave à l'eau, puis on traite par l'alcool, 
l'alcool absolu, l'essence de térébenthine et on monte dans le baume. 
Quand on veut pratiquer des coupes, on colore au préalable par le 
carmin et on enrobe dans la parafûne. 

coelentérés 

600. Éponges. F.-E. Sguultze {Zeit, f. wiss. Zool., XXXI, p. 29S). 
— Pour étudier le développement du Sycandra raphanus, Schultze 
place les œufs et les larves dans une petite chambre humide sur le 
porte-objet et entretient Taération de Teau au moyen de petits frag- 
ments d*algues vertes qui dégagent de Toxygène. Il Qxe les œufs par 
l'acide osmique et colore au picro-carmin. 

601. Schultze {ibid., 1880, p. 416) prépare ainsi les larves plus 
avancées et sessiles de Plakina : on choisit des larves qui se sont 
attachées à des feuilles d'algues minces ; on les traite en place, avec 
Talgue, par acide osmique, alcool à 52^ carmin aluné, eau distillée, 
alcool à 52o, alcool à 70^, 95®, absolu, essence de térébenthine, paraf- 
fme. On pratique des coupes à travers l'embryon et l'algue. 



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CHAPITRE XXV 

MÉTHODES CYTOLOGIQUES 



602. Étude de la cellule vivante. — Généralement Texamen 
de la cellule vivante, isolée ou en place dans les tissus d'un animal, 
ne donne que des renseignements très imparfaits sur la structure de 
cet clément. Les organismes inférieurs, les Protozoaires, les globules 
sanguins, les œufs, etc., peuvent cependant être étudiés à Tétat 
vivant. C'est ainsi que Balbiani a pu observer dans Tovule des 
Arachnides la formation de vacuoles dans la tache germinative et les 
mouvements de cette tache. 

On peut aussi examiner les cellules vivantes dans la queue trans- 
parente des jeunes larves d'Amphibiens, Axolotl, Triton, Grenouille, 
Crapaud. On insensibilise les larves, soit par le curare, soit parl'éther, 
soit par la nicotine. 

Curare, — On dissout une partie de curare dans 100 parties d'eau 
et on ajoute 100 parties de glycérine. On place la larve dans un verre 
de montre rempli d eau, dans laquelle on verse 5 à 10 gouttes de 
la solution, suivant la grosseur de la larve. Il faut une demi-heure à 
une heure d'immersion pour obtenir la curarisation de la larve. Il 
n'est pas nécessaire de laisser les larves dans la solution jusqu'à ce 
qu'elles soient immobiles : dès que leurs mouvements sont ralentis, 
on les enlève et on les met sur un porte-objet avec du papier brouil- 
lard. Si on les remet dans Tcau, elles reviennent à Tétat normal au 
bout de huit à dix heures, et peuvent être curarisées de nouveau 
plusieurs fois. (Peremescuko, Arch, f, mik. Anal, y XVI, 1879, p. 437.) 

Éther. — Une solution d'éther à 3 p. 100, ou d'alcool au même 
titre, peut être employée. Ces agents n'arrêtent pas le processus de 
la division cellulaire, mais leur action anesthésique est inconstante. 



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Qoo^z 



MÉTHODES CYTOLOGIQUES 333 

Tabac. — Les larves d'Amphibiens placées dans une infusion de 
tabac sont immobilisées en quelques minutes: mises dans Teau, elles 
reviennent à Tétat normal au bout de quatre à cinq heures. 

Peremeschko coupe la queue à une larve vivante, et place Torgane 
dans un milieu indifférent, tel que le sérum iodé, une solution de sel 
marin à 1 p. 100, le sirop, Teau froide (h- 1** C.) ou l'eau chaude 
(380 à 40<» G.). 

Flemming, dans le même but, a choisi la Salamandre. Chez Tadulte, 
on peut observer la vessie qui est assez transparente ; chez la larve, 
les branchies et la nageoire caudale. Les branchies sont difficiles à 
fixer dans une position convenable pour l'observation ; de plus, elles 
sont fortement pigmentées. Dans la queue, il y a toujours, au voisi- 
nage des membres postérieurs, un endroit dépourvu de pigment ; et, 
sur les larves faiblement pigmentées, on peut trouver de semblables 
endroits, sur la moitié ventrale de la queue et le long de la ligne 
latérale. Sur une larve à queue aplatie, il est possible d'étudier les 
endroits dépourvus de pigment avec un numéro 1:2 à immersion de 
Hartnack. La larve est fixée dans une cellule appropriée, ou envelop- 
pée dans du papier brouillard mouillé ; on peut aussi la curariser, 
ou en séparer la queue. Des objets favorables pour faire des prépara- 
tions sont fournis par les lamelles délicates qui sont attachées aux 
branchies cartilagineuses du côté de la bouche. 

D'autres objets favorables (Flemming, Arch. f. mik, Anat.^ XXXV, 
1890, p. 27S, et XXXVII, 1891, p. 249 et 685) sont les poumons, le 
péritoine pariétal et le mésentère de ces mêmes larves. Pour préparer 
le poumon, on prend une larve de pas plus de 4 centimètres de lon- 
gueur, et on la tue en la plongeant dans le mélange chromo-acéto- 
osmique. On ouvre par une incision la cavité du corps, et l'on sort 
les viscères avec précaution en ayant soin surtout qu'il ne se forme 
pas de plis dans les poumons, et on les laisse exposés à l'action du 
liquide. Après une fixation suffisante, on tire les poumons sur une 
lamelle, et l'on enlève à chacun d'un trait de scalpel une étroite 
lanière le long de ses bords. Gela fait, on sépare l'une de l'autre les 
deux parois pulmonaires ainsi dégagées, qui donnent chacune une 
préparation plate et mince. 

On peut aussi utiliser l'intestin de l'adulte, en en faisant des coupes 
à la paraffine (M. Heidenhain, Kern und Protoplasma^ p. 111). Get 
organe offre à l'étude les volumineuses cellules épithéliales des cryptes 
intestinaux, et de nombreux leucocytes, objet, au dire de Ileidenhain, 
particulièrement favorable. 

Lonnberg (Cf. Zeit. f. wiss. Mik., X, 3, 1893, p. 377) recommande 

ANAT. IIICROSC. 23 



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354 CHAPITRE XXV 

répithélinm intestinal d'Escargots hibernants comme fournissant des 
figures karyokinétiques en grande abondance. Les Escargots {II. po- 
matia) doivent être gardés pendant quelques jours dans une pièce 
chauffée. On les débarrasse ensuite de leurépiphragme calcaire et on 
les nourrit pendant trois jours de feuilles de chou avant de les sacrifier. 

Les larves des Salamandres sont produites par des individus adultes, 
conservés en captivité, et ayant à leur portée un vase renfermant de 
Teau dans laquelle ils déposent spontanément leur progéniture. Au 
mois de mai, on peut tuer les femelles et extraire les larves. Celles-ci 
peuvent être conservées en changeant fréquemment l'eau, et en leur 
donnant chaque jour, ou tous les deux jours, à manger des Vers 
aquatiques, tels que le Tubifex rivulorum. Il est très important que 
Talimentation soit abondante et régulière, sans quoi les cytodiérèses 
deviennent rares, et peuvent même faire défaut entièrement. , 

ScuLEiciiER {Arch. f. mik. Anat.^ XVI, p. 248) a pu suivre les diffé- 
rentes phases de la karyokinèse dans les cellules vivantes du cartilage 
des têtards de Grenouille et de Crapaud. Le cartilage se desséchant 
très vite au contact de l'air, il faut, pour en étudier des coupes 
fraîches, les placer de suite sous une lamelle lutée ensuite avec de la 
parafline. On peut aussi se servir de la chambre humide ; si on veut 
employer des réactifs, on les fait arriver par imbibition sous la 
lamelle. 

603. Coloration des cellules vivantes. — Voyez au numéro 97. 

604. Étude des cellules fraîches, soit lég^èrement fixées. — 

Flemming a fait remarquer avec raison que certains liquides dits 
indifférents ne sont pas cependant sans action sur les cellules et les 
noyaux; tels sont le sérum iodé, l'eau salée, le sérum sanguin, 
l'humeur aqueuse, la lymphe, etc., qu'il faut considérer comme des 
agents fixateurs faibles. Entre ces fixateurs très faibles, et les réactifs 
énergiques tels que le mélange de Flemming ou les solutions concen- 
trées de sublimé, viennent se placer des fixateurs doux comme l'acide 
picrique ou l'acide acétique dilué. Ce sont ces agents doux dont il 
convient de faire usage pour l'étude des cellules fraîches et isolées. 

Voici un exemple de ce genre de travail. On dissocie avec des 
aiguilles un lambeau de tissu vivant dans une goutte de solution forte 
de vert de mcthyle additionnée d'environ 0,75 p. 100 d'acide acétique. 
Les cellules sont tuées instantanément dans ce liquide, sans subir de 
changement de forme. On achève la fixation en exposant la prépara- 
tion pendant un quart d'heure aux vapeurs d'acide osmique, on 



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MÉTHODES CYTOLOGIQUES 335 

ajoute une goutte de solution de Rîpart et Petit, et Ton couvre d'une 
lamelle mince. Un autre procédé consiste à fixer d'abord par les 
vapeurs d'acide osmique, pendant trente secondes à deux minutes, 
puis à ajouter une goutte de vert de méthyle, et après cinq minutes 
laver à Tacide acétique à 1 p. 100 et monter dans une goutte de 
solution de Ripart et Petit. 

Ou bien on peut fixer les cellules en dissociant le tissu vivant dans 
de la solution de Ripart et Petit, qu'on peut additionner au besoin 
d'une trace d'acide osmique, et colorer ensuite par le vert de méthyle. 

L'élaboration de ces méthodes importantes est due en grande par- 
tie à Carnoy. 

Pour Tétudede beaucoup de cellules, surtout des éléments du testi- 
cule, on peut employer avec succès la méthode de Pictet [Milth. aus 
d.ZooL Station zu NeapeL, Bd X, Ht. i, 1894, p. 92). Les éléments sont 
dissociés dans une solution de chlorure de manganèse de 1 àlOp.lOO 
additionnée de violet dahlia. La concentration du liquide doit varier 
avec la nature des éléments, et Ton doit déterminer le degré de con- 
centration au moyen de quelques tâtonnements, soit en ajoutant de 
l'eau à la solution, soit en la renforçant avec une solution plus forte 
de chlorure de manganèse. 

A consulter aussi lamélhodede Flemming (v4rc/i. /*. miL Anal, y XX, 188i, 
p. 3) pour l'élude de la division des œufs d'Echinodermes. Flemmingse ser- 
vait pour fixer et colorer en même temps du carmin acétique de Schneider, 
ou bien il colorait d'abord par une goutte de safraaine, et fixait les 
cellules ensuite par Tacide acétique, qui servait en même temps à différen- 
cier la couleur. On trouvera certainement que pour la majorité des objets 
les méthodes de Carnoy valent mieux. 

Il va sans dire qu'on peut varier les méthodes que nous avons 
décrites par l'emploi d'autres fixateurs et d'autres colorants. Le brun 
Bismarck est un colorant fort commode pour ce genre d'observations. 
On peut le dissoudre dans de la glycérine diluée. 

606. Quelques réactions microchimiques. -- Le vert de 
méthyle est un réactif pour la nucléine (soit chromatine) à l'état frais 
tout comme l'iode est un réactif pour l'amidon. Il ne colore, au sein 
du noyau^ que la chromatine seule ; il ne colore ni les nucléoles, ni 
le caryoplasma (ou suc nucléaire des auteurs), ni la membrane. C'est 
pour cela que nous lui attribuons le caractère de réactif spécifique 
de la nucléine, caractère qu'il ne convient pas d'attribuer aux car- 
mins, à l'hématoxyline, à la safranine, etc., ces réactifs colorant 
selon les cas d'une manière plus ou moins intense les nucléoles, le 



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V* ' v»4.vr ', * *** *', %•*"'.' '.r. :»^i ».-,;♦ ..l'i-^-jr» i* :* "^-fc-'-i: *c 

fp4,é,ut$f H 4 huUf.^, moyé-ji; ponr éUbiîr ave^ c^rtlî^de «a p-ivs^nce 
//o \hh'*ftfA> '1^ U untShu*'., 0%l à CA»5vr rovez s*?:* p-j: i* plions 
iU'\tui* \K^'/t, pa%$irn, i\u*', r^vj^nt l'honneur d'aroir établi ce principe, 
^t 'I /iv'/ir i/iM ''(1 *t'M\rf*, A* mut manière sysl^maliqae les méthodes 
iu'i''t*t*'Uuw\nt'A dttfM IV'tude de« noyaux. Nous lui empruntons les 
)i^di/'/itioiii( «uivanl/^it. Ijh uw-M'iufi he distingue C.iB50T, Manuel 
flfi Mlt'rhnrjijdf.^ fUt,, iHlil^ de» lécilhine» et des albaminoîdes en ce 
tfut\ h l't'ttt'ttttirn d'î i'j'WcH'Cï^ elle ehl insoluble 'ou à peu près dans 
l'i'/iu el l/'n rt/îiden mio/fraux étendus tels queTacide chlorhydrique au 
tuWVsi'iUf. \'AU: f^i f/icilemenl Koluble dans les acides minéraux con- 
vt*uU'U^ thiun \t*% ulcaliH u\(*\ïui Irén dilués, et dans quelques selsalca- 
liiiM, \i*\n que h) rarhonate de potasne et le biphosphate de soude. 
\'M |ir(''MciM!e d'une noliilion de chlorure de sodium au dixième, elle 
«e M'enfle et runne une niaHKR gélatineuse, ou même, ce qui arrive 
nouvf'iil, m (liHH<Hil entièrement (Carnoy, La Biologie cellulaire^ 
p. 2(IH ii)\)], V*\\i\ ne ne diffère (Uirsqu'elle est in situ dans le noyau) 
f|ireii ptirlin dniiK le lirpiide digestif. Dans la pratique, on peut em- 
ployer* «•oniine diNHolvantn la potasse à 1 p. iOO, Tacide chlorhydrique 
tUniaiit, (Ml, ee (|ui vaut souvent mieux, le cyanure de potassium ou 
le eiirhonale de potasse, (jarnoy (loc. cil,, p. î244) préfère en général 



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MÉTHODES CYTOLOGIQUES 357 

ces deux réactifs aux alcalis dilués. Il les emploie en solution de 40 à 
50 p. 100. Si Ton désire enlever toute la nucléine, il est nécessaire de 
prolonger l'action des dissolvants, surtout lorsqu'on opère sous le 
verre à couvrir, ce qui est toujours à conseiller pour éviter la défor- 
mation des noyaux. Il faut souvent jusqu'à deux ou trois jours pour 
enlever jusqu'aux dernières traces de nucléine. Il faut se rappeler 
(toc. cit., p. 210) que ces expériences doivent être faites sur des cel- 
lules fraîches^ car à la suite du durcissement opéré par les agents 
ûxateurs la nucléine parait subir des modifications assez profondes; 
elle devient pour ainsi dire insoluble dans l'ammoniaque, la potasse, 
le phosphate de soude, etc. ; seul, l'acide chlorhydrique la gonfle et 
la dissout encore, quoique difficilement. 

La nucléine présente vis à- vis de Tiode, de l'acide nitrique (au 
moins à chaud) et du réactif de Millon , les réactions des matières 
protéiques. 

Nous venons de parler des dissolvants de la nucléine comme four- 
nissant une preuve de la vraie nature chimique des substances que 
Ton peut soupçonner être de la nucléine. Ces dissolvants ont une 
autre qualité précieuse. En enlevant totalement toute la nucléine d'un 
noyau, on arrive à pouvoir étudier à Taise la structure réticulée du 
caryoplasma, élément qui dans la plupart des noyaux se trouve 
caché par l'abondance de l'élément nucléinien. Dans ce but, il con- 
vient de faire agir les réactifs avec une grande lenteur. 

La digestion partielle peut rendre des services pour l'étude de 
l'élément nucléinien. Nous avons dit que la nucléine in situ dans les 
noyaux se laisse digérer en partie, à l'état frais. Mais elle résiste 
beaucoup plus longtemps que les albumines à l'action du liquide 
digestif ; une digestion modérée sert donc à mettre à nu l'élément 
nucléinien en le débarrassant des granulations caryoplasmiques qui 
en obscurcissent les contours, et sert de la même manière à éclaircir 
le corps cellulaire. 

Dans les ligues qu*oa vient de lire le terme < nucléine » a été employé 
comme synonyme de ce qu'on nomme aujourd'hui plus volontiers < chro- 
matine ». Il me semble que le terme < chromatine » est plus précis et pré- 
férable. En effet, on admet maintenant (Halliburton, Goulstonian Lectures 
on the Chemical Physiology of the Animal CelL, 1893, p. 574, surtout du 
compte rendu du British Médical Journ., n» 1681 , 18th March, 1893) qu'il 
existe non une seule nucléine, ma.is toute une série de c nucléines » différant 
entre elles surtout sous le rapport de leur richesse respective en phosphore 
et en substances protéiques. Elles forment une chaîne, dont le chaînon le 
plus élevé est représenté par lacide nucléique, contenant de 9 à U p. 100 
de phosphore et point de substance protéique (ce composé se trouve, dans 



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CHAPITRE XXV 



la nature, dans les tôles des zoospermes). Ensuite viennent les corps habi- 
tuellement dénommés < nucléines », consistant eu des substances pro- 
ie iqu es avec des proportions variables d'acide nucléique. A Textrémité 
inrerieure de la chaîne se trouvent les nucléines qui consistent presque 
entièrement de substances protéiques, avec seulement 0,5 à 1 p. 100 de 
phosphore. Ce sont les corps qu'on a appelés les « nucléo-albumines » ; on 
pourrait également les appeler les < plastines artificielles ». 

Tous ces corps ont été isolés des tissus les plus variés de l'organisme 
animal, et ont aussi été préparés artificiellement. Une série parallèle de 
nucléines existe dans le noyau lui-même. Il y a les nucléines les plus riches 
en acide nucléique; celles-ci sont très solubles dans les alcalis, et dirficiles 
à précipiter par les acides ; la chromaline en est une. Il y a les nucléines 
moins facilement solubles dans les alcalis et moins riches en acide nucléique; 
ce sont les plastines ; la pyrénine des nucléoles plasmatiques en est une. Et 
il y a des nucléines encore plus pauvres en acide nucléique ; ce sont les 
nucléo-albumines (qui existent également dans le cytoplasme ; — la para- 
lin i ne, ou suc nucléaire parait consister en partie de ces corps, en partie 
de composés entièrement privés de phosphore). Il parait douteux si la chro- 
maline est ou n'est pas de l'acide nucléique pur. Voici, d'après Halliburton, 
les réactions par lesquelles elle ressemble à l'acide nucléique : t l** elle ne 
donne pas la réaction de Millon, ni les réactions xantho -protéiques; 2<> elle 
e.^t facilement soluble dans les alcalis, difficilement dans les ctcides; 3^ elle 
est soluble dans le ferrocyanure de potassium dissous dans l'acide acétique; 
4^ après traitement pendant vingt-quatre heures par une solution concentrée 
de î^ulfate de cuivre elle perd son affinité pour les matières colorantes ; mais 
elle ne s'y dissout pas comme l'avait prétendu Schwarz; o<* elle a une grande 
ailiiiité pour les couleurs de la houille, surtout pour les couleurs basiques 
comme le vert de méthyle. En présence d'un mélange de vert de mélhyle 
cL de fuchsine acide, l'acide nucléique se colore en vert. Dans ce même 
mélange, les nucléines un peu moins riches en phosphore se colorent en 
un violet bleu, tandis que celles qui sont les plus pauvres en phosphore se 
colorent en rouge. Or, dans les noyaux qui se trouvent en cinèse, moment 
où il s'y trouve un maximum de chromatine, la chromatine se colore dans 
ce mélange en vert; tandis que dans les noyaux au repos, alors qu'il s'y 
trouve une plus grande proportion de pyrénine, la coloration est bleue. » 

Il résulterait de ces considérations que les nucléines, et par conséquent 
la chromatine des noyaux, seraient des corps basophiles ; et que les albu- 
mines, et par conséquent le cytoplasme en général, seraient acidophiles. 
Xoyei ce que nous avons dit à ce sujet au numéro 160. Eu tout cas, les 
considérations ci-dessus paraissent justifier l'emploi du mot « chromatine » 
pour l'élément du noyau qui se colore dans le vert de méthyle; le mot 
< rmcléine > ayant obtenu une signification plus étendue. 

\ consulter aussi sur ce sujet Kossel, dans Das Mikro&kop de Beiirens, 
Ko-sEL und ScHiEFFERDECKER, II, p. 47, et daus Vcrh, d. physioL Ges. 
liefiiïi, 21 oct. 1892 ; Malfatti, Ber. d. nalurw. med, Verevis in 
Innsùruck, 1891-2 ; Zaciiarlvs, Ber. d, deutschen botan. Ges., X, 1893, 
p. 188; Zeit. f. wiss. Mik. , X, 1, 1893, p. 80; Lilienfeld, Verh. d. 
phijs. Ces, Berlin, 1892-3, numéro ii \ Zeit. /*. wiss. Mik.,\, 1, 1893, 
p. so ; Zacharl\s, Ber.d. deulsch. bol. Ges.y XI, 1893, p. 293 ; Zeil. f. wiss. 
MiL, X, 3, 1893, p. 373. 



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MÉTHODES CYTOLOGIQUES 359 

Pour les réactions microchimiques du phosphore dans les éléments des 
tissus voyez Lilienfeld und Monti, dans Zeil. f. phys, Chemie, XVII, 1892, 
p. 410 (Zeit. f. tviss. 3/tA., IX, 3, 1893, p. 332) ; aussi dans le travail précité 
de Halliburton, p. 505. 

606. Fixations cytolog^iques. — Flemming, qui a fait une étude 
approfondie de Taclioa des divers agents fixateurs sur les différents 
éléments cellulaires, a publié le résultai de ses recherches dans dilTé- 
rents mémoires parus dans VArch. f. mik. Anat. (1879, 1880, 1881), 
et dans son ouvrage Ze/feuôs^anz, Kern undZelltheilung^ 1882. Nous 
lui empruntons en grande partie les faits que nous allons exposer. 

Les acides acétique, formique, chlorliydrique et nitrique en solu- 
tion très faible (1 p. 100 ou moins) sont de bons agents fixateurs 
des cellules. En suivant leur action sous le microscope, on voit appa- 
raître dans le protoplasma cellulaire et dans le noyau des détails 
très délicats, mais qui ne tardent pas à disparaître si Taction du 
réactif se prolonge. Si Ton n'arrête à temps l'action du réactif, il 
devient très difficile d'obtenir de bonnes préparations permanentes, 
parce que la fixation n*a pas été suffisante et que la cellule se 
laisse gonfier ou ratatiner par les réactifs auxquels on la soumet 
ultérieurement. Lorsqu'on se contente de faire des préparations 
extemporanées, et lorsqu'on se propose de déceler la présence de 
noyaux, soit dans un organisme inférieur soit dans des éléments 
cellulaires, une solution faible d'acide acétique colorée par le vert 
de méthyle rendra, comme nous l'avons dit plus d'une fois, les plus 
grands services ; son action est presque instantanée, les noyaux sont 
colorés en même temps que fixés. 

L'acide osmique en solution de 0,1 à 2 p. 100 fixe bien la forme 
de la cellule entière, mais il gonfie les noyaux et ratatine les nu- 
cléoles; quelquefois il rend de plus le c réliculum > nucléaire 
invisible, et empêche une bonne coloration ultérieure des éléments. 
Ce réactif est cependant précieux lorsqu'on veut fixer des éléments 
doués de mouvement, comme les cellules amiboïdes, parce qu'il les 
tue instantanément avec la forme qu'ils possèdent au moment où on 
le fait agir. 

Les solutions d'acide chromique de 0,1 à 0,5 p. 100 fixent bien 
les noyaux ; des solutions plus fortes les ratatinent, mais il est à 
remarquer qu'avec la même solution et les mêmes objets on n'obtient 
pas toujours un résultat identique, ce qui ne peut s'expliquer, d'après 
Flemming, que par un état physiologique difi'érent des tissus. L'acide 
chromique, comme Tacide osmique, ne permet pas d'obtenir une 
bonne coloration, et nous avons remarqué qu'il altérait souvent les 



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CHAPITRE XXV 



ûgures karyokînétiques. Cependant Tacide chromique donne de bons 
résultats pour les cellules des Vertébrés, lorsque son action n'est pas 
prolongée. 

Les sels de chrome, bichromate de potasse ou d'ammoniaque, 
font nettement apparaître un réseau dans le protoplasma cellulaire 
et dans le noyau ; mais ces sels altérant considérablement les ûgures 
karyokinétiques au point de les rendre le plus souvent méconnais- 
sables, on ne peut avoir grande confiance dans les résultats qu'ils 
donnent dans l'étude de la structure intime des cellules. Klein, 
[Quart. Jouim. of mie. Se, 1878-79) et Eimer {Arch. /*. mik. Anat., 
1871, 72, 75, 77) qui ont employé dans leurs recherches le chromate 
neutre d'ammoniaque, et le bichromate d'ammoniaque, ont décrit 
une structure compliquée de certaines cellules qui demanderait à être 
contrôlée à l'aide de réactifs plus fidèles. Nous nous rangeons entiè- 
rement à l'opinion de Flemming qui dit que c ceux qui cherchent à 
étudier la division cellulaire au moyen du bichromate de potasse et 
des autres sels de chrome font entièrement fausse route ». 

Le bichromate d'ammoniaque peut cependant donner de bons 
résultats dans certains cas ; c'est ainsi que Ranvier {Comptas rend, 
de VAc. des Se, 1879) a pu établir les connexions qui relient entre 
elles les cellules du corps muqueux de Malpighi sur des pièces durcies 
par ce sel de chrome. 

L'acide picrique, en solution concentrée ou diluée, est un bon 
agent de fixation ; il gonfle quelquefois légèrement le noyau, mais il 
conserve bien les figures karyokinétiques. Il vaut mieux employer 
des solutions fortes que des solutions faibles. Les sels picriques (de 
potasse, de soude ou de baryte) ne valent rien pour les études 
cytologiques. 

L'alcool exerce sur les cellules à peu près la même action que 
l'acide chromique, mais il ratatine plus souvent les noyaux. 

La solution d'acide nitrique d'Altmann, le liquide de Perenyi, le 
liquide de Kleinenberg, sont d'excellents fixateurs lorsqu'on veut 
simplement constater la présence de la cytodiérèse dans les tissus, 
mais ils conviennent moins bien pour l'étude spéciale de la division 
des noyaux. 

Le meilleur agent pour fixer, en général, les cellules, soit à l'état 
de repos, soit en voie de division, est, d'après Flemming, le mélange 
chromo-acéto-osmique. Si, dans ce liquide, on ne met pas d'acide 
chromique, on n'obtient pas de bons résultats. Si l'on supprime l'acide 
acétique (comme dans la formule de Max Flesch), les figures nu- 
cléaires apparaissent bien moins nettement. La présence de l'acide 



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MÉTHODES CYTOLOGIQUES 361 

acétique ou de Tacide formique dans les solutions osmiques favorise 
la précision de la coloration ultérieure par le picro-carmin, Théma- 
toxyline et le violet de gentiane. Mais les mélanges d'acide osmique 
et diacide acétique sans acide chromique (Eimer) ne donnent pas 
d'aussi bons résultats que le mélange chromo-acéto-osmique. Les 
mélanges d'acide picrique et d'acide osmique, ou d'acides picrique, 
osmique et acétique (acide picrique, 0,5 p. 100 ; acide osmique, 0,1 
p. 100, acide acétique, 0,1 p. 100) fixent presque aussi bien que les 
mélanges chromiques, mais la coloration subséquente est encore plus 
difficile à obtenir qu'après le traitement par un mélange acéto-osmique. 
Flemming conclut de ses recherches que l'action favorable de l'acide 
osmique dans tous ces mélanges doit être attribuée à la rapidité avec 
laquelle il tue les éléments, les autres acides ayant pour fonction de 
rendre nettement visible la structure de ces éléments. 

Les mélanges contenant de l'acide osmique doivent être employés 
toutes les fois qu'on désire fixer les figures chromatiques le plus 
fidèlement possible ; l'acide chromique pur s'emploiera quand il 
s'agira d'obtenir une coloration bien nette. 

Pour l'étude des figures achromatiques, Flemming recommande le 
mélange chromo-acétique n^ 4o. Pour l'étude des corpuscules polaires, 
il recommande les mélanges osmiques, ou l'acide chromique pur, 
avec coloration par le violet de gentiane. 

Nous admettons avec Flemming et avec la majorité des cytologistes 
que les mélanges chromo-acéto-osmiques sont en général les meil- 
leurs de tous les agents fixateurs des cellules. Mais le lecteur sait 
qu'il y a plusieurs mélanges chromo-acéto-osmiques (sans compter 
le mélange de Hermann). — Flemming lui-même en a indiqué deux, 
le mélange faible et le mélange fort. Le mélange fort avait été 
indiqué par Flemming en premier lieu à titre de réactif servant à 
différencier la chromatine cinétique de la chromatine au repos, et non 
comme réactif normal pour les travaux ordinaires. Laquelle de ces 
deux solutions doit être préférée pour les recherches cytologiques en 
général ? Je n'hésite pas à dire que, d'après mon expérience, c'est le 
mélange fort, et c'est bien là aussi Texpérience de la majorité des 
travailleurs. 

A côté du mélange de Flemming vient le mélange de IIermann, n° 71 . 
L'opinion que j'ai exprimée dans ce paragraphe n'est pas sans être 
partagée par plus d'un naturaliste. Voyez aussi Jà-dessus l'opinion 
de Flemming [Arch, f, mik, Anat., XXXVII, 1891, p. 685), qui trouve 
que ce réactif donne une démonstration particulièrement nette des 
éléments achromatiques, mais que les mélanges chromo-acéto-osmi- 



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362 



CHAPITRE XXV 



ques conservent mieux les éléments chromatiques. 11 me paraît certain 
que le mélange de Hermann durcit moins que celui de Flemming, ce 
qui sera un avantage ou non selon les cas (les pièces sont moins 
cassantes et se coupent mieux). En somme, il y a entre ces deux 
liquides de légères différences dont on pourra à l'occasion faire son 
prolil. 

Pour Tétude des éléments achromatiques il me semble qu*il y a 
souvent avantage à diminuer la proportion d'acide organique dans 
l'un et l'autre de ces liquides, surtout dans celui de Hermann. Pour 
celui-ci on peut certainement la diminuer de moitié sans inconvé- 
nient. 

Acide chromo- formique de ^Rabl, n^ 46. Chlorure platinique de 
Habl, no 70. 

Le Liquide de Perenyi donne quelquefois d'excellents résultats. 

Dans ces derniers temps, M. Heidenuain [Kern und Protoplasma, 
189i!, p. 113) s'est élevé contre l'emploi trop exclusif du mélange de 
Flcmming, et a préconisé l'emploi du sublimé corrosif (solution saturée 
à froid dans une solution aqueuse de chlorure de sodium à 0,5 p. 100). 
Cette solution aurait surtout l'avantage de pénétrer mieux que le 
liquide de Flemming. D'après mon expérience, cela est exact ; et il est 
exaot aussi que le sublimé (je parle des solutions acides) donne sou- 
vent une fixation sensiblement aussi bonne sous le rapport de la 
conservation des formes. Mais il faut se rappeler qu'avec du matériel 
ainsi préparé on ne peut pas obtenir avec la safranine, le violet de 
gentiane, etc., les délicates différenciations que donnent ces couleurs 
après fixation par le mélange de Flemming. 

Il va sans dire que d'autres fixateurs que ceux-ci trouvent bien 
leur emploi dans certains cas. Ainsi pour les œufs de VAscaris, Tal- 
cool acétique de Carnoy, ou son mélange au chloroforme, etc. 

607. Colorants de la chromatine. — Nous avons déjà parlé, 
numéro 604, de la coloration de la chromatine à l'état frais ou légè- 
rement fixée. Nous avons ici à mentionner les colorants appropriés 
p*)ur les pièces dûment fixées par les liquides recommandés dans le 
nuim^ro précédent. 

Nous avons, pour les pièces fixées aux mélanges chromiques, la 
mfranine, le violet de gentiane ou le bleu Victoria, le hémalun, 
el d'autres encore. Ces couleurs donnant de bons résultats, il parait 
inutile d'en augmenter la liste. Au point de vue de la précision de 
la coloration, le carmalun est à citer ici. Pour le matériel fixé au 
îiubliiné, etc., c'est certainement un excellent réactif. Mais pour le 



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METHODES CYTOLOGIQUES 



363 



matériel chromique je dois dire que je le trouve trop peu énergique. 
Le ve)H de méthyle n'est pas très recommandable pour les pièces 
destinées à être montées au baume, parce qu'il n'a pas une puissance 
de résistance sufBsante à Talcool de déshydratation. Il n'en possède 
pas davantage dans la combinaison Ehrlich-Biondi, combinaison qui, 
dans mon opinion, ne devrait être employée que dans certains cas 
très spéciaux. 

La Thionine a été recommandée (par M. Heidenuain) comme don- 
nant des colorations supérieures à celles de la safranine. L'auteur 
n'explique pas en quoi consiste celte supériorité. Et comme la thionine 
se trouve difficilement dans le commerce, il paraît inutile de s'en 
occuper. 

608. Colorants plasmatiques. — Il n'en existe pas un seul de 
vraiment bon. Tous sont d'une éleclivité imparfaite, en ce que leur 
action ne se laisse pas limiter avec la précision et la certitude dési- 
rable à l'élément qu'on veut mettre en relief. Presque tous, par 
exemple, colorent l'enchylème plasmatique en même temps que le 
réticulum plastinien. El, d'un autre côté, il y a des éléments impor- 
tants de la cellule qui échappent en grande partie à l'action des colo- 
rants. Nous arrivons à colorer les fuseaux, il est vrai, mais à peine ; 
il a été impossible jusqu'ici de donner à ces éléments une coloration 
vraiment vigoureuse. 

Le moins mauvais des colorants plasmatiques que je connaisse est 
le Kemschwarz. Voyez numéro 155. 

Je crois qu'après le Kemschwarz le procédé qui m'a donné les 
meilleures images d'éléments plasmatiques est celui de Rawitz, nu- 
méro 171 ter. Puis le Procédé à V orange de FlemminÇy numéro 240. 
Je le recommanderais surtout dans la modification élaborée par 
Reinke. 

Le procédé safranine- Lichtgr un de Benda, numéro 245, donne 
souvent de beaux résultats. Mais il est évident qu'avec un procédé dans 
lequel la diflerenciation et la deuxième coloration ne durent ensemble 
que quelques secondes, les résultats doivent être assez aléatoires. 

Quelques auteurs (M. Heidenhain, et d'autres) louent beaucoup la 
fuchsine acide (n^ 189). Je lui reproche de donner des images plates, 
manquant de relief. Je lui préférerais souvent Vorange G. 

Le mélange Eiirucu-Biondi-Heindenuain a été discuté aux numé- 
ros 251 et 232. 

La méthode au permanganate de Henneguy a été donnée au 
numéro 171. 



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3C4 CHAPITRE XXV 

Les deux méthodes à l'hématoxyline de Benda, numéros 146 bis et 
146 ^57% peuvent rendre des services. 

La méthode à Valun de fer de M. Heidendain, numéro 145, est 
très recommandable. 

La méthode à Vacide osmique et au pyrogallol a été discutée au 
numéro 226. C'est uue méthode de deuxième ordre et non de premier 
ordre. 

Le carmin ferrique de Zacuarias, numéro 110 his^ m'a donné des 
résultats excellents sous quelques rapports : mais la coloration est 
toujours un peu faible. 

Pour le » Nebenkern » des spermatocytes, je recommande Vhéma' 
toxyline à Valmi de fer de M. IlEmENHAiN, la safranine-Lichigrûn 
de Benda, et le procédé acide osmique et pyrogallol: Tous ces réac- 
tifs colorent ce corps d'une façon intense. Je recommande aussi le 
Kernschwarz qui donne des images excellentes, mais plus pâles ; ou le 
procédé Rawilz. Pour les vestiges de fuseaux en régression, soit 
corps de Platner et « Zellkoppel » de Zimmermann (des spermalocytes 
des Pulmonés) je recommande toujours le Kernschwarz {La Cellule, 
XI, 1, 1893, p. 31), ou bien le procédé de Rawitz. 

Voici le procédé recommandé par Hermann {Arch. f, mik. Anal,, 
XXXVII, 4, 1891, p. 583) pour l'étude de V « Archoplasma » des sper- 
malocytes de Proteus. — » Les pièces sont colorées en masse à l'obs- 
curité durant douze à treize heures dans une teinture composée de : 
hématoxyline, 1 ; alcool absolu, 70 ; eau, 30. Elles sont traitées durant 
un temps pareil par des alcools successifs, à l'obscurité, puis enrobées 
et coupées et les coupes sont collées sur porte-objets. 

On les traite maintenant par une solution très faible (rose clair) de 
permanganate de potasse, jusqu'à ce que leur couleur passe du noir 
opaque à une teinte d'ocre. La marche de cette diiTérenciation doit 
être contrôlée au microscope. On rince à leau et l'on traite par le 
liquide de Pal (acide oxalique, 1 ; sulfite de potassium (K*SO'), 1 ; eau, 
200) allongé de 5 à 10 volumes d'eau, jusqu'à disparition de la cou- 
leur brune. Enfin on colore pendant trois à cinq minutes, pas plus, 
dans la safranine. Les préparations doivent montrer seuls les c gra- 
nules de l'archoplasma » colorés par l'hématoxyline, le reste du pro- 
toplasma incolore, la chromatine rouge. 

Noyau vitellin (cellule embryog^ène). Méthode de Balbiani. 
[Zool. Anzeiger, VI, 1883, p. 659). — La vésicule embryogéne se 
voit à l'état frais sans aucun réactif dans l'œuf de certains animaux, 
entre autres un grand nombre d'Arachnides et de Myriapodes. Pour 



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MÉTHODES CYTOLOGIQUES 365 

la faire apparaître plus nettement, on fait agir directement sur Tœuf, 
sous le champ du microscope, un mélange à parties égales d'acide 
acétique et d'acide osmique à 1 p. 100, auquel on ajoute une petite 
quantité de sel marin. Ce mélange rend les œufs moins granuleux 
queTacide acétique dilué employé seul. 
Pour les coupes, méthode au permanganate de Henneguy. 

609. Granules ou « Bioblastes > d'ÀLTMANN. Pour la démonstration 
de ces objets, dont lanature parait être assez problématique, voyez Altmann, 
Studien ûber die Zelle, 1886 ; Die Elementarorganismen, Leipzig, 1890 ; et 
un mémoire dans Arch. /*. Anal. w. Enlwick., 1892, p. 223 ; aussi Zeit. f. 
wis8, MiLy VII, 2, 1890, p. 199, et IX, 3, 1893, p. 331 ; puis L. et R. 
ZOJA, Mem. R, Isl. Lombardo.XW, 3, VII, p. 237; Fischer, Anal. Anz,, IX, 
4894, numér